活血消癥益氣方對肝硬化模型大鼠肝功能與血管內皮功能及炎性因子的影響

吳曉玲，李力強，吳偉斌，張貴鋒，楊 堅

（廣東省肇慶醫學高等?？茖W校，廣東 肇慶 527400）

肝硬化（hepatic cirrhosis，HC）是各種病因長期作用于肝臟，引起肝臟彌漫性纖維化、假小葉形成、肝內外血管增殖為特征的病理階段，隨病情進展可出現腹水、門靜脈高壓、肝性腦病、肝衰竭等并發癥，可進展為肝細胞癌，每年約有100萬肝硬化患者死亡［1］。肝硬化診斷明確后，應盡早開始綜合治療。病因是治療的關鍵，必要時抗炎抗肝纖維化，積極防治并發癥［2］。《肝硬化診治指南》（2019版）認為，在抗肝纖維化治療中，目前尚無抗纖維化西藥經過臨床有效驗證，而中醫中藥發揮了重要作用［3］。鱉甲消癥丸是廣東省名中醫李力強教授發明的一種治療肝病的中藥院內制劑（粵藥制字Z20070356，ZL20150670167.3），具有活血消癥益氣之功，并在臨床實際應用了30余年。研究表明該藥能有效抗肝纖維化和改善肝炎患者肝功能［4］，為探索其作用靶點和療效機制，進一步提高臨床療效，課題組觀察了活血消癥益氣方（鱉甲消癥丸原方）中藥配方顆粒劑對肝硬化模型大鼠肝功能、血管內皮功能及炎性因子的影響，報道如下。

1 材 料

1.1 實驗動物

選擇SD大鼠50只［湖北省疾控中心動物實驗中心提供，實驗動物許可證號SYXK（鄂）2017-0065］為實驗對象，雌雄各25只，適應性飼養1周，隨機分為空白組10只，造模組40只。造模成功后的大鼠32只，隨機分為模型組、吡非尼酮、鱉甲煎丸、活血消癥益氣方組，每組8只?？瞻讓φ战M8只入組觀察。

1.2 藥物與試劑

中藥配方顆粒（批號1808001w，華潤三九醫藥股份有限公司生產）、鱉甲煎丸（國藥準字Z42020772，國藥集團中聯藥業有限公司生產）、吡非尼酮原料藥粉（貨號EB03028，購于上海士鋒生物科技有限公司），高脂飼料（購自湖北省疾控中心動物實驗中心），四氯化碳（貨號C805332，購自上海麥克林生化科技有限公司），谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBil）檢測試劑盒（貨號C010-2-1、C009-2-1、A045-2-2、A028-2-1、C019-1-1，購自南京建成生物工程研究所），總一氧化氮（NO）檢測試劑盒（貨號S0021，購自上海碧云天生物技術有限公司），內皮素-1（ET-1）、血管內皮生長因子（VEGF）ELISA試劑盒（貨號TLE0560R，購自廣州天元生物科技有限公司），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（貨號SEKR-0009，深圳市達科為生物工程有限公司生產）。

2 方 法

2.1 動物造模

參考相關文獻采用四氯化碳復合法誘導造模［5］：造模組大鼠給予高脂飼料加5%食用白酒溶液（50度白酒加蒸餾水稀釋而成）進行飼養，空白組用普通飼料及蒸餾水進行飼養。第1～2周按0.2mL/100g體質量給予造模組40%（v/v）的四氯化碳橄欖油溶液灌胃，第3～12周按0.2mL/100g體質量給予造模組50%（v/v）的四氯化碳橄欖油溶液灌胃，每周一、周四各給藥1次。空白組給予等量的橄欖油溶液。每周一大鼠稱重1次，每周給藥劑量根據體質量調整。在第12周末，隨機選擇正常組、造模組大鼠各2只，烏拉坦麻醉后，下腔靜脈取血檢測大鼠血清AST、ALT含量，觀察大鼠肝臟腫脹度，取肝組織進行HE染色及Masson染色。對比空白組及造模組指標，確定造模是否成功。

