一種漢灘病毒和漢城病毒雙重實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

劉師文，熊 英，施 勇，李健雄，王 倩，龔 甜

漢坦病毒(hantavirus， HV)是世界范圍內分布的對人類有嚴重不良影響的人獸共患病原體[1]，其基因組由大(L)、中(M)、小(S) 3個分段的負義單鏈RNA組成。根據基因結構特點，已從動物和人類中發現的HV可分為50 多種基因型[2]，它們在自然宿主中不引起癥狀性感染，但是在人類中經常引起兩類急性發作傳染病，即腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和漢坦病毒肺綜合征。據統計這兩類疾病病死率分別可達15%和50%[3]。研究發現，HV感染嚴重程度與病毒型別、病毒RNA載量有關[4-5]。 中國是世界上HFRS疫情最嚴重國家，年報告病例數最高達到全世界90%，全國31 個省市自治區均有病例報告[6]。在我國，最主要流行的HV 為HTNV和SEOV。早診斷、早治療對控制HFRS病死率非常關鍵。因此，建立HTNV 和SEOV雙重實時熒光定量檢測方法對病毒進行快速、準確、分型、定量檢測，對指導HFRS臨床救治、降低病死率有重要意義。目前HFRS病原熒光定量Realtime-PCR檢測方法都存在一定的局限性。本研究在前期HV病毒分離、全基因組測序及構建的HTNV和SEOV 株S基因重組質粒菌株的基礎上[7-8]，以純化的重組質粒作為定量標準品，選擇漢坦病毒的S基因為目的基因設計引物探針，建立可以快速對HTNV和SEOV進行分型和定量檢測的雙重實時熒光定量RT-PCR方法為HFRS早期診斷、疾病防控提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 菌、毒株及樣品 pGEM?-T-SEOV和pGEM?-T-HTNV重組質粒DH5a菌株菌株為本實驗室保存，分別以AYW89-15株(HTNV)和JiangxiXinjianRn-07-2011(SEOV)全S基因構建的重組菌株。血清樣本為2017年HFRS 監測項目收集并于-80 ℃保存。

1.2 主要設備和試劑 熒光定量PCR儀(ABI7500型)，超微量蛋白核酸分析儀(BioDrop)，AgPath-ID TMOne-step RT-PCR Kit(Thermo fisher Scientific)、質粒純化試劑盒(TAKARA)巢式RT-PCR反應液 :PrimScriptTMOne Step rt-pcr Kit Ver.2(TAKARA)、GoTaq?Green Master Mix (Promega)。

1.3 引物設計與合成 從GenBank 下載HTNV 和SEOV 全S基因參考序列，分別與AYW89-15株，JiangxiXinjianRn-07-2011株基因比對選定相對保守區域、應用CLC軟件設計Taqman熒光引物探針，由上海生物工程有限公司合成。引物探針序列見表1。

表1 HTNV和SEOV S基因引物探針序列Tab.1 Primer and probe sequences of the HTNV and SEOV S gene

1.4.1 重組質粒標準品制備 采用質粒純化試劑盒提取pGEM?-T-SEOV和pGEM?-T-HTNV重組菌株的質粒， 通過BioDrop超微量蛋白核酸分析儀測得重組質粒濃度，然后根據阿伏伽德羅常數計算其拷貝數。

1.4.2 引物探針濃度及退火溫度的優化 以1.0×104copies/μL陽性質粒為模板。體系總體積25 μL，其中RT-PCR buffer 12.5 μL；Enzyme Mix 1 μL，引物探針終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol/L，其余用ddH2O補足；通過比較Ct值、擴增曲線和ΔRn值確定引物和探針終濃度。確定引物探針濃度，選擇不同的延伸溫度50 ℃、55 ℃、60 ℃進行測試、通過比較Ct值、擴增曲線和ΔRn值確定延伸溫度。

1.4.3 標準曲線建立 將陽性質粒從107→10-1copies/μL的10倍系列稀釋物作為模板，設陰性對照，按照優化后的PCR反應體系進行熒光RT-PCR檢測。由熒光PCR檢測軟件繪制標準曲線，確定最低檢出限。

1.4.4 重復性實驗 選取102、103、104copies/μL的陽性質粒用建立的方法進行檢測，每個濃度平行做3管，計算每個濃度Ct值的批內變異系數。每個濃度標準品分別進行3次重復試驗，計算每個濃度Ct值的批間變異系數。

1.4.5 特異性實驗 以本實驗室保存的甲型流感病毒、登革熱病毒、新布尼亞病毒、寨卡病毒、新冠病毒陽性核酸為模板，同時設陽性對照(陽性質粒104copies/μL)和陰性對照，進行檢測，驗證所建立方法的特異性。

