低氧誘導視網膜色素上皮細胞損傷的生物學機制轉錄組測序分析

盧聰 史平玲 楊琪翔 宋昊 李苗 張貝貝 宋宗明

河南大學人民醫院 河南省人民醫院眼科 河南省立眼科醫院 河南省眼科研究所，鄭州 450003

持續的視網膜缺血、缺氧會造成組織細胞損傷，引起細胞凋亡或壞死，進而導致糖尿病視網膜病變、視網膜中央靜脈阻塞和早產兒視網膜病變等疾病的發生和發展，造成嚴重的視力損害[1]。研究表明，缺氧能夠引起視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞以及視網膜血管功能的紊亂，在缺氧環境中RPE細胞會持續表達血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[2-4]，促使視網膜及脈絡膜微血管內皮細胞不斷分裂增生，形成異常新生血管，繼而引起視力的不可逆損害。因此，減緩甚至阻止視網膜缺血缺氧進程變得尤為重要。低氧誘導因子(hypoxia-inducible factors-1α，HIF-1α)是一種重要的核轉錄調節因子，在缺氧條件下被激活，并誘導包括VEGF在內的多種基因產物的表達[5]。RPE細胞位于神經視網膜外的色素細胞層，與上層視網膜感光細胞和下層脈絡膜緊密相連并滋養視網膜感光細胞，在缺血或低氧狀態下極易受到影響并造成損傷[2,6-7]。深入探討低氧誘導RPE細胞損傷的分子機制有助于相關疾病的早期防治，改善患者預后。轉錄組測序技術又稱RNA測序(RNA sequencing，RNA-seq)，具有高通量、全方位、快速獲取轉錄本的特點[8-9]。用于定量基因在細胞、組織、器官乃至整個機體中的表達異質性，在破譯基因組結構和功能、識別細胞生物系統下的遺傳網絡、建立應對疾病、病原體的分子生物標志物等方面發揮著重要作用[10-12]。生物信息學技術是采用計算機技術結合信息論方法對蛋白質、核酸信息進行采集、存儲、傳遞以及分析的科學，通過數據庫建設、序列分析、結構分析與功能預測、大規模功能表達譜分析、代謝網絡建模分析等，整合數據量巨大的核酸、蛋白質信息，使之成為具有明確生物學意義的生物信息[13-14]。本實驗擬通過RNA-seq及生物信息學技術分析低氧與常氧處理下的ARPE-19細胞基因表達譜變化，探討低氧誘導的RPE細胞損傷發生和發展可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源 ARPE-19細胞購自美國ATCC公司。

1.1.2主要試劑及儀器 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(11011-8611，浙江天杭生物科技股份有限公司)；DMEM-F12培養基、胰蛋白酶-EDTA溶液(北京索萊寶科技有限公司)；Trizol?試劑(美國Thermo Fisher公司)；逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser、實時熒光定量PCR試劑盒TB Green?premix Ex TaqTMⅡ試劑(日本Takara Biotechnology公司)；實時熒光定量PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；細胞活力(活死細胞染色)檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)。細胞培養箱(美國Thermo Fisher公司)；Stepone Plus實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 將保存于液氮中的ARPE-19細胞置于37 ℃恒溫水浴鍋中解凍復蘇，待細胞融化后快速轉移至含體積分數10% FBS的DMEM-F12培養基15 ml的離心管中混勻，室溫下156×g離心5 min，棄上清，用1 ml培養基懸浮細胞沉淀，吹打均勻后將細胞置于25 cm2細胞培養瓶中，每瓶中加入3～4 ml培養基進行培養。待ARPE-19細胞密度達到80%～90%進行傳代培養，棄去培養基，使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗2次。每瓶加入1 ml質量分數0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液，放入細胞培養箱消化2 min取出。每瓶加入1 ml DMEM-F12培養基終止胰蛋白酶消化，轉移至15 ml離心管，156×g離心5 min，棄上清液。加入DMEM-F12培養基吹勻，進行細胞計數，以2×107/皿細胞的密度將ARPE-19細胞接種至直徑10 cm培養皿中，并置于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中孵育，待細胞貼壁生長后將細胞分為常氧對照組和低氧處理組，分別置于體積分數21%和1% O2的三氣培養箱中繼續培養8、24、48和72 h，收集細胞，以進行后續實驗。