2.2 干預方法

大鼠每日給藥劑量參考《藥理實驗方法學》進行換算。

吡非尼酮組按照120mg/kg劑量給予吡非尼酮原藥粉進行灌胃干預治療。

鱉甲煎丸組按照0.9g/kg劑量給予鱉甲煎丸灌胃干預治療；用小量溫水將藥物研磨為混懸液，加入適當體積的溫水配置為灌胃液，再按照1mL/200g體質量灌胃。

活血消癥益氣方組給予活血消癥益氣方中藥配方顆粒進行灌胃干預治療。藥用醋鱉甲1.5g（相當于飲片15g），醋莪術1.5g（飲片15g），醋三棱1.5g（飲片15g），西洋參4.5g（飲片15g），炙黃芪1g（飲片10g），醋白芍1.5g（飲片15g），炒白術1.67g（飲片10g），茯苓1g（飲片10g），生大黃0.5g（飲片5g），生甘草1.25g（飲片7.5g），人工麝香0.5g，配方顆粒融入120mL沸水中震蕩搖勻為混懸液，冷卻后按照1.23mL/100g體質量灌胃。

空白組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。每日干預1次，連續干預8周。

2.3 體質量檢測及癥狀觀察

將1L大燒杯置于電子天平上，去皮后取下，將大鼠置于大燒杯內，重新放置在天平上，待大鼠安定后讀取測量值。每日觀察記錄1次大鼠的進食、毛發色澤、活動狀態等基本情況。

2.4 標本采集及指標檢測

肝臟HE及Masson染色：處死大鼠，取大鼠肝臟，置于4%的多聚甲醛中固定24h以上，然后制備成石蠟切片，采用HE染色及Masson染色對肝組織損傷情況及纖維化程度進行檢測。肝功能指標檢測：烏拉坦麻醉后切開腹部，自大鼠下腔靜脈取血，以肝素抗凝，血樣3000轉低溫離心30min，然后按照試劑盒說明書步驟對血樣進行檢測，所得檢測結果換算為酶活力卡門氏單位。血清NO檢測：大鼠下腔靜脈血置于滅菌的EP管內，斜放于冰浴中，血液自然凝固后3000轉低溫離心5min，取血清用總NO檢測試劑盒按照說明書步驟進行檢測。血清ET-1、VEGF檢測：大鼠下腔靜脈血，以肝素抗凝，血樣3000轉低溫離心30min，取血清用ET-1/VEGF ELISA試劑盒按照說明書步驟進行檢測。TNF-α、IL-1β、IL-6檢測：自大鼠下腔靜脈取血，以肝素抗凝，取血樣3000轉低溫離心15min后，按照TNF-α/IL-1β/IL-6 ELISA試劑盒說明書步驟對血樣進行檢測。

2.5 統計學處理

3 結 果

各組大鼠體質量結果比較見表1。模型組大鼠體質量顯著高于空白對照組；模型組大鼠體質量升高到第4周開始逐漸下降，空白組、吡非尼酮組、鱉甲煎丸組、活血消癥益氣方組體質量持續上升。

表1 連續給藥8周各組大鼠體質量變化 （g，±s ）

表1 連續給藥8周各組大鼠體質量變化 （g，±s ）

組別 只 第1w 第2w 第3w 第4w 第5w 第6w 第7w空白組 8 352.72± 6.05 367.30± 9.67 380.43±28.60 379.33±36.05 385.68±26.85 398.18±32.87 404.73±35.36模型組 8 458.93±16.89 489.03±34.95 513.30±39.83 518.94± 8.88 511.82±40.63 501.78±40.35 498.90±32.72吡非尼酮組 8 457.68±23.43 484.08±46.01 493.02±58.10 486.90±55.51 496.60±53.16 485.02±47.26 484.18±25.78鱉甲煎丸組 8 465.33±22.66 473.26±21.41 499.56±12.45 488.16±21.41 501.56±22.52 489.70±24.12 507.35±22.23活血消癥益氣方組 8 440.17±15.09 460.97±43.19 453.78±36.29 445.43±29.78 451.63±35.28 443.85±37.86 456.03±38.41

各組大鼠肝組織病理切片結果比較見圖1、圖2。HE染色結果（圖1）：空白對照組大鼠肝小葉結構正常，未見假小葉形成；肝細胞大小一致、核居中，圍繞中央靜脈呈條索狀排列，未見肝細胞脂肪變性、壞死及其他明顯病理變化；匯管區未見炎癥細胞浸潤及纖維組織增生。模型組大鼠肝組織內出現大片肝細胞壞死；大量寬厚纖維增生并分割正常的肝小葉，形成大小不等的肝細胞結節即假小葉；假小葉內肝細胞肝索結構模糊，肝細胞未見異型性，部分細胞出現脂肪變性；匯管區大量纖維組織增生并有大量淋巴細胞浸潤，大量毛細膽管增生。吡非尼酮組無假小葉形成及肝細胞壞死。鱉甲煎丸組可見少量肝細胞壞死，纖細的纖維組織增生分割正常肝小葉并形成假小葉結構；匯管區較多的纖維組織增生及毛細膽管增生。活血消癥益氣方組隱約纖細的纖維組織增生分割正常肝小葉并形成假小葉結構；匯管區少量纖維組織增生及毛細膽管。

