高度近視患者房水非標記定量蛋白質組學分析

薛敏 任新軍 柯屹峰 劉巨平 范小娥 李筱榮

天津醫科大學眼科醫院 天津醫科大學眼視光學院 天津醫科大學眼科研究所 天津市視網膜功能與疾病重點實驗室 天津市眼科學與視覺科學國際聯合研究中心 300384

高度近視是指近視屈光度>-6.00 D、眼軸長度>26.5 mm的屈光狀態，隨著眼軸長度的增加可導致后鞏膜葡萄腫、脈絡膜新生血管、脈絡膜/視網膜退行性病變等并發癥，從而嚴重影響視力，是低視力和致盲的主要原因之一[1]。據估計，到2050年，全球高度近視患者將達到9.38億人，造成嚴重的經濟和社會負擔[2]。高度近視的確切發病機制尚未完全闡明，這也是目前仍缺乏有效防治近視措施的根本原因。近年來，蛋白質組學技術的發展為探索高度近視的病理機制提供了新的思路。非標記蛋白質組學技術是一種不依賴于同位素標記的新型蛋白質定量技術，利用液相色譜和質譜串聯對蛋白質酶解肽段進行分析，比較不同樣本中相應肽段的信號強度，通過解析質譜數據對相應的蛋白質進行定量鑒定，已廣泛應用于疾病標志物篩選、疾病發病機制探索、新藥開發等生物醫學領域[3-4]。房水是一種重要的眼內液，對維持眼的正常功能有重要意義，主要參與眼組織的物質代謝及免疫反應[5]。在眼部疾病發生和發展過程中，房水中的蛋白質成分也會發生變化，并且與疾病的發病機制和/或預后有關[6-8]。探討高度近視眼房水蛋白組學變化能為深入了解高度近視的發病機制及開展高度近視的精準防控提供重要參考，但目前關于房水蛋白質組學變化與高度近視發生和發展的關系鮮見報道。本研究利用非標記定量蛋白質組學技術測定高度近視患者房水中蛋白質組學變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源及分組 于2019年1—8月連續收集在天津醫科大學眼科醫院接受超聲乳化晶狀體摘出聯合人工晶狀體植入術的68例68眼年齡相關性白內障患者的房水標本，其中合并高度近視者和單純年齡相關性白內障者各34例34眼，分別作為高度近視白內障組和單純白內障組。使用rpwr功能分析R軟件包計算樣本量，當功效水平=0.8、效應值=0.5、顯著性水平=0.05時，n=11.92。考慮到臨床樣本研究中可能存在較大的個體差異，將樣本量擴大到每組16例16眼進行房水蛋白質譜檢測分析，另取每組18例18眼采用ELISA法對質譜法測定數據進行驗證。高度近視白內障組納入標準：眼軸長度≥26.5 mm，近視屈光度>-6.00 D，明顯豹紋樣眼底改變。單純白內障組納入標準：眼軸長度為22.0～24.0 mm，屈光度<-0.5 D，不伴有任何眼底病變。排除標準：有眼外傷史者；有高度近視相關并發癥治療史者；有除白內障或高度近視外的其他眼病者；使用全身抗代謝藥物、免疫抑制劑或糖皮質激素等者。2個組患者性別構成比、年齡比較差異均無統計學意義(均P>0.05)；眼軸長度、屈光度比較差異均有統計學意義(均P<0.05)(表1)。本研究方案經天津醫科大學眼科醫院倫理委員會審核批準[批文號：2020KY(L)-40]。所有患者對研究方法和目的知情并簽署知情同意書。

表1 2個組房水標本來源患者基線特征比較Table 1 Comparison of demography between the two groups組別例數/眼數性別構成比a(男/女,n)年齡b(mean±SD,歲)眼軸長度b(mean±SD,mm)屈光度b(mean±SD,D)LOCSⅡ高度近視白內障組16/168/858.3±4.028.23±1.26-12.12±2.83C2N2P2單純白內障組16/167/956.9±5.823.27±0.53-0.14±0.31C2N2P2χ2/t值0.1250.95017.160-34.346-P值0.7230.350<0.01<0.01- 注:(a: χ2檢驗;b:獨立樣本t檢驗) LOCSⅡ:晶狀體混濁程度分類系統Ⅱ;-:未進行統計學分析 Note:(a:χ2 test;b:Independent-samples t test) LOCSⅡ:lens opacities classification system Ⅱ;-:statistical analysis not performed

