結核分枝桿菌Rv3621c原核表達及免疫功能研究

毛莉蓉，許禮發，王曉春，張 健

結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引發的重大呼吸道傳染病，其病程長、傳染性強、易遷延不愈。2018年世界衛生組織(WHO)估算全球TB新發病例數和死亡病例數約為1 000萬和124萬。再加上耐藥性TB的急劇增加，TB的全球控制面臨嚴重威脅。

盡管卡介苗(Bacille Calmette-Guerin,BCG)可有效預防嬰幼兒TB，但其免疫保護期短、保護水平參差不齊且效價逐年下降，經10～20年后降至保護力不顯著[1-2]，且WHO不推薦重復接種。因此篩選并檢測M.tb基因組中具有免疫保護性潛力的特定基因，已成為TB疫苗研究策略的重要方向。多方研究發現，RD區抗原有助于維持TB感染時的免疫自穩狀態，可一定程度加強BCG的免疫效力[3]。本課題構建M.tb感染分泌期表達的RD9區抗原Rv3621c并進行純化，通過人群外周血試驗和小鼠試驗檢測rRv3621c的特異性和免疫原性，旨在篩選可做BCG初免的增強疫苗的靶抗原。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和倫理聲明 SPF級C57BL/6雌性小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司[動物合格證號：SCXK(京)2014-0004]，6～8周齡，體重12～20 g。動物飼養與試驗流程嚴格遵循《實驗動物管理條例》，所有動物實驗經安徽理工大學醫學院動物倫理與試驗委員會批準后進行。

1.2 菌株和主要實驗材料M.tbH37Rv滅活毒株由山西長治醫學院附屬和平醫院檢驗科惠贈；E.coliDH5α、BL21(DE3)株購自上海昂羽生物科技有限公司；Ni-NTA蛋白純化系統購自德國QIAGEN公司；人IFN-γ ELISA購自深圳Dakewe公司；鼠相關細胞因子檢測試劑盒購自杭州MULTI SCIENCES；單磷酰脂質A(MPLA)、人工合成海藻糖6，6′-二分枝菌酸(TDB)均購自Sigma公司；鼠源性His單抗、SYBR Green Kit試劑盒購自TIANGEN公司；限制性核酸內切酶BamHⅠ、XhoⅠ購自thermo scientific公司；母牛分枝桿菌(M.vaccae)裂解液由本室培養獲得。

1.3 引物設計 檢索GenBank獲得Rv3621c基因序列。以pPROEX載體圖譜及Rv3621c全序列為依據，借助DNAMAN軟件確定最優多克隆酶切位點BamHⅠ、XhoⅠ，并通過Primer Preimer 5軟件進行特異性引物設計(P1：TTCGGATCCCTGGACTTTGCTCAGTTACCGCCG，P2：ATCTCGAGTCCGCCAGCCGGCGGTTGGG)。PCR擴增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 80 s，30 Cycles，72 ℃ 10 min。

1.4 重組質粒構建、表達及純化 借助分子克隆法導入Rv3621c基因片段至原核表達載體pPROEX中，構建重組載體pPROEX-Rv3621c，以BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定。過夜連接后，以熱休克法轉化重組質粒至E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，借助終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進行誘導表達。經超聲破碎后，再以Ni-NTA柱在變性條件下純化蛋白，4 ℃梯度透析36 h后，根據內毒素清除試劑盒操作要求清除內毒素(<0.1 EU/mL)。蛋白純化之后，以SDS-PAGE進行分析。進行Western blot分析，以鼠源性His單抗作為一抗，以HRP標記羊抗鼠IgG作為二抗，借此鑒定蛋白，并借助BCA試劑盒進行蛋白定量。