1.2.2RNA-seq及生物信息學分析 低氧處理組與常氧對照組各設6個細胞生物學重復樣本，于處理后8 h和24 h各組各收集3個細胞樣本，使用2 ml/皿Trizol?試劑進行處理，每個樣品取1 ml送至武漢華大醫學檢驗所提取總RNA，通過Fragment Analyzer進行濃度和質量檢測，質量合格的RNA使用BGISEQ-500平臺進行RNA-seq，測序長度為SE50，絕大多數轉錄本被完整覆蓋，同時reads均勻分布在轉錄本的各個區域。原始數據(raw reads)以FASTQ格式記錄，經Trimmomatic軟件過濾掉包含接頭的reads(接頭污染)、未知堿基N含量大于5%的reads(N表示無法確定的堿基信息)、低質量reads(質量值Q<10的堿基數占整個reads總堿基的比例大于20%以上的reads)，得到高質量clean reads，以保證結果的可靠性。使用HISAT將clean reads比對到參考基因組序列，使用Bowtie2將clean reads比對到參考基因序列，使用標準化算法FPKM(fragments per kilo-base per million mapped fragments)，即每百萬個片段中比對上某轉錄本每千堿基長度的片段數目作為基因表達水平的衡量指標。本研究將|log2FC|≥1、P≤0.05的基因作為篩選差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)的標準，對DEGs進行生物信息學分析。用火山圖描繪低氧刺激ARPE-19細胞8 h和24 h后DEGs的分布情況。使用R語言中的pheatmap包對DEGs進行基因間與樣本間的聚類熱圖分析。每列代表1個樣品，每行代表1個轉錄本，顏色越紅表達量越高，顏色越綠表達量越低。采用Dr.TOM系統對DEGs進行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能注釋分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析，篩選出參與調控低氧反應的信號通路，采用String數據庫和Cytoscape軟件構建ARPE-19細胞處理24 h后DEGs的蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網絡圖，尋找參與低氧反應的功能性靶基因。連線代表基因間的調控關系。顏色越亮、圖標越大代表該基因在網絡中與其他基因關系越密切，功能越重要。

表1 2個組DEGs引物序列Table 1 Primer sequence of DEGs in the two groups基因 NM.序列號引物序列(5’-3’)log2FCDEPP1NM_145980.2正向:GTGAGGTCTATATCTCGACTGGC反向:ACTGAAACGTGCGGTGATGT1.574349NPPBNM_008726.6正向:TGGAAACGTCCGGGTTACAG反向:CTGATCCGGTCCATCTTCCT1.419870PDZK1NM_002614.4正向:CATGATCCTGACCGTCGGAAA反向:TGCTCACTGGACCTGAAACTG1.452112HILPDANM_001193365.1正向:AAGCATGTGTTGAACCTCTACC反向:TGTGTTGGCTAGTTGGCTTCT1.397986NDRG1NM_001135242.2正向:CTCCTGCAAGAGTTTGATGTCC反向:TCATGCCGATGTCATGGTAGG1.260060RORCNM_005060.4正向:CTGGGCATGTCCCGAGATG反向:GAGGGGTCTTGACCACTGG1.836842TCEA3NM_003196.3正向:CCCCAAAACACCTAGCAGC反向:CTTCATGTCCGTGCTCTTGAG1.230815TFRCNM_011638.4正向:GGCTACTTGGGCTATTGTAAAGG反向:CAGTTTCTCCGACAACTTTCTCT-2.138634NQO1NM_000903.3正向:GAAGAGCACTGATCGTACTGGC反向:GGATACTGAAAGTTCGCAGGG-1.101194 注:DEGs:差異表達基因;FC:倍數變化 Note:DEGs:differentially expressed genes;FC:fold change