圖1 各組大鼠肝組織病理切片HE染色結 果

Masson染色結果（圖2）：纖維組織成藍色。空白對照組的纖維組織位于匯管區周邊，未見分割肝小葉纖維組織。模型對照組匯管區周邊可見大量的纖維組增生，寬厚纖維組織向周邊肝組織延伸將肝細胞包繞成大小不等的團塊狀即假小葉形成，肝小葉內可見大片壞死的肝細胞。吡非尼酮組和鱉甲煎丸組可見染成藍色的纖維組織增生，厚度中等并形成假小葉?；钛Y益氣方組纖維組織位于匯管區周邊，未見分割肝小葉纖維組織。

圖2 各組大鼠肝組織病理切片Masson染色結果

各組大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil水平比較見表2。與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil差異有統計學意義（P＜0.01）。經過8周的干預治療，吡非尼酮組、鱉甲煎丸組、活血消癥益氣方組大鼠血清AST、ALT、TBil水平顯著低于模型組（P＜0.01），ALB水平顯著高于模型組（P＜0.01），TP水平與模型組比較差異無統計學意義（P≥0.05）；活血消癥益氣方組大鼠血清AST、ALT水平顯著低于吡非尼酮組、鱉甲煎丸組（P＜0.01），而ALB、TBil水平與吡非尼酮組、鱉甲煎丸組差異無統計學意義（P≥0.05）。

表2 各組大鼠AST、ALT、TP、ALB、TBil水平比較 （±s ）

表2 各組大鼠AST、ALT、TP、ALB、TBil水平比較 （±s ）

注：a）P、b）P、c）P、d）P分別表示與空白組、模型組、吡非尼酮組、鱉甲煎丸組比較差異有統計學意義，a）P、b）P、c）P、d）P均＜0.05。

組別 只 AST（U/L） ALT（U/L） TP（g/L） ALB（g/L） TBil（μM）空白組 8 29.24±2.46 20.86±3.50 79.06±3.81 40.50±2.24 6.55±0.44模型組 8 138.00±9.26a） 112.49±5.33a） 63.33±2.70a） 28.95±1.41a） 16.69±1.19a）吡非尼酮組 8 80.58±3.40ab） 62.73±2.59ab ） 65.49±2.91a） 35.21±1.42ab） 12.21±0.60a）鱉甲煎丸組 8 84.68±6.56ab） 57.95±2.24ab） 65.11±3.45a） 35.63± 2.40ab） 11.53±1.14ab）活血消癥益氣方組 8 70.01±3.38abcd） 52.10±2.85abcd） 67.39±2.72a） 33.28±3.44ab） 11.20±1.04ab）

各組大鼠血清NO、ET-1、VEGF水平比較見表3。與空白組比較，模型組血清NO、ET-1、VEGF差異有統計學意義（P＜0.01）。經過8周的干預治療，吡非尼酮組、鱉甲煎丸組、活血消癥益氣方組大鼠血清NO、ET-1、VEGF均顯著低于模型組（P＜0.05）；活血消癥益氣方組大鼠血清NO顯著低于吡非尼酮組（P＜0.05）；活血消癥益氣方組大鼠血清ET-1、VEGF與鱉甲煎丸組、活血消癥益氣方組比較差異無統計學意義（P≥0.05）。

表3 各組大鼠血清NO、ET-1、VEGF水平比較 （±s ）

表3 各組大鼠血清NO、ET-1、VEGF水平比較 （±s ）

注：a）P、b）P、c）P、d）P分別表示與空白組、模型組、吡非尼酮組、鱉甲煎丸組比較差異有統計學意義，a）P、b）P、c）P、d）P均＜0.05。

組別 只 NO（μM） ET-1（pg/mL）VEGF（pg/mL）空白組 8 74.35±3.98 25.34±1.58 27.99±1.00模型組 8 277.19±24.21a） 46.96±2.21a） 79.13±4.78a）吡非尼酮組 8 189.74±24.62ab）40.33±1.98ab） 59.36±2.98ab）鱉甲煎丸組 8 167.94±11.17ab）40.20±3.52ab） 61.21±2.59ab）活血消癥益氣方組 8 160.34±8.69abc） 37.29±1.22ab）58.05±3.71ab）