1.5 WBIA檢測不同人群外周血Rv3621c抗原特異性IFN-γ水平 在安徽省淮南市腫瘤醫院中進行病史采集、問卷調查及全身體檢，以隨機數表法隨機選取感染者和健康者共40例，均需符合臨床診斷標準。活動性結核(ATBs)和潛伏性結核(LTBIs)均屬于TB感染者：有(或無)典型TB感染癥狀、有TB感染者密切接觸史、痰涂片培養結果陽性(或陰性)、肺部X光片出現可疑陰影(或正常)和結核菌素試驗(TST)結果陽性(≥5 mm)。健康對照者：無與TB患者密切接觸史、TST結果陰性(<5 mm)。采集受試者全血0.5 mL，置于肝素管中保存，以5 μg/孔rRv3621c蛋白對其進行刺激，置37 °C溫箱孵育18～24 h，以植物血凝素(PHA)和PBS作為陽、陰性對照以人IFN-γ ELISA試劑盒檢測各孔IFN-γ濃度，計算各孔最終值時需考慮PBS刺激的本底值。

1.6 免疫小鼠的分組及免疫方式 6周齡C57BL/6雌性小鼠共30只，分成為PBS組、BCG組、佐劑MTM(M.vaccae裂解液、TDB、MPLA)組、Rv3621c/MTM組和BCG+Rv3621c/MTM組，每組6只小鼠。具體免疫方式如下：①PBS組：200 μL PBS/只；②BCG組：200 μL/只(含菌1.2×106CFU)BCG免疫1次；③佐劑MTM組：100 μL MTM混合100 μL PBS/只；④Rv3621c/MTM組：含40 μg rRv3621c蛋白溶液100 μL混合100 μL MTM/只；⑤BCG+Rv3621c/MTM組：先以200 μL BCG在0周注射1次，再以40 μg rRv3621c蛋白溶液+100 μL MTM/只在3周、6周各注射1次。注射方式：所有分組均為皮下注射，PBS組和BCG組分別為0周注射1次；佐劑MTM組免疫共3次，間隔2周；Rv3621c/MTM組同上；BCG+Rv3621c/MTM組需在0周時注射BCG，3周后，以Rv3621c/MTM注射2次進行增強免疫，每3周注射1次。

1.7 小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a水平的檢測 待小鼠免疫9周之后摘除眼球取血并收集血清，開展間接ELISA檢測血清中特異性抗體分泌水平，出現陽性結果的最高稀釋倍數的倒數即可表示抗體滴度。小鼠血清結果用log10(抗體滴度)表示。確定各組抗體滴度的平均值和標準差，并進行相應統計分析。以IgG2a和IgG1實際測得的稀釋倍數計算IgG2a/IgG1比值。

1.8 ELISA檢測脾細胞中抗原特異性IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-4分泌水平 超凈工作臺內無菌摘取小鼠脾臟，并分離計數，對100 μL的2.5×107/mL脾細胞進行重懸，并將重懸后溶液加入24孔板中。陽性對照、陰性對照及實驗組中分別加入PPD工作液(10 μg/孔)、RPMI1640培養基及Rv3621c蛋白(10 μg/孔)。37 ℃孵育72 h后，離心并收集上清，參考鼠ELISA檢測試劑盒(購自杭州MULTI SCIENCES，鼠IFN-γ ELISA試劑盒批號：A28090243；鼠TNF-α ELISA試劑盒批號：A28281211；鼠IL-2 ELISA試劑盒批號：A20290342；鼠IL-4 ELISA試劑盒批號：A20490434)進行試驗。

1.9 qRT-PCR檢測肺臟組織細胞因子表達水平 超凈工作臺內無菌摘取小鼠肺臟，借助TRIzol法實現RNA樣本提取，將IFN-γ、TNF-α、IL-10和iNOS序列作為模板設計逆轉錄引物。參考SYBR Green Kit試劑盒(購自北京TIANGEN，批號：S8217)進行逆轉錄以及定量PCR試驗。操作時需以GAPDH作為內參，并計算其差異水平。

1.10 統計學分析 使用SPSS18.0軟件進行數據分析。采用非參數U檢驗進行人群實驗數據分析，采用單因素方差檢驗進行小鼠免疫原性相關指標分析。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 重組質粒pPROEX-Rv3621c構建和鑒定 經PCR擴增出序列片段，大小為1 242 bp，插入空載體pPROEX后，重組質粒pPROEX-Rv3621c成功構建(圖1A)，經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定無誤(圖1B)。

