4種豬絳蟲蚴的多重PCR鑒別

陳國梁，郭愛民，張少華，梁盼紅，李艷萍，王立群，劉婷麗，白 雪，駱學農

絳蟲是一類具有復雜生活史的寄生蟲，其幼蟲(絳蟲蚴)不僅嚴重危害豬、牛、羊等動物的健康，造成養殖業的經濟損失，而且很多都是人獸共患寄生蟲病，對人類健康也構成潛在威脅。豬囊尾蚴病(Cysticercosis cellulosae)是由豬帶絳蟲(Taeniasolium)的中絳期幼蟲-囊尾蚴(Cysticercuscellulosae)寄生于人和豬引起的一種嚴重危害人類健康和畜牧業生產的人獸共患寄生蟲病。該病呈全球性分布，主要流行于亞、非、拉等一些國家和地區，其中以中非、南非、中南美等地區最為嚴重[1-2]。全球每年約有5 000萬人感染豬帶絳蟲或豬囊尾蚴，約有5萬人死于腦囊尾蚴(囊蟲)病[3]。豬帶絳蟲病和囊蟲病互為因果，形成人-豬相互傳播，惡性循環，已成為重要的公共衛生問題。雖然可以通過改善公共衛生、加強動物的飼養管理、嚴格肉品檢疫來控制該病的發生，但無論是人的豬帶絳蟲病還是豬和人的囊尾蚴病，都沒有特異、敏感的血清學診斷方法，其診斷的金標準仍然是病原學檢查。因此，剖檢仍然是目前豬肉檢疫中豬囊尾蚴病診斷的金標準。

豬帶絳蟲(Taeniasolium)、亞洲帶絳蟲(Taeniaasiatica)、細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)和泡狀帶絳蟲(Taeniahydatigena)的幼蟲(絳蟲蚴)常寄生于豬的肌肉或肝臟等內臟器官。豬囊尾蚴(C.cellulosae)主要寄生于豬的肌肉、肝臟和大腦[4]，而亞洲帶絳蟲囊尾蚴除可寄生于肌肉外，與細粒棘球蚴和細頸囊尾蚴一樣，主要寄生于豬的肝臟等內臟器官。由于囊尾蚴和棘球蚴均為包囊性結構，在包囊很小時，很難通過肉眼進行區分，尤其是豬囊尾蚴、亞洲帶絳蟲囊尾蚴和細頸囊尾蚴都具有1個頭節，頭節上有頂突和小鉤，常規的頭節壓片鏡檢也難于準確鑒定[5]。因此，基于DNA片段的分子診斷是目前豬帶絳蟲/囊尾蚴鑒別診斷必不可少的技術手段[6-8]。

多重聚合酶鏈式反應(multiplex polymerase chain reaction, mPCR)是一種可在同一體系中同時擴增多個核酸片段的PCR方法，可直接通過PCR產物電泳條帶大小或PCR產物的序列分析對不同蟲種進行鑒別[9]。本試驗擬建立一種可以同時鑒別豬囊尾蚴等4種豬絳蟲蚴的mPCR檢測方法，對豬囊尾蚴病的流行病學調查、追蹤溯源及保障食品安全和人類健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 蟲體 豬囊尾蚴、亞洲帶絳蟲囊尾蚴、細粒棘球蚴、細頸囊尾蚴均由蘭州獸醫研究所家畜寄生蟲實驗室人工感染豬后剖檢收集或臨床收集保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒均購自Axygen公司，pMDTM19-T vector Cloning Kit購自TaKaRa公司，2×Taq Master Mix和Fast-T1化學感受態細胞購自Vazyme公司。主要儀器有超速離心機(Thermo)、PCR儀(Bio-Rad)、電泳儀(Bio-Rad)、凝膠成像系統(Bio-Rad)、電熱恒溫培養箱(DHP-9052型)等。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取 從-80 ℃冰箱分別取出4種絳蟲幼蟲(亞洲帶絳蟲囊尾蚴、細粒棘球蚴、細頸囊尾蚴和豬囊尾蚴)，室溫解凍后用去離子水洗干凈，分別置于研缽中，加入液氮快速研磨至粉狀；以未感染囊尾蚴的豬肝臟作為陰性對照，按照試劑盒說明書分別提取每種蟲體和肝臟的基因組DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.2 引物設計及合成 從GenBank中下載4種絳蟲線粒體基因組序列，并用DNAMAN進行比對分析。參考Jeon等[10-11]的文章，以tRNA-Val、tRNA-Ala、tRNA-Asp和nad1基因為mPCR擴增的目標基因，用Oligo軟件分析比較，篩選出最優的4種絳蟲特異性上游引物和1條通用下游引物序列(圖1)。引物由西安擎科生物公司合成(表1)，使用前分別稀釋至10 pmol/μL。