各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6結果比較見表4。與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6差異有統計學意義（P＜0.01）。經過8W的干預治療，吡非尼酮組、鱉甲煎丸、活血消癥益氣方組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6均顯著低于模型組（P＜0.01）；活血消癥益氣方組大鼠血清TNF-α、IL-1β顯著低于鱉甲煎丸組（P＜0.01），但顯著高于吡非尼酮組（P＜0.01）；活血消癥益氣方組大鼠血清IL-6與鱉甲煎丸組比較，差異無統計學意義（P≥0.05），與吡非尼酮組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6結果比較 （±s ）

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6結果比較 （±s ）

注：a）P、b）P、c）P、d）P分別表示與空白組、模型組、吡非尼酮組、鱉甲煎丸組比較差異有統計學意義，a）P、b）P、c）P、d）P均＜0.05。

IL-6（pg/mL）空白組 8 47.32±3.27 14.24±1.00 27.18±2.34模型組 8 217.82±11.74a） 55.90±3.93a） 99.56±9.44a）吡非尼酮組 8 102.61±5.24ab） 23.86±2.16ab） 60.79±6.83ab）鱉甲煎丸組 8 179.11±7.71abc） 38.35±2.90abc） 78.69±4.66abc）活血消癥益氣方組 8 136.27±6.51abcd）32.46±2.44abcd）70.51±5.19abc）組別 只 TNF-α（pg/mL）IL-1β（pg/mL）

4 討 論

肝硬化是一種損傷后的修復反應，在這一過程中肝臟星狀細胞活化是中心環節，還包括正常肝細胞外基質的降解，纖維瘢痕組織聚集和血管扭曲變形以及細胞因子釋放等［3］。本病屬中醫“鼓脹”“積聚”“脅痛”等范疇，被古代醫家列為“風、癆、鼓、膈”四大頑證之一，為臨床重癥，治療較為困難［6］?！饵S帝內經》即有鼓脹的記載，如《靈樞·水脹》記載其癥狀有“腹脹，身皆大，大與膚脹等也，色蒼黃，腹筋起”?，F代醫家大多認為肝硬化由肝、脾、腎三臟功能失調，氣滯、血瘀、水停瘀結腹中所致［7］，主要治療原則為活血化瘀、扶正補虛、清熱解毒、健脾利濕等［3］。

李力強認為，肝硬化屬本虛標實、虛實夾雜之證，因正氣不足，肝氣郁結、氣機不暢，氣滯血瘀、濕濁內蘊，肝、脾、腎功能失調，三焦氣化不利，水濕不化，凝聚成痰，導致痰瘀阻絡、聚水為脹而發病，治宜活血消癥、健脾益氣、疏肝理氣，并以《太平圣惠方》鱉甲丸為基礎研制了活血消癥益氣的中藥復方鱉甲消癥丸治療。復方由醋鱉甲、醋三棱、醋莪術、人工麝香、西洋參、炙黃芪、醋白芍、炒白術、茯苓、生大黃、生甘草等組成。醋鱉甲入肝消積、軟堅散結，麝香通竅活絡、活血消癥，為君藥；醋莪術與醋三棱活血行氣、消癥止痛，為臣藥；西洋參和炙黃芪補益氣血、扶益正氣，醋白芍柔肝止痛，炒白術和茯苓健脾益氣、利水祛濕，共為佐藥；生大黃活血化瘀、蕩滌濕熱，生甘草緩急止痛、調和諸藥，共為使藥。諸藥合用，共奏益氣活血、化瘀消癥之功，標本同治。臨床應用表明，鱉甲消癥丸對預防肝硬化門靜脈高壓食管胃底靜脈破裂出血、抗肝纖維化等有顯著效果［4，8-9］，能明顯改善肝區疼痛、黃疸、腹水、蜘珠痣、肝掌、舌邊瘀斑、脾腫大等癥狀；顯著降低門靜脈壓力和食管靜脈壓力，改善食管靜脈曲張，預防食管胃靜脈出血；改善肝纖維化，降低肝內血管和門體側支血管阻力。