A：construction pattern of recombinant plasmid pPROEX-Rv3621c；B：pPROEX-Rv3621c restriction enzyme digestion圖1 重組質粒pPROEX-Rv3621c構建和酶切鑒定Fig.1 Construction and identification of recombinant plasmid pPROEX-Rv3621c

2.2 重組質粒pPROEX-Rv3621c表達、純化和免疫印跡分析 重組質粒pPROEX-Rv3621c轉入E.coliBL21(DE3)感受態細胞后經IPTG誘導培養，表達的rRv3621c蛋白經超聲破碎后，再以變性條件經Ni-NAT柱進行純化，獲得蛋白產物，分子量為45.5 kDa，與預計結果相符(圖2A)，之后經Western blot鑒定其表達成功(圖2B)。

A: Expression and purification of rRv3621c (M: protein marker, 1: recombinant bacteria without induction, 2: whole bacterial fluid of recombinant bacteria under the induction of IPTG, 3: supernatant of recombinant bacteria induced by IPTG after sonication, 4: effluence of rRv3621c through a chromatographic column, 5: effluence after washing with 8 M urea-binding solution, 6-9: eluted rRv3621c protein after chromatography); B: Identification of rRv3621c by western blotting (M: protein marker, 1: pPROEX empty vector, 2: purified rRv3621c and the relative antibodies)圖2 rRv3621c表達、純化和免疫印跡分析Fig.2 Expression, purification, and western blot analysis of rRv3621c

2.3 ATB、LTBI和健康人群接受Rv3621c誘導后特異性IFN-γ分泌水平比較 委托安徽省淮南市腫瘤醫院檢驗科篩選40例受試者(健康對照者10例、ATB患者14例和LTBI受試者16例)，均符合臨床診斷標準。與健康對照者相比，ATB患者外周血中淋巴細胞接受rRv3621c誘導后分泌IFN-γ水平明顯較高(t=4.813,P<0.01)，與LTBI人群相比，ATB患者外周血中淋巴細胞分泌IFN-γ水平明顯較高(t=4.442,P<0.01)；接受PHA誘導時，M.tb感染者和健康對照者分泌IFN-γ水平差異無統計學意義(t=0.736,P>0.05)(圖3)。

A: Specific IFN-γ concentration of rRv3621c-WBIA; B: Specific IFN-γ concentration of PHA-WBIA; 1) P>0.05; 2) P<0.01圖3 人群外周血淋巴細胞接受rRv3621c蛋白和PHA誘導后分泌的IFN-γ水平Fig.3 IFN-γ levels in peripheral blood lymphocytes after induction by rRv3621c protein or PHA

2.4 小鼠血清中特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體滴度水平比較 BCG+Rv3621c/MTM組產生的特異性抗體水平高于Rv3621c/MTM組(q(IgG)=16.52，q(IgG1)=9.033，q(IgG2a)=7.189，均P<0.01)和BCG組(q(IgG)=41.85，q(IgG1)=30.12，q(IgG2a)=32.3，均P<0.01)，差別均具有統計學意義；Rv3621c/MTM組和BCG+Rv3621c/MTM組的IgG2a/IgG1明顯高于BCG組和MTM組(q(Rv3621c/MTM組vsBCG組)=7.87，q(Rv3621c/MTM組vsMTM組)=6.288，q(BCG+Rv3621c/MTM組vsBCG組)=7.624，q(BCG+Rv3621c/MTM組vsMTM組)=6.041，均P<0.01)，IgG2a/IgG1比值>1，表明rRv3621c蛋白主要誘導CD4+Th1型細胞反應的免疫應答(圖4)。

Endpoint titers of A: IgG, B: IgG2a, C: IgG1, D: IgG2a:IgG1 in mice serum after different treatments； 1) P<0.01圖4 小鼠血清特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體滴度Fig.4 Specific IgG, IgG1, and IgG2a antibody titers in mouse serum