1.5 血清樣本檢測 選取10份2017年江西省HFRS急性期血清樣本(樣本編號：JXhu04-17、JXhu10-17、JXhu14-17、JXhu27-17、JXhu11-17、JXhu33-17、JXhu39-17、JXhu46-17、 JXhu47-17、JXhu51-17)，進行核酸提取，用建立方法和巢式RT-PCR方法進行檢測分型，分析所建立方法對臨床樣本的適用性。HV M基因巢式RT-PCR分型方法參照《腎綜合征出血熱監測方案(試行)》，第一次RT-PCR采用HV通用外引物，引物序列為HVF: 5′-AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG-3′，HVR: 5′-GTACAICCTGTRCCIACCCC-3′，反應條件： 50 ℃ 30 min; 94 ℃ 2 min;(94 ℃ 30 s、52 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min)35循環；72 ℃，10 min。第一次RT-PCR結束后以擴增產物為模板，分別采用HTNV/SEOV分型引物進行二次PCR，HTNV分型引物序列HTNVF: 5′-GAATC-GATACTGTGGGCTGCAAGTGC-3′， HTNVR: 5′-GGATTAGAACCCCAGCTCGTCT-3′,目的產物382 bp。SEOV分型引物序列SEOVF: 5′GTGGACTCTTCTTCTCATTATT-3′， SEOVR: 5′T-GGGCAATCTGGGGGGTTGCATG-3′，目的產物 417 bp。二次PCR條件：95 ℃，4 min;(94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s)35循環；72 ℃，10 min。通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳結果判斷樣品病毒基因型。

2 結 果

2.1 重組質粒標準品制備 經BioDrop超微量蛋白核酸分析儀測得HTNV 和SEOV重組質粒標準品濃度分別為140.4 μg/mL、120.2 μg/mL，換算成拷貝數分別為2.72×1010copies/μL，2.28×1010copies/μL。

2.2 引物探針濃度及退火溫度的優化 根據Ct值最低、ΔRn值最高的原則確定體系引物探針終濃度均為0.5 μmol/L，延伸溫度為55 ℃。優化后反應體系： RT-PCR buffer 12.5 μL；Enzyme Mix 1 μL，HTNV和SEOV引物探針各0.5 μL(共3 μL)，ddH2O 3.5 μL，模板5 μL。PCR反應條件：45 ℃ 10 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s(采集熒光)，45個循環。

2.3 標準曲線建立 HTNV和SEOV重組質粒標準品擴增曲線見圖1，隨著核酸濃度的降低呈現明顯的下降的熒光信號，9個濃度(107→10-1copies/μL)標準品中，HTNV 和SEOV均有7個(107→10 copies/μL)濃度出現擴增曲線。HTNV 和SEOV檢測標準曲線見圖2和圖3。方程式分別為Y(Ct)=-3.985X(對數值)+41.982，(HTNV擴增效率：95.4，相關系數R2為0.998)；Y(Ct)=-4.291X(對數值)+43.03, (SEOV擴增效率：92.1，相關系數R2為0.999)。HTNV 和SEOV最低檢出限均為10 copies/μL。

在描述學校的校園氛圍時，使用頻率最多的為歡快的交響曲（29.51%）、文化盛宴（24.36%），認為學校的校園氛圍很快樂和溫馨、文化氣息濃厚。而選一潭死水（21.78%）、枯藤朽木（24.36%）的學生認為學校的校園氛圍整體不好，缺乏活力。

圖1 HTNV 和SEOV重組質粒標準品(107→10-1 copies/μL)擴增曲線Fig.1 Amplification curves of nine 1∶10 dilutions ranging from 107 copies/μL to 10-1 copies/μL of recombined plasmid

圖2 HTNV和SEOV陽性質粒(107→10 copies/μL)標準曲線圖Fig.2 Standard curves for HTNV and SEOV were constructed with seven 1∶10 dilutions ranging from 107 copies to 101 copies of recombined plasmid

2.4 重復性實驗 不同濃度陽性質粒的Ct平均值和批內變異系數見表2，不同濃度各做3管，每個濃度Ct值的批內變異系數小于2%。每個濃度進行3次重復試驗，計算每個濃度Ct值的批間變異系數，結果見表3, 批間差異小于2%。

表2 不同濃度陽性質粒批內Ct平均值和變異系數Tab.2 Ct variations of three 1∶10 dilutions ranging from 102 copies to 104 copies/μL in the same assay

表3 不同濃度陽性質粒批間Ct平均值和變異系數Tab.3 Ct variations of three 1∶10 dilutions ranging from 102 copies to 104 copies/μL in different assays

