全反式視黃酸誘導(dǎo)ARPE-19細胞凋亡的信號途徑

吳娟 崔冬梅 楊曉 曾駿文

中山大學(xué)中山眼科中心 眼科學(xué)國家重點實驗室，廣州 510060

視覺循環(huán)也被稱為類維生素A循環(huán)，是人類視覺的基礎(chǔ)。全反式視黃酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A的代謝產(chǎn)物[1]，對維生素A的代謝是視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞的主要功能之一[2-3]。RPE細胞也可為光感受器細胞提供營養(yǎng)，維持光感受器外段的日常吞噬作用，使其保持興奮性并實現(xiàn)自我更新[4-5]。由于光感受器外段的吞噬作用、特殊的解剖位置和高代謝活性，RPE細胞尤其容易受到損害[6]。研究發(fā)現(xiàn)，ATRA在RPE細胞內(nèi)的過度積累可引起細胞毒性并導(dǎo)致細胞凋亡[7-8]，使眼底發(fā)生變性疾病。既往研究表明，由ATRA誘導(dǎo)并通過NADPH氧化酶介導(dǎo)的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)參與了光感受器和RPE細胞的變性退化[9]，但關(guān)于RPE細胞變性的分子機制仍不清楚。本研究擬探討ATRA體外誘導(dǎo)ARPE-19細胞凋亡的信號途徑，以期為視網(wǎng)膜病變中ATRA的毒性作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

ARPE-19細胞系購自美國ATCC細胞庫。DMEM/F12培養(yǎng)基、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraadetic acid，EDTA)(美國Gibco公司)；胎牛血清(bovine serum albumin，BSA)、ATRA、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美國Sigma公司)；青鏈霉素(100 μg/ml)、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK8)(日本Dojindo公司)；膜聯(lián)蛋白V-熒光素異硫氰酸鹽(annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin-V)凋亡試劑盒(美國Becton公司)；Multicaspase分析試劑盒(MCH100109)、ROS檢測試劑盒、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(美國Merck Millipore公司);Powerwave XS微孔板分光光度計(美國BioTek公司)；Brilliant SYBR Green試劑盒(日本Takara公司)；引物序列(上海Sangon Biotech公司)；RIPA裂解緩沖液(上海碧云天公司)；兔源caspase 12單克隆抗體(ab62484)、兔源caspase 3單克隆抗體(ab90437)(美國Abcam公司)；兔源caspase 8單克隆抗體(#4790)、兔源caspase 9單克隆抗體(ab669514)、兔源cleaved caspase 3單克隆抗體(#9964)、兔源GAPDH單克隆抗體(#5174)(美國Cell Signaling Technology公司)。流式細胞儀(美國Beckman公司)；ECL蛋白印跡檢測系統(tǒng)(美國Millipore公司)；酶標(biāo)儀(日本Olympus公司)；Quantity One成像軟件、實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) ARPE-19細胞用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% BSA、青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換1次培養(yǎng)基。采用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化2 min，在25 mm2培養(yǎng)瓶中以1∶ 4～1∶ 6傳代培養(yǎng)。在100 mm2培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至70%～80%融合，提取蛋白質(zhì)。

1.2.2ATRA制備 將ATRA溶解于DMSO至1×10-2mol/L，分裝成10 ml于-20 ℃下冷凍保存，避光，使用前使用DMEM/F12稀釋ATRA至工作濃度。

1.2.3ARPE-19細胞形態(tài)變化觀察 將ARPE-19細胞以2.5×105/ml密度接種于6孔板，分別采用0、2.5、5、10和20 μmol/L ATRA處理細胞24 h，觀察不同ATRA濃度下ARPE-19細胞形態(tài)變化。