1.2.3實時熒光定量PCR法檢測與低氧相關基因的mRNA表達水平 將1.2.1中收集的ARPE-19細胞使用Trizol法提取細胞的總RNA，經Thermo SPECTRONIC 200分光光度計檢測其濃度和吸光度(A)值。采用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，實時熒光定量PCR定量VEGF、HIF-1α mRNA表達量，預實驗以對低氧刺激較為敏感的VEGF和HIF-1α在mRNA水平上發生的變化為條件篩選合適時間點進行RNA-seq。根據預實驗中不同時間點mRNA表達量的差異結果并結合相關文獻報道[4,15-16]，選擇mRNA表達差異較大的8 h、24 h這2個時間點，收集樣本后進行RNA-seq。根據測序結果和文獻報道，篩選DEGs中可能與低氧相關的9個基因DEPP1、NPPB、PDZK1、HILPDA、TCEA3、NDRG1、RORC、TFRC和NQO1，驗證高通量測序結果的準確性。設計9個基因的正向引物和反向引物(表1)，以β-actin為內參基因。使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行實時熒光定量PCR反應；用于定量的反應體系包括TB Green?Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μl，ROX reference Dye 0.4 μl，正向引物和反向引物各2.0 μl，cDNA模板5.6 μl，共20.0 μl。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火，延伸30 s，40個循環；同一樣品設置3個重復孔。采用2-△△CT法計算各個基因的mRNA相對表達水平。

1.2.4細胞活性熒光染色檢測低氧環境下細胞生存狀態 取處于對數生長期的ARPE-19細胞，接種至24孔細胞培養板中，每孔2×104個細胞，置于37 ℃、5% CO2、1% O2培養箱孵育8、24、48、72 h后，棄去培養基，PBS洗滌2次，使用細胞活力檢測試劑盒按照說明書向孔內加入檢測試劑進行染色，使用ImageJ軟件分析及熒光顯微鏡成像觀察低氧處理后不同時間點細胞的生存狀態。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 7軟件進行統計分析。本研究中計量資料數據經Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態分布，以mean±SD表示。常氧對照組與低氧處理組不同時間點VEGF、HIF-1α和DEGs mRNA相對表達量的比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2個組不同時間點ARPE-19細胞中VEGF、HIF-1α mRNA相對表達量比較

低氧處理組8、24、48、72 h VEGF和低氧處理組8、24、48 h HIF-1α mRNA相對表達量均高于常氧對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)；2個組VEGF和HIF-1α mRNA相對表達量在24 h時差異最大，其次是8 h(表2)。本實驗選擇8 h、24 h作為低氧處理時間，處理后收集樣本進行RNA-seq。

表2 2個組ARPE-19細胞處理后不同時間點VEGF和HIF-1α mRNA相對表達量的比較(mean±SD)Table 2 Comparison of the relative mRNA expression levels of VEGF and HIF-1α in ARPE-19 cells after treatment at different time points between the two groups (mean±SD)組別樣本量不同時間點VEGF mRNA相對表達量8h24h48h72h常氧對照組31.00±0.141.00±0.121.00±0.121.00±0.08低氧處理組32.06±0.072.49±0.101.47±0.091.29±0.10t值11.7217.515.643.85P值<0.01<0.01<0.010.02組別樣本量不同時間點HIF-1α mRNA相對表達量8h24h48h72h常氧對照組31.00±0.111.00±0.161.00±0.061.00±0.05低氧處理組31.96±0.152.00±0.071.53±0.131.20±0.11t值8.749.936.552.70P值<0.01<0.01<0.01>0.05 注:(獨立樣本t檢驗) VEGF:血管內皮生長因子;HIF-1α:低氧誘導因子-1α Note:(Independent-samples t test) VEGF:vascular endothelial growth factor;HIF-1α:hypoxia-inducible factors-1α

2.2 2個組ARPE-19細胞處理8 h、24 h后樣品測序數據

常氧、低氧處理ARPE-19細胞8 h、24 h后測序共得到12組轉錄組數據，原始數據過濾掉測序接頭序列、未知堿基序列、低質量序列后得到高質量測序數據clean reads(表3)。

表3 2個組ARPE-19細胞處理8h、24h后樣品測序數據過濾后的reads質量統計Table 3 Quality statistics of filtered reads from the sequencing data after 8-hour and 24-hour treatment of ARPE-19 cells in the two groups樣本名稱過濾后readsreads數目(M)Q20(%)Q30(%)8h 常氧組122.8498.7895.188h 常氧組222.8498.7395.018h 常氧組322.8498.7895.328h 低氧組122.8898.8695.498h 低氧組222.8298.7695.158h 低氧組322.8798.7595.1424h常氧組125.1298.0093.9524h常氧組225.9597.6993.1724h常氧組325.9597.9093.7624h低氧組125.9597.8493.6124h低氧組223.9397.8093.5524h低氧組325.9497.7993.44 注:Q20為過濾后質量不低于20的堿基比例,Q30為過濾后質量不低于30的堿基比例 Note:Q20 was the ratio of bases with a quality of no less than 20 after fil-tration,and Q30 was the ratio of bases with a quality of no less than 30 after filtration

