血流感染大腸埃希菌對多黏菌素耐藥機制研究

馬強 朱永澤 朱建俊 胡志偉 陳偉

大腸埃希菌屬于腸桿菌目埃希菌屬，是較為常見的條件致病菌之一。2018年中國CHINET細菌耐藥監測結果顯示，在血液標本分離病原菌中，大腸埃希菌分離率高居首位，占23%[1]。多黏菌素是一類從芽胞桿菌分離獲得的脂肽類抗生素，主要作用于細菌細胞膜的脂多糖。目前，多黏菌素被國際上公認為是治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的“最后防線”[2-4]。令人遺憾的是，多黏菌素耐藥基因已經出現。2015年11月，我國學者率先報道從人與動物腸桿菌科細菌中分離到了質粒介導的多黏菌素耐藥基因mcr-1[5]。mcr-1屬于磷酸乙醇胺轉移酶家族，該基因在細菌表達后可以添加磷酸氨基乙醇至脂質A，導致多黏菌素對細菌脂多糖親和力降低，從而介導菌株對多黏菌素耐藥。本研究對兩家不同醫院分離的血流感染大腸埃希菌耐藥性進行分析，并探討其對多黏菌素的耐藥機制，為臨床用藥及治療提供經驗依據。

1 材料和方法

1.1 菌株 收集2018年1月至2019年12月浙江省人民醫院和杭州市余杭區第二人民醫院門診及住院患者中分離的血流感染大腸埃希菌241株（已排除同一患者重復分離株），其中浙江省人民醫院227株，杭州市余杭區第二人民醫院14株。

1.2 藥敏試驗 使用法國生物梅里埃公司Vitek-MS質譜系統鑒定菌株；藥敏試驗采用法國生物梅里埃公司的VITEK-2 Compact系統及革蘭陰性細菌GN13藥敏卡（批號：1101551403），根據美國抗微生物藥物敏感性試驗標準（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI2018）的標準判斷結果[6]。對于多黏菌素藥敏應用微量肉湯稀釋法，根據歐洲藥敏試驗委員會（EUCAST）在2018年修訂的標準判斷結果（S≤2 mg/L，敏感；R＞2 mg/L，耐藥）[7]。應用WHONET 5.6軟件統計藥敏結果。大腸埃希菌ATCC25922為藥物敏感性質控菌株。

1.3 多黏菌素耐藥相關基因及其他β-內酰胺酶耐藥基因檢測 采用PCR法。儀器為ABI5700型PCR擴增儀（美國ABI Applied公司），挑取適量菌落通過煮沸法制作細菌DNA模板，相關引物見表1。PCR試劑盒（批號：ABT2231C）、Taq 酶（批號：AIF2212A）、PCR 引物及引物測序均由中國上海生工生物工程有限公司完成。PCR反應參照朱永澤等[8]研究，具體過程及各項參數：95℃預變性10 min，然后95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃60 s，循環34個周期，最后72℃延伸 7 min。擴增產物應用1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠電泳成像儀下觀察并紀錄結果。DNA測序結果經BLAST程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析，與GenBank上公布的耐藥基因進行比對。此外其他β-內酰胺酶耐藥基因檢測按上述方法進行，引物參考Quan等[9]研究。

表1 PCR引物序列

1.4 質粒接合試驗 6株攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌為供體菌，疊氮鈉耐藥的大腸埃希菌J53為受體菌。兩種菌分別應用MH肉湯增菌培養，37℃、180 r/min振蕩培養6 h，將受體菌與供體菌按1:1混合，取20 μl混合液滴加于0.22 μm孔徑無菌濾膜，并將濾膜貼于MH培養基上，37℃培養18～24 h。次日，用MH肉湯沖洗濾膜并取20 μl混合液滴加于含300 mg/L疊氮鈉與4 mg/L多黏菌素的MH平板，同時單獨吸取供體菌及受體菌各20 μl接種于同一平板作為對照培養。接合子鑒定通過藥物敏感試驗初步判斷，進一步應用PCR法檢測mcr-1基因驗證耐藥基因是否成功轉移。

1.5 菌株多克隆序列位點（multilocus sequence typing，MLST）測定及進化樹構建 按照上述PCR程序擴增大腸埃希菌 7 個管家基因（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA），進一步對其PCR產物進行測序，將序列在MLST 數據庫（http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）進行比對。系統進化樹應用大腸埃希菌gyrB基因進行系統發育分析，采用MEGA 5軟件進行分析。

