高分辨率熔解曲線法檢測飲用水中兩種假單胞菌

岳 苑，周夢詩，徐 娟，李 睿，何利華，趙 飛，張建中，龔 杰

假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)，專性需氧的革蘭陰性無芽胞、有莢膜桿菌，呈桿狀或略彎。大多數(shù)菌的適溫為30℃，存在于土壤、淡水、海水中。假單胞菌屬中研究最多的是銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[1]，是傷口感染較常見的一種細(xì)菌，能引起化膿性病變。膿汁呈綠色，故又稱膿桿菌。廣泛分布于自然界(泥土、水、空氣和植物)及正常人皮膚、腸道和呼吸道，是臨床上較常見的條件致病菌之一[2]，且對消毒劑、紫外線、干燥等條件具有很強(qiáng)的抵抗力[3]，尤其是在免疫系統(tǒng)受損的患者中[4]，能夠引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病[5]。

現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn) GB 19298-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》[6]和GB 8537-2018 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水》[7]都對銅綠假單胞菌有限制要求，說明桶裝飲用水被該菌污染后，可能危害消費者的健康[5,8-9]。近年來，銅綠假單胞菌引起的食物中毒的事件時有發(fā)生，給消費者帶來了食品安全隱患[10]。

國家標(biāo)準(zhǔn)中分離銅綠假單胞菌的方法為傳統(tǒng)的生化鑒定方法，鑒定耗時長(7 d左右)、操作步驟繁雜，而且惡臭假單胞菌的菌落形態(tài)與部分非藍(lán)綠色銅綠假單胞菌極其相似，難以分辨。除生化鑒定方法外，還有普通PCR法[11-12]和Real-time PCR法[13-14]。普通PCR法比較費時，而Real-time PCR法探針成本較高。高分辨率熔解曲線(High Resolution Melting，HRM)是一種新型基因分型技術(shù)，原理在于DNA序列的差異使得熔解溫度不同，最終形成不同形態(tài)的熔解曲線。該技術(shù)通常與實時熒光PCR相結(jié)合，能夠?qū)崟r監(jiān)測溫度上升時雙鏈DNA的解鏈過程[15]。HRM技術(shù)無需熒光標(biāo)記探針，不受突變位點的影響，具有高靈敏度、高通量、操作簡單、成本低等諸多優(yōu)點，目前已在細(xì)菌[15-17]、真菌[18-19]、病毒[20-21]、寄生蟲[22]的檢測等方面顯示較強(qiáng)的鑒別能力和優(yōu)勢，并將在其他領(lǐng)域發(fā)揮更廣泛的作用。本文基于高分辨率熔解曲線的方法，采用一對引物同時鑒別銅綠假單胞菌 (P.aeruginosa)和惡臭假單胞菌 (P.putida)，用于包裝飲用水的日常檢測中。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與樣品 銅綠假單胞菌ATCC27853、銅綠假單胞菌CMCC10104、惡臭假單胞菌CICC20544、腸炎沙門菌CICC21482、單增李斯特菌ATCC19115、阪崎腸桿菌CICC21544、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希氏菌ATCC25922由寧夏回族自治區(qū)食品檢測研究院提供。奇異變形桿菌、空腸彎曲菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、副溶血性弧菌、白色念珠菌、克柔念珠菌臨床分離株由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所診斷室提供。

樣品購自寧夏銀川市興慶區(qū)和金鳳區(qū)的6家超市，包括桶裝飲用水和礦泉水樣本共64份。

1.1.2 主要儀器和試劑 ABI QuantStudio 6 flex熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)；高速離心機(jī)(Thermo Fisher)；梯度PCR儀(Sensoquest)；Premix Ex Taq(Takara)；Evagreen(Biotium)；細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒(TIANGEN)；質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN)；營養(yǎng)瓊脂(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；布氏肉湯(Oxoid)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(廣東環(huán)凱生物科技有限公司)；CN瓊脂(廣東環(huán)凱生物科技有限公司)；引物探針由生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 設(shè)計引物 本文研究了銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌的基因組序列，在16S rDNA序列中尋找差異性靶序列。序列比對使用 Lasergene SeqMan 軟件，設(shè)計引物使用Primer Express 3.0軟件。實驗過程先經(jīng)過梯度PCR，篩選出能擴(kuò)增的引物同時確定退火溫度。以目標(biāo)菌和非假單胞菌為模板擴(kuò)增，選擇即無非特異性產(chǎn)物又能夠同時鑒別2種目標(biāo)菌的引物。PCR產(chǎn)物長度為104 bp(圖1)。

F： 5′-CTTGCCTTGGATTCAGCG-3′

R: 5′-CTCAGGACGTATGCGGTATT-3′

圖1 假單胞菌16S rDNA序列Fig.1 16S rDNA sequence of Pseudomonas spp.