1.2.4CCK-8法檢測細胞存活率 將ARPE-19細胞以5×104/ml密度接種至96孔板中，培養(yǎng)基為100 μl。在含有10% BSA的DMEM/F12培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)24 h后，分別添加0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 μmol/L ATRA進行實驗，其中不添加ATRA者設(shè)為空白對照組。培養(yǎng)24 h或48 h后，去除上清液，每孔加入含有10 μl CCK8的DMEM/F12 100 μl,在37 ℃下再培養(yǎng)4 h。采用CCK-8法檢測細胞增生情況，使用微孔板閱讀器在450 nm處測量吸光度(A)值。所有實驗均獨立重復(fù)3次。CCK-8細胞存活率=(實驗孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)×100%。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平 采用Annexin-V凋亡試劑盒檢測細胞凋亡水平。取ARPE-19細胞以2.5×105/ml密度接種于6孔板，分別采用0、2.5、5、10、15和20 μmol/L ATRA處理細胞，其中不添加ATRA者設(shè)為空白對照組，處理24 h后收集細胞培養(yǎng)液備用，使用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗1次，離心半徑13.5 cm，1 000 r/min離心3 min收集細胞，預(yù)冷PBS洗1次，收集細胞并將其懸浮在含有Annexin-V和碘化丙啶(propidium iodide，PI)的1倍結(jié)合緩沖液中30 min，用流式細胞儀在488 nm激發(fā)波長下檢測紅色熒光及光散射情況，根據(jù)陰性對照組設(shè)定陰性對照區(qū)，檢測各分區(qū)的數(shù)值，所有實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞multicaspase水平 采用Multicaspase分析試劑盒快速測定caspase的激活、細胞質(zhì)膜滲透和細胞死亡情況。取ARPE-19細胞以2.5×105/ml密度接種于6孔板，分別采用0、2.5、5、10和20 μmol/L ATRA處理細胞，其中不添加ATRA者設(shè)為空白對照組，處理后24 h收集細胞培養(yǎng)液備用，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化收集細胞，用預(yù)冷PBS洗1次，1 000 r/min離心3 min收集細胞，預(yù)冷PBS洗1次，每組加入含有7-氨基放線菌素D(7-Aminoactinomycin D，7-AAD)和PI的1倍結(jié)合緩沖液，孵育30 min，用流式細胞儀在488 nm激發(fā)波長下檢測紅色熒光及光散射情況，根據(jù)陰性對照組設(shè)定陰性對照區(qū)，檢測各分區(qū)的數(shù)值，列入統(tǒng)計計算的為死細胞區(qū)+晚凋細胞區(qū)+早凋細胞區(qū)，所有實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.7流式細胞術(shù)檢測細胞ROS水平 采用DCFH-DA染色法檢測總ROS水平。取ARPE-19細胞以2.5×105/ml密度接種于6孔板，分別采用0、2.5、5、10和20 μmol/L ATRA處理細胞，其中不添加ATRA者設(shè)為空白對照組，處理后24 h收集細胞培養(yǎng)液備用，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化收集細胞，用預(yù)冷PBS洗1次，1 000 r/min離心3 min，收集細胞，預(yù)冷PBS洗1次，每組加入1 μmol/L ROS和熒光探針DCFH-DA孵育30 min，用流式細胞儀在488 nm激發(fā)波長下檢測紅色熒光及光散射情況，紅色波形代表ROS陽性細胞，熒光染色陽性數(shù)值即為ROS水平。所有實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.8實時熒光定量PCR檢測caspase相關(guān)靶基因mRNA相對表達量 取ARPE-19細胞以2.5×105/ml密度接種于6孔板，分別采用0、2.5、5、10和20 μmol/L ATRA處理細胞，其中不添加ATRA者設(shè)為空白對照組，處理后24 h收集細胞培養(yǎng)液備用，使用Trizol試劑提取細胞總RNA，采用Brilliant SYBR Green試劑盒進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列由中國上海Sangon Biotech公司提供(表1)。空白對照組(無cDNA)每個基因沒有擴增，Ct值大于33。對至少3個不同的實驗樣品進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，并對每個樣品進行3次評估。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算每個靶基因的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of quantitative real-time PCR基因基因庫號碼引物序列(5’-3’)擴增片段長度(bp)Caspase 3 NM_004346 正向:CATGGAAGCGAATCAATGGACT反向:CTGTACCAGACCGAGATGTCA139 Caspase 8 NM_033356 正向:GTTGTGTGGGGTAATGACAATCT反向:TCAAAGGTCGTGGTCAAAGCC222 Caspase 9 NM_001229.4 正向:CTCAGACCAGAGATTCGCAAAC反向:GCATTTCCCCTCAAACTCTCAA116 Caspase 12 NM_001191016.2 正向:AACAACCGTAACTGCCAGAGT反向:CTGCACCGGCTTTTCCACT118 GAPDH NM_001256799.2 正向:GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT反向:GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG197 注:PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶 Note:PCR:polymerase chain reaction;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