1.1.2主要試劑及儀器 鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天制藥株式會社)；質量分數0.5%聚維酮碘溶液(上海利康消毒高科技有限公司)；BCA試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海酶聯生物有限公司)；胰蛋白酶(美國Promega公司)。裂隙燈顯微鏡(日本Topcon公司)；雙目間接檢眼鏡(德國Keeler公司)；IOLMaster光學生物測量儀、手術顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；Nanodrop分光光度計(美國Thermo公司)；Ekspertnano LC 415液相色譜、TripleTOF 6600質譜系統(美國AB SCIEX公司)。

1.2 方法

1.2.1房水樣本的收集及處理 (1)標本收集 術眼采用鹽酸奧布卡因滴眼液點眼行表面麻醉，采用0.5%聚維酮碘溶液沖洗結膜囊2次，平衡鹽溶液充分沖洗結膜囊。為了避免血紅蛋白及其他眼表污染物，在行任何眼內操作之前于手術顯微鏡下用1 ml結核菌素注射器在透明角膜緣處穿刺進入前房，采集房水標本100 μl，迅速轉移至EP管中，-80 ℃凍存備用。(2)樣品的制備 在50 μl房水中加入8 mol/L尿素裂解液350 μl，室溫下裂解5 min。冰上超聲破碎，超聲能量比例為35%，超聲3 s后停3 s，間斷超聲2 min。15 ℃下16 000×g離心10 min。取上清，采用BCA試劑盒測定房水標本中蛋白濃度。取100 μg蛋白，加入濃度為1 mol/L的二硫蘇糖醇1 μl，37 ℃孵育1 h。加入濃度為1 mol/L的吲哚乙酸4 μl，避光、37 ℃孵育1 h。平衡相對質量分數10 000超濾管1次(加入濃度為50 mmol/L的碳酸氫銨400 μl，14 000×g離心10 min)，加入100 μg還原烷基化后的樣本，15 ℃下14 000×g離心20 min，加入400 μl碳酸氫銨清洗3次，更換收集管，加入50 μl碳酸氫銨至超濾管中，加入2 μg測序級胰蛋白酶，37 ℃孵育12～16 h。用移液槍混勻超濾管中的樣本，4 ℃下14 000×g離心20 min，加50 μl碳酸氫銨沖洗3次，向收集管中加入體積分數1%的甲酸終止酶切，60 ℃下真空蒸干。取12 μl體積分數0.1%甲酸重懸樣本，Nanodrop分光光度計測量濃度，取等量的肽段進行質譜檢測。

1.2.2非標記液相色譜串聯質譜法檢測房水標本中差異表達蛋白 采用Ekspertnano LC 415液相色譜和TripleTOF 6600質譜系統鑒定房水中蛋白質。用上樣緩沖液(體積分數0.1%甲酸、2%乙腈、97.9%水)將2 μg酶切后的肽段載入到C18填充的離子阱上(100 μm×2 cm，填料規格為3 μm，120 A)。使用梯度緩沖液(0.1%甲酸、97.9%乙腈、2%水)洗脫離子阱，肽段經過C18填充的柱子后(150 μm×15 cm，填料規格為1.9 μm，120 A)，形成帶電的離子噴霧，離子噴霧進入質譜進行檢測。梯度緩沖液的有效洗脫梯度為5%～35%，有效時間為91 min，流速為400 nl/min。質譜參數：飛行時間質譜累加時間為0.25 s，質量掃描范圍為300～1 500 m/z，電荷選擇+2～+5價離子，質量偏差50 ppm以內，每個循環內最大監測離子數為60，每次檢測隔離已檢測離子16 s，碎裂能量模式選擇動態碎裂模式。產物離子累加時間為0.04 s，采用高靈敏掃描模式。采用Maxquant軟件(版本1.6.3.4)對質譜采集的原始數據進行Uniprot人類數據庫的搜索。對人類數據庫搜索后的數據進行統計分析，篩選P值<0.05且差異倍數大于2的差異表達蛋白，對每個可定量蛋白的變化倍數以2為底數取對數作為橫坐標，將P值以10為底數取負對數作為縱坐標得到差異表達蛋白的火山圖。