2.3 2個組ARPE-19細胞處理8 h、24 h后DEGs分析

低氧處理8 h和24 h后顯著DEGs中有9個相同基因(圖1)。低氧刺激ARPE-19細胞8 h和24 h后DEGs的分布情況見圖2。低氧處理8 h，低氧處理組與常氧對照組間相比共篩選出62個DEGs，其中顯著上調基因45個，顯著下調基因17個。低氧處理24 h，2個組間共篩選出255個顯著DEGs，其中顯著上調基因228個，顯著下調基因27個。

圖1 2個組ARPE-19細胞處理8 h、24 h后DEGs Venn圖 紫色表示處理8 h后顯著DEGs的基因個數；黃色表示處理24 h后顯著DEGs的基因個數；灰色表示處理8 h和24 h顯著DEGs中相同的基因個數

圖2 2個組ARPE-19細胞處理8 h、24 h后DEGs火山圖 A：低氧處理8 h DEGs火山圖 B：低氧處理24 h DEGs火山圖 FC：倍數變化；DEGs：差異表達基因

2.4 2個組ARPE-19細胞處理8 h、24 h后DEGs的聚類熱圖分析

每組3個生物學樣本重復性較好，同組樣本間具有較高的相關性，2個組各時間點在整體基因表達方面存在明顯差異(圖3)。

圖3 2個組ARPE-19細胞低氧處理8 h、24 h后DEGs聚類熱圖分析 每列代表1個樣品，每行代表1個轉錄本，顏色越紅則表達量越高，顏色越綠則表達量越低，2個組在整體基因表達方面存在明顯差異 A：低氧處理8 h DEGs聚類熱圖 B：低氧處理24 h DEGs聚類熱圖

2.5 2個組ARPE-19細胞處理8 h、24 h后DEGs的GO功能注釋分析

低氧處理8 h后2個組DEGs沒有顯著富集GO功能進程，處理24 h后2個組DEGs經過GO功能富集分析在25個生物學進程條目、17個細胞組分條目、11個分子功能條目(P≤0.05)。對所有DEGs進行GO功能注釋，結果顯示在生物學過程中前20個富集的條目功能主要為蛋白質降解、核苷酸生物合成、超氧化物自由基清除、肌動蛋白纖維及物質轉運等進程；在分子功能中，整合與催化活性條目富集程度最高；在細胞組分本體中，細胞條目富集程度最高(圖4)。

圖4 2個組ARPE-19細胞處理24 h后DEGs的GO功能富集分析圖 柱狀圖代表顯著富集的GO條目(P≤0.05)，折線代表該條目包含的基因個數 A：GO功能分析 B：GO生物學進程分析

2.6 2個組ARPE-19細胞處理8 h、24 h后DEGs的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結果顯示，低氧處理8 h后2個組間DEGs沒有KEGG顯著富集通路，處理24 h后2個組間DEGs篩選出17條KEGG顯著富集通路(P≤0.05)，主要富集在PI3K-Akt、cGMP-PKG信號通路以及其他與代謝、細胞周期、細胞生長和細胞凋亡、鐵死亡密切相關的信號通路(圖5)。

圖5 2個組ARPE-19細胞處理24 h后DEGs的KEGG通路富集分析 柱狀圖為顯著富集的KEGG通路條目(P≤0.05)；折線圖為富集KEGG通路靶基因個數 圖6 低氧處理ARPE-19細胞24 h后DEGs的PPI網絡圖 網絡圖中的連線代表基因間的調控關系，顏色越亮、圖標越大代表該基因在網絡中與其他基因關系越密切，功能越重要