1.2.9Western blot法檢測caspase相關(guān)靶蛋白相對表達量 采用0、2.5、5、10、15和20 μmol/L ATRA處理ARPE-19細胞后24 h收集細胞，PBS洗滌后RIPA裂解緩沖液溶解細胞，用SDS-PAGE凝膠電泳。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并在室溫下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶封閉1 h。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% BSA稀釋caspase 12(1∶ 1 000)、caspase 3(1∶ 1 000)、caspase 8(1∶ 1 000)、caspase 9(1∶ 1 000)、cleaved caspase 3(1∶ 1 000)、GAPDH(1∶ 500)抗體，搖床上孵育30 min，4 ℃過夜，孵育時間不少于12 h，TBST洗膜5 min共3次。置于HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗中搖床上孵育1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，使用Bio-Rad Quantity One成像軟件分析條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件和GraphPad Prism 6圖形軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。計量資料數(shù)據(jù)經(jīng)W檢驗證實呈正態(tài)分布，以mean±SD表示；經(jīng)Levene檢驗方差齊性。各組細胞生存率和凋亡率、multicaspase水平、ROS水平及caspase相關(guān)mRNA和蛋白相對表達量總體比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度ATRA對ARPE-19細胞活性的影響

ARPE-19細胞在ATRA濃度為2.5 μmol/L和5 μmol/L時形態(tài)保持正常，10 μmol/L時細胞開始皺縮，20 μmol/L時細胞皺縮明顯，數(shù)量顯著下降(圖1)。CCK-8法檢測結(jié)果提示，不同濃度ATRA處理ARPE-19細胞24 h和48 h細胞存活率總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=176.60、350.30，均P<0.01)。2 μmol/L、6 μmol/L ATRA組細胞培養(yǎng)24 h和48 h后細胞存活率較空白對照組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；細胞培養(yǎng)24 h時，12、14、16、18、20 μmol/L ATRA組細胞存活率低于空白對照組，細胞培養(yǎng)48 h時，10、12、14、16、18、20 μmol/L ATRA組細胞存活率低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)；20 μmol/L ATRA處理24 h后細胞存活率下降到30%以下(表2)。ATRA對細胞存活具有劑量依賴性，高劑量抑制細胞存活，ATRA處理24 h和48 h后的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)分別為13.88 μmol/L和11.99 μmol/L，選擇處理24 h進行后期實驗。

圖1 不同濃度ATRA處理ARPE-19細胞24 h細胞形態(tài)變化(標(biāo)尺=50 μm) A：0 μmol/L ATRA B：2.5 μmol/L ATRA C：5 μmol/L ATRA D：10 μmol/L ATRA E：20 μmol/L ATRA

表2 不同濃度ATRA處理ARPE-19細胞后不同時間點細胞存活率比較(mean±SD,%)Table 2 Comparison of cell survival rates of ARPE-19 cells treated with different concentrations of ATRA at different time points(mean±SD,%)ATRA濃度(μmol/L)樣本量不同時間點細胞存活率24h48h03100.00±0.00100.00±0.0023108.33±3.51a131.67±9.07a43107.33±6.11107.67±6.0263111.33±6.51a128.00±11.27a83105.00±7.00101.00±1.7310398.00±4.3676.00±2.64a12378.67±8.62a40.67±5.51a14334.93±2.57a25.67±4.51a16327.00±1.00a20.57±2.54a18316.34±5.51a16.73±1.72a20326.33±3.51a9.08±1.30aF值176.60350.30P值<0.01<0.01 注:與各自0μmol/L ATRA(空白對照)組比較,aP<0.01(單因素方差分析,Dunnett-t檢驗) ATRA:全反式視黃酸 Note:Compared with the respective 0μmol/L ATRA (blank control) group,aP<0.01 (One way ANOVA,Dunnett-t test) ATRA:all-trans retin-oic acid

2.2 不同濃度ATRA對ARPE-19細胞凋亡及細胞中multicaspase和ROS水平的影響

0、2.5、5、10、15、20 μmol/L ATRA處理后 ARPE-19細胞凋亡率分別為(7.52±0.00)%、(5.81±0.13)%、(3.93±0.07)%、(19.31±4.47)%、(51.79±7.35)%和(56.42±6.69)%，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=86.39,P<0.01),其中2.5 μmol/L和5 μmol/L ATRA組細胞凋亡率較空白對照組明顯下降，10、15和20 μmol/L ATRA組細胞凋亡率呈濃度依賴性升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01),當(dāng)ATRA濃度高于10 μmol/L時，細胞凋亡率明顯上調(diào)。不同濃度ATRA處理ARPE-19細胞24 h后細胞multicaspase和ROS相對表達量總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=166.84、101.40,均P<0.01)。2.5、5、10、20 μmol/L ATRA組multicaspase和ROS的相對表達量均較空白對照組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)(圖2，表3)。