2 結果

2.1 241株血流感染大腸埃希菌藥敏結果分析 本研究顯示血液標本中共分離6株多黏菌素耐藥大腸埃希菌，分離率為2.5%。藥敏結果顯示，大腸埃希菌對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢曲松、復方新諾明、環丙沙星及左旋氧氟沙星耐藥率分別為69.7%、58.5%、58.1%、49.4%、43.6%、41.9%；大腸埃希菌對哌拉西林/他唑巴坦、厄他培南、亞胺培南與美羅培南的耐藥率均為1.7%，對多黏菌素耐藥率僅為2.5%，未分離到對替加環素耐藥的菌株。具體藥敏結果見表2。

表2 241株血流感染大腸埃希菌藥敏結果分析[株（%）]

2.2 多黏菌素耐藥大腸埃希菌耐藥基因檢測結果PCR檢測顯示6株多黏菌素耐藥大腸埃希菌均攜帶mcr-1耐藥基因，未發現其他mcr亞型基因。

2.3 多黏菌素耐藥大腸埃希菌臨床特點 多黏菌素耐藥大腸埃希菌導致血流感染患者中男2例，女4例；年齡主要分布于51～60歲，占66.7%（4/6）。所有患者都曾接受過廣譜抗生素治療，近期均沒有出國旅行史。

2.4 攜帶mcr-1耐藥基因菌株多克隆序列位點及其他β-內酰胺酶耐藥基因檢測 應用大腸埃希菌7對管家基因對6株攜帶mcr-1基因大腸埃希菌進行克隆分型，測序分析結果顯示這些菌株均為不同型別，提示克隆以散發為主，未形成優勢克隆，見表3和圖1。此外，除了攜帶mcr-1基因外，這6株菌株同時還攜帶其他β-內酰胺酶基因，包括 blaTEM-1A、blaTEM-1B、blaOXA-1、blaCTX-M-123、blaCTX-M-14及 blaNDM-5等，具體見表3。

表3 6株攜帶mcr-1基因大腸埃希菌多克隆位點型別及其他β-內酰胺酶基因檢測結果

圖1 6株攜帶多黏菌素耐藥基因mcr-1的大腸埃希菌根據gyrB基因構建進化樹圖（E1～6表示6株菌株）

2.5 質粒接合試驗 6株多黏菌素耐藥大腸埃希菌mcr-1耐藥基因均可以成功傳遞至受體菌大腸埃希菌J53菌株中，說明該耐藥基因定位于質粒，并可以進行水平傳播。

3 討論

本研究顯示血液標本中共分離6株多黏菌素耐藥大腸埃希菌，分離率為2.5%，經PCR檢測顯示6株均攜帶mcr-1基因。本研究分離率與之前我國血流感染大腸埃希菌攜帶mcr-1基因研究（1.2%）相比有所上升[9]。值得注意的是，6株菌株均從住院患者中分離，并且都曾接受過廣譜抗生素治療。藥敏試驗結果顯示，產mcr-1分離株對碳青霉烯類耐藥率為16.7%，對第三代頭孢菌素耐藥率為66.7%，對氟喹諾酮類耐藥率為33.7%。對氨基糖苷類耐藥率為33.3%，所有分離株均對替加環素敏感。多黏菌素是治療耐藥腸桿菌科細菌的選擇用藥之一，國內專家共識已明確說明由于腸桿菌科細菌對多黏菌素也存在耐藥，故臨床不能單一用藥，應聯合用藥[10]。

除了mcr-1基因外，這6株菌株還攜帶其他β-內酰胺酶耐藥基因，特別是菌株E6還攜帶blaNDM-5基因。多黏菌素是治療產金屬酶菌株的最后用藥之一，然而出現了同時攜帶金屬酶耐藥基因及多黏菌素耐藥基因mcr-1的大腸埃希菌，提示菌株耐藥基因有進一步整合趨勢，從而加速全耐藥表型菌株出現。已有研究表明，blaNDM基因能夠與替加環素或多黏菌素耐藥表型共存于同一菌株中[11]，這無疑會導致所謂的“超級細菌”分離株，并加速進入“抗生素后時代”[12]，臨床需予以重視。

早期研究認為攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌以散發克隆為主[9]，本研究進一步支持這一觀點。MLST研究顯示6株攜帶多黏菌素耐藥的大腸埃希菌均為不同克隆型別，基因進化樹進一步明確菌株之間無遺傳關聯，但近年來mcr-1基因在腸桿菌科中的廣泛傳播仍需引起臨床關注[13]。此外，接合實驗表明mcr-1基因都定位于可結合質粒上，可導致該基因進一步水平播散。質粒介導多黏菌素耐藥基因mcr-1在大腸埃希菌中出現，應引起臨床高度重視，加強耐藥監測，嚴格控制醫院感染，避免多黏菌素耐藥大腸埃希菌暴發流行。