影像學聯合三種分子診斷技術診斷結核病的價值

曹楠楠，鐘藝綺，司徒博，何永建

1廣東省中醫院檢驗科，廣東 廣州 510120；2南方醫科大學南方醫院檢驗醫學科，廣東 廣州 510515

研究報道約85%的結核病(TB)患者可以通過服用6月的藥物方案成功治療［1］。盡早診斷結核病對于結核病防治尤其重要。影像學檢查是常規篩查結核病的主要手段，主要包括胸部X線檢查和核磁共振檢查等。但由于結核病多無特異性影像學表現，影像學檢查必須結合TB病原學檢查才可確診結核病。隨著分子生物學診斷技術的不斷發展，建立在核酸擴增基礎上的TB檢測技術已被世界衛生組織所認可。2010年12月，世界衛生組織推薦GeneXpert MTB/RIF方法檢測TB rpoB基因和突變，快速診斷結核病及檢測利福平耐藥性［2］；另外兩種核酸檢測方法包括TaqMan探針熒光定量PCR法［3］和恒溫擴增法［4］也在全球TB診斷中得到廣泛應用。

既往研究多聚焦在將分子生物學方法與傳統的涂片和培養方法進行對比，評估其敏感度和特異性。但目前尚無3種不同原理的分子生物學TB檢測方法的比較研究。在臨床檢驗工作中，這3種方法都是WHO推薦的常用方法，但敏感度和特異性比較尚無相關數據。本文旨在比較基于TB核酸檢測的3種常用分子生物學方法：Xpert TB/RIF、TaqMan 探針熒光定量PCR 法和RNA恒溫擴增檢測TB性能，探討其結合影像學表現診斷結核病的價值。

1 資料與方法

1.1 標本來源

選取南方醫科大學南方醫院2019年2～4月影像學檢查懷疑存在感染性病灶的患者體液標本38例，所有標本均被送至檢驗科進行病原學檢測。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 結核分枝桿菌rpoB基因和突變檢測試劑盒（半巢式實時定量PCR法）（Cepheid），結核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑盒（TaqMan探針法）（深圳凱杰公司），結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增）（上海仁度），抗酸染色試劑（珠海貝索）。

1.2.2 儀器 GeneXpert MTB/RIF檢測系統、熒光定量PCR儀cobas z 480、臺式高速離心機、恒溫金屬浴鍋、Heal Force生物安全柜、Effendorf離心管、Effendorf加樣槍、Effendorf吸頭。

1.3 方法

1.3.1 標本收集及前處理 收集臨床標本，先取2 mL進行涂片鏡檢，然后對標本進行前處理：取4 mL標本加入有螺旋蓋的50 mL離心管中，按體積比2∶1加入樣品處理試劑，用力振搖10～20次后，在室溫下靜置15 min。對液化后的標本分別進行GeneXpert MTB/RIF、熒光探針PCR和RNA恒溫擴增檢測。

1.3.2 GeneXpert MTB/RIF檢測TB 取2 mL液化處理后樣品緩慢加入檢測匣中，將檢測匣放入GeneXpert系統儀器檢測模塊中，并參閱GeneXpert Dx System操作手冊，啟動測試并自動化檢測結果。

結果判斷：基于樣品中結核分枝桿菌的Ct值，結核分枝桿菌結果將以高（Ct<16）、中（1628）來表示。

1.3.3 TaqMan探針熒光定量PCR檢測TB DNA提取：往1.5 mL無菌離心管中加入液化好的樣本900 μL，然后使用高速離心機在13 000 r/min的轉速離心2 min，棄去上清后加入200 μL核酸抽提液A液，振蕩懸浮，靜置3 min；加入250 μL核酸抽提液B液，13 000 r/min高速離心10 min，棄去上清后再次13 000 r/min 離心1 min。用加樣槍把上清吸干，加入核酸抽提液C液180 μL，13 000 r/min的轉速下離心5 min后吸去上清，60 ℃恒溫加熱干燥5 min，最后加入去RNA酶水40 μL，在13 000 r/min的轉速離心1 min，DNA提取即完成。

擴增試劑準備：從試劑盒中取出TB PCR 反應液、Taq 酶以及UNG 酶，室溫融化且振蕩混勻后，2000 r/min離心10 s。在設定的每個PCR反應管中分別加入反應液與酶混合液的混合液38 μL（反應液37.8 μL＋酶混合液0.2 μL），并且在反應管中分別加入上一步驟提取過的樣本、陰性對照和陽性對照各2 μL，蓋緊管蓋且2000 r/min的轉速離心1 min。

PCR擴增：將PCR反應管放置入熒光定量PCR儀中。擴增程序如下：37 ℃5 min；93 ℃1 min；93 ℃熱變性10 s，使DNA雙鏈解離成為單鏈；60 ℃退火40 s，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；72 ℃延伸45 s，DNA模板-引物結合物在Taq酶的作用下合成一條新的鏈，共設40個循環。