圖2 流式細胞儀檢測不同濃度ATRA組ARPE-19細胞凋亡及細胞中multicaspase、ROS水平 A：凋亡水平檢測 B：multicaspase水平檢測 C：ROS水平檢測 7-AAD：7-氨基放線菌素D；ROS：活性氧簇；ATRA：全反式視黃酸

2.3 不同濃度ATRA處理ARPE-19細胞中caspase相關(guān)靶基因mRNA和蛋白相對表達量比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，不同濃度ATRA組caspase 8蛋白相對表達量總體比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.91，P=0.06)；caspase 9、caspase 12、caspase 3、cleaved-caspase 3蛋白相對表達量總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.31、8.19、3.78、138.51，均P<0.05)。與空白對照組比較，2.5、5、10、15、20 μmol/L ATRA組caspase 9蛋白相對表達量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)；2.5 μmol/L ATRA組caspase 12蛋白相對表達量升高，5、10、15、20 μmol/L ATRA組逐漸降低，2.5、15、20 μmol/L ATRA組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與空白對照組比較，5、10、20 μmol/L ATRA組caspase 3蛋白相對表達量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與空白對照組比較，2.5、5、10、15、20 μmol/L ATRA組cleaved caspase 3蛋白相對表達量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)(圖3，表4)。

圖3 Western blot法檢測不同濃度ATRA組caspase 8、caspase 9、caspase 12、caspase 3及cleaved caspase 3表達水平 1：0 μmol/L ATRA組；2：2.5 μmol/L ATRA組；3：5 μmol/L ATRA組；4：10 μmol/L ATRA組；5：15 μmol/L ATRA組；6：20 μmol/L ATRA組 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

表4 不同濃度ATRA處理ARPE-19細胞的caspase相關(guān)蛋白相對表達量比較(mean±SD)Table 4 Comparison of relative expression levels of caspase related proteins in ARPE-19 cells among different concentrations of ATRA treatment (mean±SD)ATRA濃度(μmol/L)樣本量不同蛋白相對表達量caspase 8caspase 9caspase 12caspase 3cleaved caspase 3031.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.002.531.07±0.251.34±0.19a1.27±0.04a1.19±0.181.91±0.02a531.29±0.191.71±0.21a0.95±0.271.57±0.29a3.12±0.09a1031.18±0.211.92±0.13a0.69±0.241.49±0.20a2.38±0.22a1530.78±0.161.42±0.12a0.68±0.09a1.16±0.252.43±0.15a2031.09±0.121.58±0.26a0.59±0.08a1.46±0.17a2.94±0.02aF值2.9110.318.193.78138.51P值0.06<0.01<0.010.03<0.01 注:與各自0μmol/L ATRA(空白對照)組比較,aP<0.05(單因素方差分析,Dunnett-t檢驗) ATRA:全反式視黃酸 Note:Compared with the respective 0μmol/L ATRA (blank control) group,aP<0.05 (One way ANOVA,Dunnett-t test) ATRA:all-trans retinoic acid

表3 不同濃度ATRA處理后ARPE-19細胞中multicaspase、ROS相對表達量比較(mean±SD)Table 3 Comparison of relative expression levels of multicaspase,ROS in ARPE-19 cells among different concentrations of ATRA treatment (mean±SD)ATRA濃度(μmol/L)樣本量multicaspase相對表達量ROS相對表達量032.71±0.080.39±0.012.535.62±0.57a0.71±0.01a5320.42±2.77a2.12±0.08a10351.90±5.92a11.63±1.62a20370.73±6.09a23.38±3.46aF值166.84101.40P值<0.01<0.01 注:與各自0μmol/L ATRA(空白對照)組比較,aP<0.05(單因素方差分析,Dunnett-t檢驗) ATRA:全反式視黃酸;ROS:活性氧簇 Note:Compared with the respective 0μmol/L ATRA (blank control) group,aP<0.01 (One way ANOVA,Dunnett-t test) ATRA:all-trans retin-oic acid;ROS:reactive oxygen species