1.2.2 DNA提取 銅綠假單胞菌ATCC27853、銅綠假單胞菌CMCC10104、惡臭假單胞菌CICC20544、腸炎沙門菌CICC21482、單增李斯特菌ATCC19115、阪崎腸桿菌CICC21544、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希氏菌ATCC25922、奇異變形桿菌、空腸彎曲菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌接種于營養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)24 h。空腸彎曲菌接種于布氏肉湯，42 ℃培養(yǎng)24 h。 白色念珠菌和克柔念珠菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂，28 ℃培養(yǎng)72 h。按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.2.3 建立反應(yīng)體系 反應(yīng)體系為30 μL：2Mix Taqman PCR Master 15 μL、上下游引物各1 μL(10 μmol/L)、Rox Reference DyeⅡ(100×)0.3 μL、Evagreen 20×in Water 1.5 μL、DNA模板2 μL(10～100 ng/μL)，ddH2O 9.2 μL。

反應(yīng)程序：95 ℃10 min；95 ℃15 s，68 ℃40 s, 擴(kuò)增40個循環(huán)。熔解程序：95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。所有程序的升降溫速度控制在1.6 ℃/s。

1.2.4 特異性試驗 在1.2.3的基礎(chǔ)上，以2種假單胞菌和其它非目標(biāo)菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.5 靈敏度試驗 制備兩種目標(biāo)菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行基因拷貝數(shù)的測定。將質(zhì)粒按1.2.2的方法培養(yǎng)后，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取DNA。用上述的反應(yīng)條件與反應(yīng)體系進(jìn)行靈敏度試驗。

1.2.6 檢測樣本 購自銀川地區(qū)的桶裝飲用水和礦泉水樣本共64個，按照GB 8538-2016和GB 19298-2014中針對銅綠假單胞菌的檢驗方法，在無菌條件下將250 mL水樣用孔徑0.45 μm的濾膜過濾，將濾膜移至CN瓊脂上，于36 ℃培養(yǎng)48 h。將濾膜上的菌苔刮下用DNA提取試劑盒提取DNA，進(jìn)行HRM-Real time PCR擴(kuò)增，同時使用國標(biāo)方法進(jìn)行鑒定，將2種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比對。

A 熔解曲線圖

B HRM熔解峰值圖

2 結(jié) 果

2.1 特異性試驗 本方法在單核苷酸熔解的同時檢測熒光強(qiáng)度。判斷依據(jù)是不同Tm值的熔解峰代表不同的假單胞菌，其中Tm值在83 ℃～84 ℃出現(xiàn)熔解峰為惡臭假單胞菌 (Pseudomonasputida)；Tm值在84 ℃～85 ℃出現(xiàn)熔解峰為銅綠假單胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)。其他12種非目標(biāo)菌無交叉反應(yīng)。見圖2。

2.2 靈敏度試驗 如圖3所示，銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌的檢測低限分別為41個拷貝數(shù)和48個拷貝數(shù)。

2.3 檢測樣本 桶裝飲用水和礦泉水樣本共64份，按照GB 8538-2016和GB 19298-2014中針對銅綠假單胞菌的檢驗方法過濾培養(yǎng)后，分別采用HRM-Real time法和國標(biāo)方法同時進(jìn)行檢測。2種方法檢測陽性的結(jié)果用16S rDNA擴(kuò)增后測序，經(jīng)過 BLAST 比對，選取相似性最高的菌種 16S rDNA 序列，采用最大似然法(MiximumLikelihood) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對陽性結(jié)果進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示：在64份樣本中，用HRM-Real time法檢測到銅綠假單胞菌6份、檢測到同時含有銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌3份、檢測到惡臭假單胞菌2份。國標(biāo)方法檢測到銅綠假單胞菌6份(見表1、圖4)。