1.2.3生物信息學法對房水中差異表達蛋白進行分析 為進一步探索差異表達蛋白的功能，用基因本體(Gene Ontology，GO)(http://geneontology.org/)功能注釋對差異表達蛋白進行生物學過程、分子功能和細胞成分功能分析。進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)通路注釋分析，以深入了解這些差異表達蛋白參與的重要代謝和/或信號轉導通路。

1.2.4ELISA法對質譜測定的數據進行驗證 從主要差異表達蛋白中隨機選取3個蛋白(C8B、DAG1、TGFBI)，采用ELISA法對質譜測定的數據進行驗證。步驟如下：(1)標準品的加樣 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μl；(2)加樣 分別設空白孔和待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，再加待測樣品10 μl。(3)加酶 每孔加入酶標試劑100 μl，空白孔除外。(4)溫育 用封板膜封板后37 ℃溫育60 min。(5)配液 將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。(6)洗滌 小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次，拍干。(7)顯色 每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。(8)終止 每孔加終止液50 μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。(9)測定 以空白孔調零，波長450 nm處依序測量各孔的吸光度(A)值。測定應在加終止液后15 min以內進行。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析，計量資料經Kolmogorov-Smirnov檢驗證實符合正態分布，以mean±SD表示，計數資料采用頻數和百分數表示。高度近視白內障組與單純白內障組間計數資料差異比較采用χ2檢驗，組間計量資料差異比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2個組房水標本中蛋白質量濃度比較

高度近視白內障組房水標本平均蛋白質量濃度為(1 134.91±104.78)ng/L，明顯高于單純白內障組的(706.71±85.43)ng/L，差異有統計學意義(t=11.977，P<0.01)。

2.2 2個組房水標本中差異表達蛋白

2個組房水標本中共鑒定出可定量蛋白463個，高度近視白內障組與單純白內障組房水標本比較有86個差異表達蛋白，包括49個表達上調蛋白和37個表達下調蛋白。表達上調蛋白主要為單核細胞分化抗原CD14、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin-Ⅲ，SERPINC1)、補體4B(complement 4B，C4B)、C9、C8B、C3和血漿蛋白酶C1抑制劑(plasma protease C1 inhibitor，SERPING1)。表達下調蛋白主要為生長因子β誘導蛋白(transforming growth factor-β-induced protein，TGFBI)、肌營養不良蛋白相關糖蛋白1(dystroglycan 1，DAG1)、膠原蛋白4A1[collagen alpha-1(Ⅳ)chain，COL4A1]、骨橋蛋白(osteopontin，SPP1)和COL5A1等(圖1，表2)。差異表達蛋白的分類主要是蛋白結合活性調節因子(PC00095)、細胞外基質蛋白(PC00102)、載體蛋白(PC00219)、細胞間信號分子(PC00207)、蛋白質修飾酶(PC00260)和代謝物間轉換酶(PC00262)，分別占32.7%、14.5%、9.1%、9.1%、7.3%和5.5%，轉運相關蛋白(PC00227)、支架蛋白(PC00226)、細胞黏附分子(PC00069)、核酸結合蛋白(PC00171)、跨膜信號受體(PC00197)和防御/免疫蛋白(PC00090)均占3.6%(圖2)。

圖1 差異表達蛋白火山圖 藍色表示表達下調蛋白，紅色表示表達上調蛋白，灰色表示組間表達量無差異蛋白 FC：倍數變化

表2 高度近視白內障組和單純白內障組房水標本中主要差異表達蛋白情況Table 2 Main differentially expressed proteins in the aqueous humor samples between the high myopia cataract group and simple cataract group蛋白名稱差異倍數P值表達變化CD1445.230.000003上調SERPINC134.520.000230上調C4B31.420.000041上調C928.670.000354上調C8B25.760.002416上調C325.420.006834上調SERPING114.650.002546上調DAG10.020.030506下調TGFBI0.060.000436下調COL4A10.120.000013下調SPP10.100.001437下調COL5A10.230.002531下調 注:SERPINC1:抗凝血酶Ⅲ;C4B:補體4B;SERPING1:血漿蛋白C1抑制劑;DAG1:肌營養不良蛋白相關糖蛋白1;TGFBI:轉化生長因子β誘導蛋白;COL4A1:膠原蛋白4A1;SPP1:骨橋蛋白 Note:SERPINC1:antithrombin-Ⅲ;C4B:complement 4B;SERPING1:plasma protease C1 inhibitor;DAG1:dystroglycan 1;TGFBI:transforming growth factor-β-induced protein;COL4A1:collagen alpha-1(Ⅳ)chain;SPP1:osteopontin