1.3.4 RNA恒溫擴增法檢測TB RNA提取：取1 mL液化后標本于樣品管中，蓋緊管蓋，13 000 r/min高速離心5 min后棄上清，然后加入1 mL生理鹽水，重懸洗滌。再于13 000 r/min的轉速下離心5 min，再次棄去上清并且吸入100 μL TB稀釋液重懸；超聲破碎15 min，功率為300 W，破碎后的樣本13 000 r/min離心5 min。

儀器和試劑準備：取2 μL處理物加入含30 μL擴增檢測液的潔凈微量反應孔中，60 ℃預熱10 min，42 ℃預熱5 min；每孔懸空加入10 μL在42 ℃預熱的SAT酶。

擴增檢測：將微量反應管移至熒光檢測儀器，立即啟動反應程序，PCR反應程序為42 ℃1 min，40個循環，熒光通道設置為F1（FAM）熒光信號采集1次/min。

1.4 統計學分析

采用SPSS22.0對數據進行分析，采用行×列表的χ2檢驗對3種檢測方法的檢出率進行比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 懷疑為TB患者的胸部X線圖像

根據肺結核診斷和治療指南中描述的疑似肺結核患者的X線特點篩查患者。在2019年2～4月就診患者中篩查出懷疑TB的患者38例。TB患者的胸部X線常無特征性改變，影像學可表現為：肺上葉尖后段或肺下葉背段或后基底段有異常；X線影像呈現滲出、增殖、纖維和干酪性病變、病變吸收慢等。

2.2 懷疑為TB患者的標本情況

以臨床診斷為金標準，結果顯示23例標本來自TB患者，15例來自臨床排除TB患者。標本類型包括肺泡灌洗液25例，咳痰8例，胸水2例，腹水1例，穿刺液2例（表1）。

表1 38例標本情況Tab.1 Types of 38 specimens（n）

2.3 3種方法檢測TB檢出率

在本研究的38例標本中，GeneXpert MTB/RIF檢測陽性20例，TaqMan探針熒光定量PCR檢測陽性12例；RNA恒溫擴增法檢測陽性3例；涂片鏡檢法陽性2例。GeneXpert MTB/RIF檢測的陽性率最高（52.6%，20/38），其次為TaqMan探針熒光定量PCR（31.6%，12/38）和RNA恒溫擴增法（7.9%，3/38）。按照行×列表的χ2檢驗進行3種方法TB檢出率的比較，3種方法的TB檢出率差異有統計學意義（χ2=25.185，P<0.01，表2）。

表2 3種方法對TB感染檢出率比較Tab.2 Comparison of the detection rate of TB infection by three methods（n）

圖1 肺結核患者常見胸片圖像Fig.1 Common chest X-ray images of pulmonary tuberculosis patients.

2.4 3種方法檢測TB的敏感度和特異性

本研究發現GeneXpert MTB/RIF方法的敏感度和陰性預測值最高，其次為TaqMan探針熒光定量PCR，RNA恒溫擴增法的敏感度和陰性預測值最低。3種方法的陽性預測值均為100%(表3)。

表3 GeneXpert MTB/RIF、TaqMan探針熒光定量PCR及RNA恒溫擴增性能比較Tab.3 Comparison of the results of GeneXpert MTB/RIF,TaqMan probe fluorescence quantitative PCR and RNA constant temperature amplification（%）

2.5 TB核酸含量對于3種方法敏感度的影響不一致

GeneXpert MTB/RIF方法對于較低含量的TB檢出率高。GeneXpert MTB/RIF檢測陽性20例中TB結果等級含量為中等6 例，低含量7 例，極低含量7 例；TAQMAN探針熒光定量PCR法檢測的12例陽性標本中，所對應的GeneXpert MTB/RIF檢測TB結果等級為中等6例，低含量4例，極低含量2例；RNA恒溫擴增法檢測陽性3例標本所對應的TB結果等級為中等2例，低含量1例。

3 討論

結核分枝桿菌感染的診斷難度大、治療周期長、藥物副作用大，給人類戰勝結核病帶來巨大的挑戰。對結核患者進行早期診斷，有助于合理用藥、有效降低發病率、復發率及死亡率［5］。胸部X線檢查是診斷肺結核的常用檢查方法，但肺結核的胸部X線表現并無特征性改變，可呈多形態表現即同時呈現滲出、增殖、纖維和干酪性病變，可伴胸腔積液、胸膜增厚與粘連等［6］。對于肺外結核病，胸部X線表現可不明顯。懷疑肺外結核病的患者除胸部X線檢查外，則還需進行核磁共桭或CT檢查，且不易與腫瘤、結節等其他疾病相區別［6］。因此對于影像學檢查懷疑TB感染的患者，必須進行病原學檢查以明確診斷［7］。

結核分枝桿菌病原學檢驗是臨床確診結核病的金標準［7］。傳統的病原學檢驗方法包括直接涂片法和培養法。涂片法存在敏感度差和特異性差等缺點，而培養法則存在敏感度差和需時較長的不足，無法滿足臨床需求。結核分枝桿菌核酸分子生物學檢測具有簡便、快速、特異性高等特點，目前已經廣泛應用于結核分枝桿菌感染快速檢測［8］。