2.5 特異性實驗 以甲型流感病毒、登革熱病毒、新布尼亞病毒、寨卡病毒、新冠病毒陽性核酸為模板，同時設陽性對照(陽性質粒)和陰性對照進行熒光定量RT-PCR測定方法的特異性，結果見圖3，由圖可見除SEOV和HTNV陽性對照外,其他5種病毒均無非特異性擴增。

圖3 HTNV和SEOV雙重實時熒光定量RT-PCR特異性實驗Fig.3 Specificity of HTNV and SEOV duplexes in real-time quantitative RT-PCR

2.6 血清樣本檢測 10份血清標本經雙重實時熒光RT-PCR檢測，擴增曲線圖見圖4，其中陽性對照出現擴增曲線，陰性對照未出現擴增曲線， 9份為HTNV型(圖4-B)， 1份為SEOV型(圖4-C，JXhu11-17)。巢式RT-PCR電泳結果見圖5，除JXhu11-17為SEOV ，其余9份均為HTNV。2種方法檢測結果一致。

圖4 10份腎綜合征出血熱病例血清樣本雙重實時熒光RT-PCR擴增曲線圖Fig.4 Amplification curves of 10 serum samples of HFRS patients by duplex real-time RT-PCR assay

泳道1、12為DL2000Maker，泳道2-11依次為JXhu04-17、JXhu10-17、JXhu14-17、JXhu27-17、JXhu11-17、JXhu33-17、JXhu39-17、JXhu46-17、 JXhu47-17、JXhu51-17，HTNV分型引物PCR的產物，泳道13-22依次為上述10個樣品SEOV分型引物PCR的產物圖5 10份HFRS血清樣本巢式RT-PCR產物電泳圖Fig.5 Electrophoresis of nested RT-PCR products of 10 HFRS serum samples

3 討 論

HFRS病情復雜，臨床表現多樣，漏診率及誤診率高[9]。疾病早期有效的診斷方法對HFRS患者早發現、早治療，降低病死率，減輕疾病負擔起到非常重要的作用。目前HFRS早期診斷主要包括血清學檢測和基因檢測2個方面。血清學檢測常用的方法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，免疫層析試紙條等，主要是檢測HV特異性IgM和IgG。血清學檢測有快速、簡便的優點，因抗體易在病毒亞型之間產生交叉反應，不能用于病毒的分型，而且血清學檢測存在窗口期。基因檢測主要采用RT-PCR[10],大多數HV RT-PCR均采用巢式PCR方法[11]，克服了普通RT-PCR靈敏度低的特點，但是檢測時間長，操作步驟多也增加了污染的風險[12]。熒光定量Realtime-PCR具有快速、靈敏、特異性高且污染小、可實時定量并易于標準化的特點已經成為病毒分子診斷中最常用的技術[13]。

目前市場上HFRS漢坦病毒雙重熒光PCR試劑非常少且價格昂貴，文獻報道的熒光定量Realtime-PCR檢測方法都存在一定的局限性。楊鵬飛 等[14]建立了漢坦病毒通用型實時熒光定量RT-PCR 方法，該方法采用一對引物一條探針可實現對5種不同基因型別漢坦病毒進行檢測，廣譜性好，但是該方法不能實現病毒的分型檢測；何芳等[15]報道新型實時熒光定量RT-PCR方法，靈敏度高、對HTNV 的最低檢出限為4.08 copies/μL，該方法僅能檢測HTNV，不適合HTNV和SEOV混合疫區使用；胡丹等[16]建立的漢坦病毒實時熒光定量PCR方法，能分型檢測，HTNV和SEOV最低檢測限為10 copies/μL，但是不能實現同一反應管HTNV和SEOV雙重靶標檢測，不能有效的節約試劑成本，也未見臨床樣本的應用情況。

本研究根據HV S基因設計引物探針，建立HTNV和SEOV雙重實時熒光定量RT-PCR檢測方法，對2種型別病毒的最低定量限均為10 copies/μL, 靈敏度高；不同濃度質粒標準品Ct批內和批間差異均小于2%，重復性好；與甲型流感病毒、登革熱病毒、新布尼亞病毒、寨卡病毒、新冠病毒均無交叉反應，特異性強；對10份血清樣本進行檢測，結果與巢式RT-PCR一致，說明建立的方法適用于臨床腎綜合征出血熱HTNV和SEOV的檢測。本方法的試劑成本僅為商品化的雙重熒光RT-PCR試劑盒的1/5左右，檢測成本低廉，適用于大規模檢測。

綜上，本研究建立的雙重熒光定量RT-PCR方法可以快速準確地對HTNV和SEOV進行分型和定量檢測，適用于腎綜合征出血熱臨床早期診斷。

利益沖突：無