圖1 4種絳蟲蚴線粒體部分序列比對及特異性引物結合位點Fig.1 Sequence alignment and specific primer binding sites for the partial mitochondrial genome sequence of four tapeworm metacestodes

表1 PCR引物設計Tab.1 Design of PCR primers

1.2.3 4種豬絳蟲蚴PCR方法的建立 取亞洲帶絳蟲囊尾蚴、細粒棘球蚴、細頸囊尾蚴、豬囊尾蚴和豬肝臟的基因組DNA模板各0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，加ddH2O補足至25 μL，混合均勻后進行PCR反應。PCR反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共進行35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR擴增產物的特異性，評價4種絳蟲蚴引物的特異性。

1.2.4 4種絳蟲蚴mPCR方法的建立 分別以0.5 μL亞洲帶絳蟲囊尾蚴、細粒棘球蚴、細頸囊尾蚴、豬囊尾蚴及豬肝臟的基因組DNA為模板，4種絳蟲蚴特異性引物(TaF、EgF、ThF和TsF)的等量混合物(2 μL)為上游引物，通用引物(TR，2 μL)為下游引物，加入2×Taq Master Mix 12.5 μL，并加ddH2O至25 μL。與1.2.3相同條件下進行PCR擴增，評價引物混合后各個片段擴增的特異性。

1.2.5 mPCR方法的特異性 采用優化后的PCR反應體系及擴增程序，分別取亞洲帶絳蟲囊尾蚴、細粒棘球蚴、細頸囊尾蚴、豬囊尾蚴各2種、3種和4種DNA等量混合，分別以混合DNA為模板，用混合引物進行mPCR擴增，評價不同DNA混合物對PCR產物特異性的影響。同時，用豬肝臟DNA和混合引物進行的mPCR作為陰性對照。

1.2.6 臨床樣品的鑒別 取實驗室保存的臨床收集或人工感染的12份來自豬的絳蟲蚴樣品，分別提取基因組DNA，用mPCR對12份樣品進行鑒別。

1.2.7 mPCR擴增序列的驗證 取4種絳蟲蚴PCR擴增產物(710 bp、619 bp、542 bp和478 bp)，用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳。用膠回收試劑盒純化的PCR產物分別與pMDTM19-T連接，轉化大腸桿菌Fast-T1感受態細胞，在含氨芐青霉素(終濃度為100 μg/mL)、X-gal(終濃度為4 mg/mL)和IPTG(終濃度為0.1 mmol/L)的LB平板上37 ℃培養14～16 h，挑白色單克隆菌落擴大培養，經PCR鑒定后送西安擎科生物公司測序。

2 結 果

2.1 PCR引物的確定 4種絳蟲特異性上游引物(TaF、EgF、ThF和TsF)分別與下游通用引物(TR)進行PCR擴增，獲得的目的片段大小分別為710 bp(亞洲帶絳蟲囊尾蚴)、619 bp(細粒棘球蚴)、542 bp(細頸囊尾蚴)和478 bp(豬囊尾蚴)，而陰性對照沒有擴增出任何條帶(如圖2)，說明所設計的上游引物(EgF、TaF、ThF和TsF)是種特異性的，可對目標蟲體的DNA進行有效擴增。其PCR擴增條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共進行35個循環，72 ℃延伸5 min。