本文研究的3種結核分枝桿菌核酸檢測方法是目前最常用的分子生物學方法［9-14］，原理和靶基因也不盡相同。GeneXpert MTB/RIF以半巢式實時定量PCR擴增技術為基礎，能夠自動抽提DNA并且擴增rpoB基因。由于95%以上的利福平耐藥菌株都有rpoB基因變異，所以擴增rpoB基因同時可以鑒定是否為利福平耐藥菌株。因大部分利福平耐藥的菌株同時對異煙肼耐藥，故rpoB基因的檢測又可在一定程度上判斷是否為多耐藥菌株［9］。熒光探針PCR法采用TaqMan探針法［10］，根據結核分枝桿菌基因的保守序列設計引物，特異性較高。RNA恒溫擴增法無需復雜的儀器即可擴增檢測結核分枝桿菌復合群RNA，由于檢測靶標為RNA，該方法能夠檢測活菌，可用于結核病治療的療效評估［11］。

已有的結核分枝桿菌感染檢驗研究多聚焦在將這些分子生物學方法分別與傳統或改良的培養、涂片方法進行對比。有學者對質量不佳的咳痰標本進行培養和Xpert TB/RIF檢測檢驗，Xpert TB/RIF方法檢測TB的敏感度為24.2%，培養法為21.3%［12］，顯示出分子生物學方法比傳統的培養法具有更高的敏感度。但目前尚無將3種不同原理和靶標的分子生物學方法進行性能比較的研究，無法給臨床選擇合適的分子生物學檢驗方法提供數據參考。而本研究為此提供了重要的數據補充。在本研究中，GeneXpert MTB/RIF、TaqMan探針熒光定量PCR法、RNA恒溫擴增法檢測TB的敏感度分別為87.0%、52.2%、13.0%。與其他兩種方法相比，GeneXpert MTB/RIF對于結核分枝桿菌病原體檢測具有較高的敏感度和特異性（P<0.05）。GeneXpert MTB/RIF對于低含量的結核分枝桿菌檢出率也較高，主要原因可能在于Xpert TB/RIF檢測試劑包含3對特異性引物和5個探針，檢測rpoB gene并采用封閉性Xpert檢測匣，整合并且自動完成樣品純化、核酸擴增、核酸特異序列檢測、自動測定出結果等多個程序，DNA提取效率高，多靶標多引物擴增效率高。TaqMan探針熒光定量PCR采用結核分枝桿菌的保守序列設計探針，該方法的檢測性能受探針序列影響大。探針序列的結合效率、保守程度和溫度都可能影響該方法的檢測效果；且在該方法提取臨床標本中模板DNA的操作中多為人工操作，受影響因素增多，這些都可能造成TaqMan探針熒光定量PCR對結核分枝桿菌核酸的檢測效率降低。RNA恒溫擴增法以結核分枝桿菌RNA為模板，RNA易降解的特性對該方法的敏感度造成極大的降低。

在本研究中，GeneXpert MTB/RIF方法的敏感度為87.00%，特異性為100.00%，陰性預測值為83.30%。一項包含9500名患者的GeneXpert MTB/RIF方法學系統評價也顯示GeneXpert MTB/RIF 具有高敏感度（89%）和高特異性（99%）［15］，結果與本文一致；但另一項包含568例肺結核患者的研究顯示，GeneXpert MTB/RIF檢測在肺結核患者中敏感度僅39.61%［16］；也有學者對質量不佳的咳痰標本進行的GeneXpert MTB/RIF檢測研究顯示敏感度僅為24.2%。敏感度差別巨大的原因可能在于本研究與Steingart 等［15］的研究中GeneXpert MTB/RIF的檢測標本主要為肺泡灌洗液，而有研究標本為咳痰［16］，部分研究標本甚至為質量不佳的咳痰［12］。痰液中含有的其他體液物質具有抑制核酸擴增的作用，對于懷疑結核分枝桿菌感染的患者，應推薦采用肺泡灌洗液標本進行GeneXpert MTB/RIF 檢測，以提高敏感度。同時由于本研究標本數量相對較少，且主要為肺泡灌洗液標本，GeneXpert MTB/RIF、熒光探針-PCR和RNA恒溫擴增法對其他標本類型的檢測性能無法評估，仍需收集更多的標本進行探索和研究。

有研究發現，僅表現為低熱、消瘦、咳嗽等一般癥狀而無影像學表現的患者，GeneXpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌的性能將大大降低［17］，因此影像學檢查與分子生物學檢查必須密切結合，才能夠為臨床提供快速篩選，確診結核病。

綜上所述，對影像學表現懷疑結核病的患者，推薦進行GeneXpert MTB/RIF檢查。GeneXpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌的敏感度明顯高于PCR-熒光探針、RNA恒溫擴增法，操作方法便捷，同時能快速檢測利福平的耐藥，在很大程度上預測多重耐藥結核，為臨床醫生診斷結核或是耐藥結核提供重要幫助。