圖2 2個組房水標本中差異表達蛋白分類 橫坐標表示差異表達蛋白的分類，縱坐標表示各分類在86個差異表達蛋白中所占數量的百分比

2.3 2個組生物信息學分析

2.3.1GO分析 86個差異表達蛋白與不同的生物學過程、分子功能和細胞成分有關，這3個方面的前10條重要功能條目和相應的差異表達蛋白數目顯示見圖3。差異表達蛋白主要富集在補體激活及其調節、細胞黏附、急性炎癥反應、細胞外基質組織、細胞蛋白代謝等生物學過程以及絲氨酸型內肽酶抑制劑活性、內肽酶抑制劑活性、肝素結合和晶狀體的結構組成等分子功能；在細胞組分方面，差異表達蛋白主要定位于細胞外基質、細胞外區域、細胞外間隙、血液微粒和細胞外囊泡等。

圖3 2個組差異表達蛋白GO分析結果 A：“生物學過程”前10條富集結果 B：“分子功能”前10條富集結果 C：“細胞組分”前10條富集結果

2.3.2KEGG分析 86個差異表達蛋白富集于12條代謝或信號轉導通路(表3)。21個差異表達蛋白富集于補體和凝血級聯通路，15個差異表達蛋白富集于細胞外基質-受體相互作用通路，8個差異表達蛋白富集于PI3K-Akt信號通路。

2.4 2個組質譜數據驗證

ELISA檢測結果顯示，高度近視白內障組中隨機選擇的C8B蛋白表達量為(127.300±3.132)pg/ml，明顯高于單純白內障組的(109.200±2.904)pg/ml，高度近視白內障組中隨機選擇的DAG1和TGFBI蛋白表達量分別為(24.320±1.608)ng/ml和(626.900±23.110)pg/ml，明顯低于單純白內障組的(30.900±2.183)和(725.500±24.660)pg/ml，差異均有統計學意義(t=4.233，P<0.01；t=2.426，P=0.020；t=2.918，P=0.006)，表達變化趨勢與非標記定量蛋白質組學分析結果均一致(圖4)。

表3 2個組差異表達蛋白KEGG通路富集結果Table 3 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed proteins between the two groups編號通路名稱差異表達蛋白數目P值hsa04610補體和凝血級聯211.55×10-20hsa04512細胞外基質-受體相互作用154.16×10-11hsa04151PI3K-Akt信號通路85.26×10-8hsa05146阿米巴病71.31×10-5hsa05322系統性紅斑狼瘡65.28×10-4hsa05133百日咳55.28×10-4hsa05150金黃色葡萄球菌感染40.002506hsa04974蛋白質的消化和吸收40.009854hsa05020朊病毒疾病30.012741hsa05134軍團桿菌病30.030506hsa03320PPAR信號通路30.045245hsa05222小細胞肺癌30.069051 注:KEGG:京都基因與基因組百科全書 Note:KEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

圖4 2個組隨機選擇的3個差異表達蛋白ELISA驗證 與單純白內障組比較，aP<0.05(獨立樣本t檢驗，n=36) A:2個組C8B表達量比較 B:2個組DAG1表達量比較 C:2個組TGFBI表達量比較 1：高度近視白內障組；2：單純白內障組 C8B:補體8B;DAG1:肌營養不良相關糖蛋白1;TGFBI:轉化生長因子β誘導蛋白

3 討論

目前,高度近視仍缺乏有效的治療手段，當其出現脈絡膜新生血管、脈絡膜和視網膜退行性病變時將嚴重影響患者視力，甚至致盲，因此積極尋找高度近視的潛在發病機制，開發有效的治療靶點，并預測其進展和預后具有重要意義。房水是維持眼正常功能的重要眼內液，研究表明房水蛋白質組與眼部疾病密切相關，包括角膜、晶狀體、視網膜、脈絡膜、鞏膜等結構病變，在眼部正常穩態被破壞后，房水中的蛋白質量和種類也會發生相應的變化，甚至有些蛋白可以被用來作為疾病診斷或治療的生物標志物[9-13]。在本研究中，32個房水標本共鑒定出463種蛋白質，與單純白內障組相比,高度近視白內障組中發現49種上調蛋白和37種下調蛋白。在另一項與高度近視相關的蛋白質組學分析中，10個房水標本發現有210種差異表達蛋白，包括123種上調蛋白和87種下調蛋白[14]。對比這2項高度近視蛋白質組學研究結果發現，很多變化明顯的差異表達蛋白的表達趨勢都是一致的，如CD14、C8B、C4B和COL4A1等。本研究通過GO富集分析和KEGG通路分析，發現免疫和炎癥的相互作用以及細胞外基質重塑在高度近視的發病機制中起著主要作用。