M為DNA Marker DL1000；1為亞洲帶絳蟲囊尾蚴；2為細粒棘球絳蟲；3為細頸囊尾蚴；4為豬囊尾蚴；5為陰性對照圖2 4種絳蟲蚴的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of four metacestodes

2.2 mPCR方法的建立 4種絳蟲蚴特異性上游引物混合液(EgF、TaF、ThF和TsF)結合下游引物(TR)，也分別擴增出了預期大小的片段(710 bp、619 bp、542 bp、478 bp)，而陰性對照沒有擴增出任何條帶(如圖3)，說明4組引物混合后，彼此間不存在相互影響，在同一反應體系中擴增出各自對應的目的片段。

M為DNA Marker DL1000；1為亞洲帶絳蟲囊尾蚴；2為細粒棘球絳蟲；3為細頸囊尾蚴；4為豬囊尾蚴；5為陰性對照圖3 4種絳蟲蚴的mPCR擴增Fig.3 Multiplex PCR amplification of four metacestodes

2.3 mPCR特異性分析 將4種絳蟲蚴基因組DNA每2種、3種和4種混合后作為模板，用4種特異性上游引物混合液(EgF、TaF、ThF和TsF)結合下游通用引物(TR)可分別擴增出4種絳蟲特異性片段(圖4)，說明4種絳蟲種特異性引物的特異性不受其他種DNA的干擾。

2.4 臨床樣品檢測 用已建立的mPCR方法，對12份臨床疑似絳蟲蚴樣品進行了鑒定。PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果表明(圖4)，待鑒定的12份樣品中分別擴增出478 bp(豬囊尾蚴)片段1份、710 bp(亞洲帶絳蟲囊尾蚴)片段3份、542 bp(細頸囊尾蚴)片段3份、619 bp(細粒棘球蚴)片段5份，而陰性對照樣品沒有擴出任何條帶，說明12份樣品中有1份豬囊尾蚴、3份亞洲帶絳蟲囊尾蚴、3份細頸囊尾蚴和5份細粒棘球蚴，而且mPCR結果與各個絳蟲蚴的特異性引物所做的PCR結果相一致。表明所建立的mPCR方法可根據擴增片段的大小對豬的4種絳蟲蚴進行鑒定。

M為DNA Marker DL1000；1為4種絳蟲蚴DNA混合樣品的陽性對照；2為陰性對照；3,5,13為亞洲帶絳蟲囊尾蚴；4,7,8,10,12為細粒棘球絳蟲；9,11,14為細頸囊尾蚴；6為豬囊尾蚴圖4 12份絳蟲蚴DNA樣品的mPCR鑒定Fig.4 Multiplex PCR identification of 12 metacestode DNA samples

2.5 PCR擴增片段測序分析 PCR產物測序表明，亞洲帶絳蟲囊尾蚴、細粒棘球蚴、細頸囊尾蚴、豬囊尾蚴的擴增片段大小分別為710、619、542 和478 bp，其序列與NCBI同源序列的一致性達99%以上，說明PCR擴增的各個絳蟲蚴的片段即為設計的目的DNA片段。

3 討 論

李彥采用mPCR技術擴增了人源3種絳蟲HDP2基因序列，豬帶絳蟲、亞洲帶絳蟲分別擴增出約150 bp和599 bp的條帶，而牛帶絳蟲則擴增出 150 bp 和 599 bp 的2條帶，從而根據PCR條帶的大小和帶數建立了區分人源3種絳蟲的mPCR方法[12]。Jeon等[10]采用mPCR技術擴增3種人源絳蟲的tRNA-Val、tRNA-Ala、tRNA-Asp和nad1基因，擴增豬帶絳蟲(T.solium)、牛帶絳蟲(T.saginata)和亞洲帶絳蟲(T.asiatica)的基因分別產生478 bp、628 bp和710 bp的單一條帶；應用該方法檢測糞便中的蟲卵，檢測限為10 枚蟲卵/1克糞便。以上2種方法已被應用于3種人源絳蟲的鑒別診斷。