2.7 2個組ARPE-19細胞處理24 h后DEGs的PPI網絡分析

低氧處理ARPE-19細胞24 h后篩選到的DEGs通過String平臺得到關鍵基因HPCA、MT3和NOS3，所對應的靶蛋白海馬素鈣結合蛋白(hippocalcin，HPCA)、金屬硫蛋白3(metallothionein，MT3)、一氧化氮合酶3(nutric oxide synthase，NOS3)可能是網絡中最重要的靶點蛋白(圖6)。

2.8 低氧處理ARPE-19細胞24 h后與低氧相關的DEGs的驗證

低氧處理ARPE-19細胞24 h后，DEPP1、NPPB、PDZK1、HILPDA、TCEA3、NDRG1和RORC的mRNA表達水平顯著上調，TFRC、NQO1的mRNA表達水平顯著下調(表4)，與測序結果變化一致。

表4 2個組ARPE-19細胞處理24h后DEGs mRNA相對表達量的比較(mean±SD)Table 4 Comparison of relative mRNA expression levels of DEGs in ARPE-19 cells after 24-hour treatment between the two groups (mean±SD)組別樣本量各基因mRNA相對表達量DEPP1NPPBPDZK1HILPDANDRG1TCEA3RORCTFRCNQO1常氧對照組31.00±0.071.00±0.211.00±0.301.00±0.061.00±0.191.00±0.041.00±0.171.00±0.131.00±0.10低氧處理組37.95±0.454.05±0.322.97±0.272.36±0.331.79±0.031.53±0.204.13±0.590.29±0.010.27±0.03t值26.1913.51 8.39 6.95 7.15 4.42 8.84 9.13 7.62P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.05<0.01<0.01<0.01 注:(獨立樣本t檢驗) DEGs:差異表達基因 Note:(Independent-samples t test) DEGs:differentially expressed genes

2.9 低氧處理ARPE-19細胞不同時間點活性熒光染色細胞狀態變化

低氧處理ARPE-19細胞8 h、24 h后，細胞形態均正常，生長狀態較好，未出現死亡細胞，低氧處理48 h后ARPE-19細胞出現死亡，低氧處理72 h后死亡細胞數量增加(圖7)。

圖7 低氧誘導后不同時間點ARPE-19細胞活性熒光染色(×200，標尺=100 μm) 8 h、24 h時，細胞無死亡；48 h后細胞出現死亡；72 h后死亡細胞數量顯著增加 藍色熒光為Hochest33342標記細胞核；紅色熒光為PI標記已破膜的死細胞；綠色熒光為Calcein-AM標記具有細胞活性的細胞

3 討論

缺血、缺氧影響視網膜疾病的發生和發展，是許多眼病共同的病理特征[17-18]。在細胞水平上，缺血、缺氧誘導的視網膜損傷包括線粒體酶活性降低、鈣穩態損傷、能量衰竭和缺氧引起的氧化應激[1]。因此，針對低氧誘導細胞損傷的研究對于恢復正常的視網膜環境、干預和防止視網膜不可逆損傷至關重要。本實驗采用RNA-seq和生物信息學分析方法研究低氧誘導的ARPE-19細胞損傷的分子機制，為研究缺血、缺氧性視網膜疾病的病理過程提供實驗依據。

近年來隨著RNA-seq的迅速發展，其被廣泛地應用于基因表達及調控的研究中[19-20]。本研究發現，cGMP-PKG信號通路在低氧條件下參與細胞活化及抗氧化反應，對細胞起到保護作用。研究表明，NO-cGMP-PKG通路的激活被認為是抑制細胞凋亡的重要途徑[21]；PI3K-Akt是HIF-1α的主要上游調控因子之一，在低氧損傷進程中發揮了關鍵作用[22]。低氧環境下，PI3K-Akt信號通路被激活，通過活化生存相關的蛋白和失活凋亡相關的蛋白調節HIF-1α的表達來發揮功能[23-24]，HIF-1α又可進一步調控下游VEGF變化，促進缺血適應[4,25]。研究表明，通過PI3K/Akt通路可減弱氧化應激誘導的細胞損傷[26]。VEGF是一種重要的生長因子，與細胞和新生血管生長密切相關[3]。HIF-1α作為適應缺氧反應的主要轉錄調節因子，缺氧條件下其表達量升高，能夠激活多個基因的轉錄、增加蛋白產物氧輸送、促進代謝進程以適應低氧環境。HIF-1α和VEGF均為PI3K-Akt低氧相關信號通路的下游因子[23]，低氧可激活PI3K-Akt通路，VEGF和HIF-1α mRNA高表達是低氧誘導細胞損傷模型建立的關鍵指標。