2.5 小鼠脾細胞內特異性Th1型細胞因子分泌水平比較 各組小鼠以PPD或rRv3621c刺激后，IFN-γ、TNF-α和IL-2分泌水平最高為BCG+Rv3621c/MTM組，最低為PBS組(F(PPD-IFN-γ)=1514.9，F(PPD-TNF-α)=2672.3，F(PPD-IL-2)=147.48，F(rRv3621c-IFN-γ)=2395.2，F(rRv3621c-TNF-α)=10049，F(rRv3621c-IL-2)=153.16，均P<0.01)，且Rv3621c/MTM組明顯高于MTM組(q[PPD-IFN-γ(Rv3621c/MTM組vsMTM組)]=27.07，q[PPD-TNF-α(Rv3621c/MTM組vsMTM組)]=43.59，

q[PPD-IL-2(Rv3621c/MTM組vsMTM組)]=8.207，

q[rRv3621c-IFN-γ(Rv3621c/MTM組vsMTM組)]=61.31，

q[rRv3621c-TNF-α(Rv3621c/MTM組vsMTM組)]=142.1，

q[rRv3621c-IL-2(Rv3621c/MTM組vsMTM組)]=12.78，均P<0.01)。接受PPD刺激時，BCG組小鼠IFN-γ、TNF-α和IL-2分泌水平明顯高于Rv3621c/MTM組(q[PPD-IFN-γ(Rv3621c/MTM組vsBCG組)]=23.33，

q[PPD-TNF-α(Rv3621c/MTM組vsBCG組)]=32.16，

q[PPD-IL-2(Rv3621c/MTM組vsBCG組)]=3.447，均P<0.05)，差異有統計學意義；小鼠接受rRv3621c刺激時則反之(q[rRv3621c-IFN-γ(Rv3621c/MTM組vsBCG組)]=24.09，

q[rRv3621c-TNF-α(Rv3621c/MTM組vsBCG組)]=65.98，

q[rRv3621c-IL-2(Rv3621c/MTM組vsBCG組)]=8.178，均P<0.01)。小鼠接受誘導后，各組IL-4表達水平無統計學意義(F(PPD-IL-4)=2.4161，F(rRv3621c-IL-4)=1.9117，均P>0.05)，PBS組明顯低于其他各組(q[PPD-IL-4(MTM組vsPBS組)]=3.802，

q[PPD-IL-4(Rv3621c/MTM組vsPBS組)]=6.339，

q[PPD-IL-4(BCG組vsPBS組)]=7.638，

q[PPD-IL-4(BCG+Rv3621c/MTM組vsPBS組)]=6.672，

q[rRv3621c-IL-4(MTM組vsPBS組)]=3.845，

q[rRv3621c-IL-4(Rv3621c/MTM組vsPBS組)]=5.787，

q[rRv3621c-IL-4(BCG組vsPBS組)]=5.263，

q[rRv3621c-IL-4(BCG+Rv3621c/MTM組vsPBS組)]=7.282，均P<0.05)(圖5)。

A: IFN-γ, B: TNF-α, C: IL-2, and D: IL-4 concentrations in the splenocytes of mice after different treatments; 1) P<0.05; 2) P<0.01圖5 小鼠脾細胞抗原特異性IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-4分泌水平Fig.5 Antigen-specific IFN-γ, TNF-α, IL-2, and IL-4 secretion levels in splenocytes of mice

2.6 小鼠肺臟組織細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-10和iNOS表達水平比較 小鼠肺臟組織中IFN-γ、TNF-α和iNOS等細胞因子的表達水平呈差異性(F(IFN-γ)=4604.8，F(TNF-α)=830.49，F(iNOS)=369.3，均P<0.01)。其中，MTM組表達水平最低，而BCG+Rv3621c/MTM組表達水平最高。對于IFN-γ、TNF-α而言，Rv3621c/MTM組表達水平均明顯高于BCG組(q(IFN-γ(Rv3621c/MTM組vsBCG組))=36.75，q(TNF-α(Rv3621c/MTM組vsBCG組))=9.306，均P<0.01)。此外，各組小鼠肺臟組織中IL-10表達水平均較低，且差異無統計學意義(F(IL-10)=3.166 1，均P>0.05)(圖6)。

mRNA expression levels of A: IFN-γ, B: TNF-α, C: iNOS, D: IL-10 in the lungs of mice after different treatments; 1) P<0.01圖6 小鼠肺臟IFN-γ、TNF-α、IL-10和iNOS的mRNA表達水平Fig.6 mRNA expression levels of IFN-γ, TNF-α, IL-10, and iNOS in the lungs of mice detected by qRT-PCR