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，不同濃度ATRA組caspase 8 mRNA相對表達量總體比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.02，P=0.07)，caspase 9、caspase 12、caspase 3 mRNA相對表達量總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=212.90、60.85、32.77，均P<0.01)。與空白對照組比較，2.5、5、10、20 μmol/L ATRA組caspase 9 mRNA相對表達量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)；2.5 μmol/L及5 μmol/L ATRA組caspase 9 mRNA相對表達量逐漸升高，隨著濃度繼續(xù)升高其相對表達量逐漸下降；2.5、5、10、20 μmol/L ATRA組caspase 12 mRNA相對表達量較空白對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，2.5、5及10 μmol/L ATRA組其相對表達量逐漸升高，20 μmol/L ATRA組其相對表達量輕度下降；5 μmol/L、10 μmol/L ATRA組caspase 3 mRNA相對表達量較空白對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)；ATRA濃度小于10 μmol/L時，caspase 9和caspase 12的mRNA相對表達量呈濃度依賴性升高，當(dāng)濃度達20 μmol/L時，其相對表達量呈下降趨勢(表5)。

表5 不同濃度ATRA處理ARPE-19的caspase 8、caspase 9、caspase 12、caspase 3 mRNA相對表達量比較(mean±SD)Table 5 Comparison of the relative expression levels of caspase 8,caspase 9,caspase 12 and caspase 3 mRNA in ARPE-19 cells among different concentrations of ATRA treatment (mean±SD)ATRA濃度(μmol/L)樣本量不同mRNA相對表達量caspase 8caspase 9caspase 12caspase 3031.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.002.530.97±0.034.49±0.19a1.73±0.19a1.02±0.10531.16±0.2016.33±1.60a2.16±0.26a1.23±0.04a1031.18±0.0811.30±0.66a4.98±0.73a1.26±0.04a2031.03±0.061.78±0.23a2.63±0.70a0.83±0.04aF值3.02212.9060.8532.77P值0.07<0.01<0.01<0.01 注:與各自0μmol/L ATRA(空白對照)組比較,aP<0.01(單因素方差分析,Dunnett-t檢驗) ATRA:全反式視黃酸 Note:Compared with the respective 0μmol/L ATRA (blank control) group,aP<0.01(One way ANOVA,Dunnett-t test) ATRA:all-trans retinoic acid

3 討論

ATRA是視覺循環(huán)中不可缺少的部分，但是過度累積也會造成光感受器細胞和RPE細胞的凋亡。作為視網(wǎng)膜內(nèi)的一種內(nèi)源性化合物，ATRA可通過視黃醛脫氫酶還原而被清除，或形成一系列困在RPE細胞溶酶體中的視網(wǎng)膜衍生物[10-11]。其可以解釋RPE細胞對低濃度的ATRA耐受，光感受器細胞和RPE細胞有一套內(nèi)在的機制清除游離ATRA，但當(dāng)ATRA過度累積會導(dǎo)致RPE細胞受損，最終引起細胞凋亡。

本課題組之前的研究已證實，1×10-9～1×10-6mol/L ATRA可激活A(yù)RPE-19細胞中的絲裂原活化蛋白激酶途徑，從而調(diào)節(jié)細胞增生[12]，推測低濃度ATRA可能促進細胞增生，減少細胞凋亡，與本研究中低濃度ATRA降低凋亡水平結(jié)果相符。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，隨著ATRA濃度的升高，multicaspase水平及ROS水平顯著升高。Western blot及實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，caspase 9、caspase 12、caspase 3及cleaved caspase 3分子在凋亡過程中被激活，而caspase 8分子未被激活，說明ATRA過量累積激活了ARPE-19細胞內(nèi)源性caspase依賴性凋亡途徑。

氧化應(yīng)激可由ROS引起，持續(xù)過度的ROS產(chǎn)生和有限的抗氧化屏蔽可產(chǎn)生氧化應(yīng)激，與各種生物反應(yīng)，如凋亡相關(guān)[13-14]。研究表明，過多的ROS可引起線粒體功能紊亂，導(dǎo)致線粒體膜電位耗散和細胞凋亡[14]。先前的研究表明，經(jīng)ATRA處理的細胞表現(xiàn)出明顯的線粒體膜電位下降[15]。任何通過線粒體呼吸鏈的電子傳遞損傷都會導(dǎo)致氧的不完全還原，最終導(dǎo)致ROS的形成[16]，這可以解釋ROS在線粒體中定位的原因。ATRA誘導(dǎo)線粒體中的ROS過度產(chǎn)生可能是直接導(dǎo)致線粒體功能障礙的另一種途徑。