González[13]應用基于HDP2 基因片段的mPCR和rDNA內轉錄間隔區(ITS1和ITS2)的PCR-RFLP方法，可成功區分牛帶絳蟲囊尾蚴、豬囊尾蚴、細頸囊尾蚴和細粒棘球蚴。本研究中建立的4種豬源囊尾蚴mPCR方法較González的方法簡單、省時、高效。筆者用DNAMAN對來自豬的4種絳蟲蚴：豬囊尾蚴、亞洲帶絳蟲囊尾蚴、細粒棘球蚴和細頸囊尾蚴的線粒體基因組進行了比對分析，以tRNA-Val、tRNA-Ala、tRNA-Asp和nad1基因為靶標，設計了4條種特異性上游引物和1條通用下游引物。其中，針對亞洲帶絳蟲囊尾蚴、豬囊尾蚴的特異性引物較Jeon等設計的引物分別少3個堿基和1個堿基。因為Oligo分析顯示，Jeon等設計的引物與細粒棘球蚴和細頸囊尾蚴有較高的錯配率，從而導致PCR反應的特異性較差。

本研究設計引物的靶基因與Jeon等[10]的完全相同，并且引物部分結合位點也相同，但特異性大大提高。如果用該引物進行亞洲帶絳蟲和豬帶絳蟲鑒別診斷，推測其敏感性接近甚至超過Jeon等所建方法的檢測限(10枚蟲卵/1g糞便)。但由于并未采集到絳蟲患者的新鮮糞便，未進行糞便中的蟲卵檢測試驗和敏感性試驗，所以本研究中mPCR的敏感性不確定。我們認為，該方法能夠有效的區分豬囊尾蚴、亞洲帶絳蟲囊尾蚴、細粒棘球蚴和細頸囊尾蚴，在臨床豬囊尾蚴病檢驗中具有重要意義，尤其在豬肝臟寄生絳蟲蚴時，一定要將與豬囊尾蚴大小相近的亞洲帶絳蟲囊尾蚴和細頸囊尾蚴的進行鑒別診斷。因為三者間只是大小不同，一旦大小相近即使頭節壓片顯微鏡檢查也很難準確鑒定。

當然，本研究所建立的mPCR方法，只能用于豬剖檢后囊尾蚴病的輔助診斷。如果用PCR方法能檢測豬血清樣品中囊尾蚴的循環DNA，進行豬囊尾蚴病的生前分子診斷，那這種mPCR方法將具有更大的實用性和現實意義。因為目前豬囊尾蚴病的生前診斷主要依賴于血清抗體或抗原檢測，這些血清學檢測方法(如ELISA)往往在不同絳蟲蚴間，甚至不同蠕蟲間存在交叉反應。而分子診斷即使靶基因有幾個堿基的差異，也可以通過檢測血清中的DNA進行寄生蟲的種間鑒別。越來越多學者開始探索建立從血清中檢測絳蟲DNA來檢測絳蟲蚴感染的方法。Ramahefarisoa等比較了用ELISA檢測抗體和針對線粒體細胞色素氧化酶基因(COI)的血清PCR方法，認為PCR檢測的特異性高，建議將其用于豬帶絳蟲囊尾蚴病確診[14]。但Galán-Puchades等通過NCBI/BLAST和ClustalW進行的生物信息學分析發現，不同帶絳蟲種線粒體細胞色素氧化酶基因的同源性高，認為Ramahefarisoa等人獲得的結果可能只能證明帶絳蟲幼蟲(蚴)的存在[15]。如果將我們建立的mPCR方法用于血清DNA的檢測，理論上可實現對豬囊尾蚴病的生前鑒別診斷。目前，我們正在進行豬囊尾蚴病血清中DNA的mPCR的檢測工作。

利益沖突：無