3 討 論

BCG的誕生和應用在TB的預防史中具有里程碑意義，但由于環境以及基因型的改變，BCG無法長期有效地提供免疫保護力。因此需要研發新型TB疫苗以彌補BCG之不足。而如何篩選具有較高水平免疫原性的特異性M.tb抗原，則是TB疫苗研制策略的重中之重。本課題靶向具有重要意義的RD區抗原，成功構建并原核表達M.tbRD區基因Rv3621c，通過人群外周血實驗和免疫小鼠實驗驗證其是否能夠被人及小鼠T細胞識別、機體是否可以產生較高水平的Th1型免疫應答及rRv3621c是否可以作為BCG初免后的理想增強疫苗。

遺傳學研究表明，RD區基因雖然處于M.tb菌株中，但在所有BCG菌株中均不表達。近年來RD區抗原(尤其是RD1和RD2區抗原)在TB診斷及疫苗改良方面的研究較為深入。如Lewis等[4]從M.tb菌株的H37Rv中敲除RD1區基因，檢測其毒力與BCG對照組相當，從而揭示RD1內或受RD1控制的基因對維持M.tb的毒力必不可少，其缺失對BCG的衰減具有重要影響。Mustafa[5]發現RD2區編碼的Rv1980c(MPT64)和Rv1984c(CFP21)均可誘導機體產生強烈的細胞免疫應答。M.tb基因組RD9區家族具有重要的研究價值。Teo等[6]發現對RD9區基因進行PCR有便于檢測BCG效果。李明等[7]通過表達RD9區Mb1230序列得到重組蛋白，有助于高特異性TB診斷。

Rv3621c亦屬于RD9區家族，我們通過研究證實了rRv3621c可使得ATB患者外周血淋巴細胞受誘導從而分泌高水平IFN-γ，其明顯高于LTBI感染者和健康對照者，提示Rv3621c可被M.tb感染者外周血T淋巴細胞特異性識別。本研究提示Rv3621c在M.tb感染者尤其是ATB患者中具有較高特異性，可作為候選靶抗原應用于TB疫苗和診斷研究中。有研究表明，TB免疫力越強，Th1型免疫應答水平越高，主要表現為高水平的抗原特異性IFN-γ，而IFN-γ、IFN-γ/IL-2等多功能應答效應更強烈時，效應性和記憶性CD4+及CD8+T細胞直接受到影響，提示其是評價候選疫苗靶抗原免疫原性的重要依據[8]。本研究發現，在Rv3621c/MTM組和BCG+Rv3621c/MTM組中，Rv3621c特異性Th1型細胞因子水平明顯上升，提示其可為M.tb感染者提供較高的保護力。本研究同時證實，免疫小鼠6周后，Rv3621c/MTM和BCG+Rv3621c/MTM組小鼠血清IgG2a/IgG1>1，提示Rv3621c/MTM組小鼠體內Th1型免疫應答更加強烈。此外，試驗結果證明，BCG+Rv3621c/MTM組小鼠體內肺臟中IFN-γ、TNF-α和iNOS表達水平最高。其中，iNOS有助于巨噬細胞分泌NO，從而吞噬細菌[9]。IL-10表達水平提示體液免疫應答水平，二者呈正比[10]。各組小鼠IL-10均呈較低表達水平且無顯著差異，說明rRv3621c更加趨向Th1型細胞免疫應答反應，基本符合ELISA結果。本研究證實了Rv3621c作為靶抗原，可用于構建融合多階段抗原的TB增強型疫苗，從而增強BCG的保護效力。

總之，本研究明確了淮南市M.tb感染者可對Rv3621c進行T細胞識別，并通過小鼠試驗證明了Rv3621c的Th1型免疫應答作用。以上試驗結果提示Rv3621c作為RD區抗原，可作為具有潛力的靶抗原應用于構建TB增強型新型疫苗(尤其是構建包含多個不同感染階段抗原的融合亞單位疫苗)，從而獲得更高水平的保護力。本研究為研制具有高度抗M.tb感染保護性的疫苗奠定了免疫學基礎。

利益沖突：無