KEGG通路分析表明，富集度最顯著的為補體和凝血級聯通路，包含21個差異表達蛋白，與GO分析結果一致。據報道，這些蛋白質中的大多數具有促炎功能，其中一些在近視患者中已被發現有上調趨勢[15-16]。此外，其他KEGG富集通路(PI3K-Akt信號通路、阿米巴病、系統性紅斑狼瘡、百日咳、金黃色葡萄球菌感染、朊病毒疾病、軍團桿菌病、PPAR信號通路、小細胞肺癌)都與免疫和炎癥相互作用有關。GO分析也表明，差異表達蛋白的生物學過程在補體激活和急性炎癥反應中富集度高。Serpin家族中許多炎癥蛋白表達明顯上調，如Serpinc1、Serping1等。Wei等[16]報道，鞏膜和脈絡膜的急性炎癥會導致近視，這表明炎癥可能在近視的進展中起作用。臨床研究發現系統性紅斑狼瘡、葡萄膜炎或脈絡膜炎等免疫炎癥性疾病患者的近視發生率較高。以上研究表明炎癥可能影響近視的發展。此外，有研究發現補體系統在自身免疫性葡萄膜炎、糖尿病視網膜病變和年齡相關性黃斑變性等多種眼部疾病表達紊亂[17-18]。在本研究中，許多差異表達蛋白，如C8B、C9、C4B、C3等，是參與補體激活和調節的關鍵免疫蛋白，在高度近視白內障組中明顯上調。差異表達蛋白的GO分析結果顯示，差異表達蛋白主要富集到補體激活和調節生物學過程中，提示高度近視患者存在免疫調節活化。由此可見，補體激活與炎癥的相互作用在高度近視的發病機制中起著重要作用。免疫和炎癥相關治療可能是高度近視一種新的臨床治療策略，可能成為未來的一個研究方向。

在本研究中，多種差異表達蛋白為支架蛋白和細胞黏附分子(如COL4A1、COL5A1和SPP1)，且KEGG分析中高度富集了細胞外基質-受體相互作用通路，這些均與GO分析結果一致。DAG1是肌營養不良蛋白-糖蛋白復合物的組成成分，參與了細胞骨架與細胞外基質之間附著的主要作用機制，經常在肌-眼-腦綜合征的研究中被報道[19]。肌-眼-腦綜合征患者常合并嚴重的先天性近視，其致病機制之一就是外周膜蛋白DAG1糖基化異常[20]。與單純白內障組相比，高度近視白內障組TGFBI明顯下降，這與另一項有關高度近視蛋白質組學研究結果一致[14]。TGFBI蛋白是一種分泌型細胞外基質蛋白，已被證實能調節多種細胞的附著[21]。鞏膜合成和分泌TGFBI蛋白，在促進與近視發展相關的鞏膜細胞外基質重塑中起著重要作用[22]。TGFBI蛋白可調節人鞏膜成纖維細胞在成纖維細胞層界面上附著于I型膠原，從而調節層狀滑移量、鞏膜黏彈性和鞏膜延長速率[22]。雖然導致高度近視發生和發展的病因尚不清楚，但這些與鞏膜生物力學特性改變有關的細胞外基質生化變化被認為是導致眼軸增長和近視發展的原因。

本研究通過非標記定量液相色譜串聯質譜蛋白質組學分析發現，高度近視患者房水蛋白質組譜發生了顯著變化,并通過了ELISA實驗的驗證。生物信息學分析表明這些差異表達蛋白與免疫和炎癥相互作用以及細胞外基質的重塑密切相關。研究結果為免疫炎癥相互作用和細胞外基質重塑在高度近視中發揮重要作用提供了新證據，但其具體的作用機制仍有待進一步研究。本研究的不足之處在于,由于臨床樣本取材的限制，無法獲得年輕的高度近視患者和正常人的房水樣本進行蛋白質組學研究，但本研究在最大程度上控制了2個組白內障基線病情的一致性，從而降低了白內障對研究結果的影響。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突