細胞凋亡包括內(nèi)源性途徑(線粒體途徑)、外源性途徑、細胞毒性CD8+T細胞介導(dǎo)途徑和caspase途徑，所有途徑均以caspase激活為最終手段。細胞凋亡過程中caspase活化和線粒體釋放細胞色素C(cytochrome C，CytC)的相對時間決定了細胞凋亡的2條主要途徑：(1)外源途徑 通過激活死亡受體，效應(yīng)器caspase在線粒體改變之前被激活；(2)內(nèi)在途徑 CytC在caspase激活之前從線粒體膜間隙釋放。值得注意的是，caspase 3是最重要的效應(yīng)蛋白caspase，2種途徑通過caspase 3融合[17-18]。

Caspase是含有半胱氨酸蛋白酶的一個促細胞凋亡家族，該家族通常以無活性酶原形式存在于細胞中，由于caspase可自我活化并能相互激活，因此凋亡過程一旦觸發(fā)，即呈級聯(lián)放大效應(yīng)。Caspase 9位于級聯(lián)反應(yīng)上游，當(dāng)?shù)蛲銎鹗夹盘栕饔糜诰€粒體后，引起線粒體釋放CytC，接著CytC與凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor，Apaf-1)結(jié)合并使Apaf-1構(gòu)象改變形成八聚體，后者與caspase 9結(jié)合并誘導(dǎo)其發(fā)生自我催化，活化的caspase 9進一步激活下游的caspase，使級聯(lián)反應(yīng)進一步放大，因此caspase 9是細胞線粒體依賴的凋亡途徑中重要起始因子[19]。Canton等[20]用補骨脂素聯(lián)合A波段紫外線的暴露療法處理淋巴細胞株Jurkat細胞發(fā)現(xiàn)，caspase 9激活與線粒體功能障礙密切相關(guān)。

Rao等[21]用布雷菲德菌素A和毒胡蘿卜素作用于293T細胞時發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最后引起細胞凋亡，經(jīng)檢測caspase 12的含量明顯增加，而用三苯氧胺誘導(dǎo)的細胞凋亡并未引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，相應(yīng)的caspase 12含量未發(fā)生變化。Nakagawa等[22]研究發(fā)現(xiàn)，減少體外培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞氧和葡萄糖的攝入，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致caspase 12被切割成了許多片段而被激活。這些研究結(jié)果都證明，caspase 12的激活是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡途徑之一，其可以引起其他caspase家族活化。Sanges等[23]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)視網(wǎng)膜出現(xiàn)變性時，細胞內(nèi)部出現(xiàn)鈣離子儲存失衡，導(dǎo)致鈣蛋白酶激活，影響線粒體系統(tǒng)導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)因子產(chǎn)生，同時影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生caspase 12。本研究中，ATRA誘導(dǎo)后caspase 12蛋白表達量下降，mRNA表達量上升，說明在凋亡過程中，caspase 12很有可能激活后被切割成了片段，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。Datta等[24]研究證實，激活的caspase 12從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入到細胞液中作用于caspase 9，激活caspase 3最后引起細胞凋亡。Hitomi等[25]也認為，caspase 12直接激活了caspase 3最后引起細胞凋亡。在所有caspase家族中，最頻繁激活的是caspase 3，進而形成cleaved caspase 3，其催化主要細胞蛋白的分裂和染色質(zhì)的凝聚。Caspase還可激活DNA酶，該酶通過核間小體碎片化導(dǎo)致DNA斷裂[26]。本研究結(jié)果顯示，ATRA處理后cleaved caspase 3蛋白相對表達量大幅上調(diào)，說明最終caspase 3的激活，導(dǎo)致細胞凋亡。

有研究證實，ATRA介導(dǎo)過度產(chǎn)生的ROS是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)RPE細胞凋亡的早期事件，通過抗氧化劑清除ROS可能是保護細胞凋亡的有效策略[27]。盡管ATRA對視力的維持是必不可少的，但這種分子在RPE細胞內(nèi)的過度積累會導(dǎo)致細胞毒性。本研究結(jié)果顯示，ATRA體外誘導(dǎo)ARPE-19細胞凋亡是通過激活ROS及內(nèi)源性caspase依賴性凋亡途徑導(dǎo)致的。這些途徑的誘導(dǎo)導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS水平升高，線粒體膜電位降低，進而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和caspase依賴途徑的激活，最終導(dǎo)致細胞死亡。本研究擴大了我們對ATRA對人RPE細胞毒性的認識，其特征是ATRA清除延遲，在減輕ATRA對細胞器有害作用的基礎(chǔ)上，為RPE細胞的靶向治療開辟了新的途徑。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突