注：由左至右曲線的濃度依次為：4.1×107拷貝數(shù)、4.1×106拷貝數(shù)、4.1×105拷貝數(shù)、4.1×104拷貝數(shù)、4.1×103拷貝數(shù)、4.1×102拷貝數(shù)、4.1×101拷貝數(shù)A 銅綠假單胞菌靈敏度試驗

注：由左至右曲線的濃度依次為：4.8×107拷貝數(shù)、4.8×106拷貝數(shù)、4.8×105拷貝數(shù)、4.8×104拷貝數(shù)、4.8×103拷貝數(shù)、4.8×102拷貝數(shù)、4.8×101拷貝數(shù)B 惡臭假單胞菌靈敏度試驗

表1 樣本檢測結(jié)果Tab.1 Samples test results

注：標(biāo)號NSJ為本研究鑒定的菌株圖4 陽性樣品16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of 16S rDNA positive samples

3 討 論

高分辨率熔解曲線分析技術(shù)是近年來國際上最新興起的核酸研究新手段，其核心在于飽和DNA熒光染料的出現(xiàn)。與傳統(tǒng)的基于熔融曲線分析的PCR方法相比，HRM不需要昂貴的熒光標(biāo)記探針，使用閉合管PCR方法，可同時擴(kuò)增和分析大量樣本，無需進(jìn)一步的人工分離步驟，也無需PCR后的手工分析。這有利于避免在凝膠過程中存在誤差，縮短分析時間。

本研究采用高分辨熔解曲線分析技術(shù)，由于目的基因序列的差異能夠使得雙鏈DNA的Tm值發(fā)生變化，導(dǎo)致在升溫過程中雙鏈DNA解鏈時間不同，從而形成不同的熔解曲線。基于這一原理，我們研究了銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌的基因組序列，在16S rDNA序列中尋找差異性靶序列，通過精心設(shè)計，從24對引物中篩選出一對特異性引物。從圖1可以看出，雖然這2種菌16S rDNA的擴(kuò)增序列只有7個堿基的差異，但是利用HRM技術(shù)依然能夠特異地鑒別上述2種目標(biāo)菌。

本研究的初衷在于在包裝飲用水和礦泉水的日常檢測中發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌極少單獨存在，一般與惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌等一同存在于飲用水中，這就給銅綠假單胞菌的分離鑒定工作帶來一定困難，尤其是非藍(lán)綠色產(chǎn)熒光的銅綠假單胞菌，在菌落形態(tài)上與惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌難以分辨，增加了分離的難度。本文檢測的64份樣本中6份樣本檢出銅綠假單胞(藍(lán)綠色菌落)，2份樣本檢出惡臭假單胞(淡黃色菌落)，3份樣本同時檢出銅綠假單胞和惡臭假單胞菌(均為淡黃色菌落)。使用國標(biāo)方法檢測有6個樣本測出銅綠假單胞菌，結(jié)果與HRM-Real time PCR法的結(jié)果一致。由于國標(biāo)方法只針對銅綠假單胞菌，所以無法對2種檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，但從檢測結(jié)果可以看出HRM-Real time PCR法的優(yōu)勢。另外，在使用國標(biāo)方法檢測時，個別樣本非目標(biāo)菌的含量較多，過濾后的濾膜在培養(yǎng)24 h后，非目標(biāo)菌蔓延嚴(yán)重，無法分離出單個菌株進(jìn)行鑒定，給目標(biāo)菌的分離帶來困難。這類樣本的分離有賴于檢測人員的經(jīng)驗和技術(shù)，結(jié)果的準(zhǔn)確性很難保證。本研究目前只能用一對引物區(qū)分銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌，對于鑒別熒光假單胞菌還需要進(jìn)一步的研究。

總之，HRM-Real time PCR法所花費的時間和實驗過程的繁瑣程度遠(yuǎn)低于國標(biāo)方法，而且結(jié)果準(zhǔn)確可靠，說明本研究建立的利用HRM-Real time PCR技術(shù)檢測2種假單胞菌的方法快速高效，成本低，適用于包裝飲用水和礦泉水的日常監(jiān)測和監(jiān)管。

利益沖突：無