研究發現，模型組大鼠體質量升高到第4周開始逐漸下降，血清AST、ALT、TP、ALB、TBil、NO、ET-1、VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6與空白組比較差異有統計學意義。模型組大鼠肝組織內出現大片肝細胞壞死，大量纖維增生，假小葉形成，假小葉內肝細胞肝索結構模糊，肝細胞未見異型性。匯管區大量纖維組織增生并有大量淋巴細胞浸潤，大量毛細膽管增生。吡非尼酮是一種新型口服吡啶酮類化合物，臨床研究表明吡非尼酮具有廣譜抗肺、心、肝、腎纖維化及抗炎、抗氧化作用，能夠抑制轉化生長因子（TGF）-β、TNF-α等多種促纖維化和促炎細胞因子［10］。近年來實驗證實［11-13］，吡非尼酮能有效改善肝纖維化大鼠肝臟炎癥、纖維化，可顯著降低受損肝臟組織及血清中TNF-α、IL-1、IL-6等的產生，減輕中性粒細胞等炎癥細胞在肝內浸潤造成的肝損傷，顯著降低血清AST、ALT、TBil含量，認為吡非尼酮可能是通過抑制炎癥反應阻斷肝纖維化于早期階段。鱉甲煎丸原方出自張仲景的《金匱要略》，由炙鱉甲、阿膠、蜂房等23味中藥組成，具有活血化瘀、軟堅散結之功，為治瘧母、癥瘕等病的主方。臨床大量研究證實，鱉甲煎丸治療肝硬化療效顯著［14-16］。唐承璐等發現［17］，鱉甲煎丸能明顯降低肝硬化患者血清AST、ALT、TBil、TNF-α、IL-1β，升高血清ALB，認為鱉甲煎丸能減輕肝硬化患者的肝臟炎癥和纖維化。本研究的結果與此一致，表明吡非尼酮、鱉甲煎丸均能顯著改善肝硬化模型大鼠的肝功能、肝臟炎癥及纖維化。NO是具有擴張血管的活性物質，肝細胞嚴重受損時導致NO合成增加，過量的NO會抑制干細胞合成白蛋白，形成低蛋白血癥，加重腹水；ET-1主要由血管內皮細胞產生，肝硬化時肝細胞和肝內血管增生，使ET-1的分泌增加，引起肝血竇收縮導致肝內循環受阻，肝細胞缺血缺氧，加重水腫和肝纖維化［18-19］；VEGF及其相關信號轉導通路在肝臟炎癥、纖維化發生發展過程中發揮著重要作用，包括促進血管生成、肝星狀細胞（HSC）活化與遷移以及促進炎癥、纖維化因子釋放［20］。本研究結果表明，吡非尼酮組、鱉甲煎丸能顯著降低肝硬化模型大鼠血清NO、ET-1、VEGF水平，進一步證實了這兩個藥物可有效治療肝硬化。

研究中，經過8周的干預治療，活血消癥益氣方組大鼠肝組織纖維化程度明顯減輕，結締組織增生顯著減少，肝細胞炎性浸潤程度明顯減輕；血清AST、ALT水平顯著低于吡非尼酮組、鱉甲煎丸組，而ALB、TBil水平與吡非尼酮組、鱉甲煎丸組無差異，表明活血消癥益氣方能更加有效的改善肝硬化模型大鼠肝功能的損傷。活血消癥益氣方組大鼠血清NO水平顯著低于吡非尼酮組，與鱉甲煎丸組比較差異無統計學意義，而ET-1、VEGF水平與吡非尼酮、鱉甲煎丸組比較，差異無統計學意義，表明活血消癥益氣方對肝硬化大鼠血管內皮功能相關因子的影響與吡非尼酮、鱉甲煎丸無明顯差異?；钛Y益氣方組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平顯著低于鱉甲煎丸組，兩組的IL-6水平比較差異無統計學意義；而活血消癥益氣方組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著高于吡非尼酮組，表明活血消癥益氣方對肝硬化大鼠炎性因子的影響優于鱉甲煎丸，但比吡非尼酮的效果略差。因此，活血消癥益氣方能夠有效改善肝硬化模型大鼠肝功能、抗大鼠肝纖維化和炎癥反應，作用機制可能與調控血清NO、ET-1、VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6等血管內皮功能及炎性因子相關。

綜上所述，經過干預治療，吡非尼酮組、鱉甲煎丸、活血消癥益氣方組大鼠血清AST、ALT、TBil、NO、ET-1、VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著低于模型組，病理切片結果提示肝纖維化、肝細胞損害明顯好轉，表明3種藥物對肝硬化大鼠肝功能損傷、肝纖維化和炎性反應均能有效抑制或一定程度逆轉?；钛Y益氣方對肝硬化模型大鼠肝功能損害的改善、炎性因子影響優于鱉甲煎丸，改善肝功能損害方面與吡非尼酮無顯著差異，而對炎性因子的影響效果相對較差。