本研究進行PPI網絡分析發現了處于核心位置的關鍵基因HPCA、MT3和NOS3，其中HPCA基因編碼的蛋白質是視網膜和大腦中發現的神經元特異性鈣結合蛋白家族成員，在光感受器細胞中以鈣敏感方式調節光信號轉導。而低氧環境下，細胞內的鈣穩態極易被破壞，因此HPCA基因的表達易受缺氧的影響[27]；MT3基因在缺氧環境中易被誘導而表達升高，參與細胞抗氧化應激和凋亡，該基因表達的蛋白可保護細胞免受低氧損傷[28]；NOS3基因主要參與精氨酸和脯氨酸的代謝及氧化應激，可以促進NO的產生，通過cGMP介導的信號轉導通路參與血管平滑肌松弛過程，在缺血、缺氧時，通過調節活性氮與活性氧來減少細胞因缺血受到的損傷[29]。這些基因的功能主要與應對氧化應激相關。

本研究中低氧處理8 h與24 h測序重合的9個基因中，除TFRC、RORC基因可能參與低氧反應，其余基因有關低氧方面的研究較少，與低氧誘導細胞損傷、代謝進程等無明顯直接關系，因此本研究中選擇可能與低氧相關的基因進行實時熒光定量PCR驗證，實驗結果與測序結果一致。其中黃體酮誘導的蛻膜蛋白由DEPP1基因編碼，參與低氧反應與自噬等細胞途徑的激活，其表達受氧化應激調控[30]；RORC基因可有效抑制HIF-1α的活性，并調控其轉錄表達，抑制腫瘤細胞的增生[31]；NDRG1在缺氧條件下表達明顯上調，在調節細胞分化、增生、凋亡、血管生成、腫瘤進展方面發揮重要作用[32]；HILPDA是一種與缺氧誘導脂滴形成相關的基因，參與肝細胞、脂肪細胞、巨噬細胞以及腫瘤細胞等脂質代謝進程[33]；NPPB、PDZK1和TCEA3也多參與代謝、細胞的生長與分化等進程。TFRC是參與鐵代謝的關鍵因子[34]，參與鐵死亡過程，低氧環境下TFRC mRNA的表達受HIF-1α的調節。因此進一步研究鐵死亡信號通路在低氧誘導細胞損傷中的作用，將成為我們后續研究的重點之一。

本實驗不僅在分子水平上進行驗證，還對低氧處理后ARPE-19細胞狀態的變化進行表型研究。本實驗推測，24～48 h的細胞可能處于對數生長期，此時細胞增生較多，密度增加；隨著缺氧時間的延長，細胞活力逐漸下降，至48 h出現細胞死亡，此時細胞增生能力也逐漸降低，細胞密度緩慢增加。本實驗方案起始狀態細胞密度為2×104個/孔，相對較少。隨著觀察時間的延長，細胞會有不同程度的增生。此時會出現細胞活性減弱，密度增加的現象。

本研究方法學的局限性：(1)缺血、缺氧性視網膜疾病發病機制復雜，體外細胞實驗的培養環境及培養條件不能完全模擬體內缺氧情況，還需通過動物實驗進一步驗證；(2)采用生物信息學方法分析低氧相關基因及信號通路的改變，但未對這些基因及信號通路做更深入的研究，仍需要進一步實驗探索。

綜上所述，本研究推測cGMP-PKG、PI3K-Akt、細胞凋亡、鐵死亡信號通路參與了ARPE-19細胞的低氧反應，DEPP1、NPPB、PDZK1、HILDA、TCEA3、NDRG1、RORC、TFRC和NQO1基因可能在ARPE-19細胞應對低氧損傷中起到關鍵作用。HPCA、MT3和NOS3基因可作為研究缺血、缺氧相關眼底病的潛在功能性靶基因。這些通路及基因與缺氧誘導的細胞損傷有一定相關性，在視網膜缺血、缺氧疾病的病理過程中發揮重要作用，有望成為治療缺血、缺氧性視網膜疾病的新靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突