第二代蛋白酶體抑制劑對類風濕性關節炎模型大鼠的干預效果及作用機制研究

王 平，王華勇，王 浩

棗陽市第一人民醫院康復科，湖北棗陽 441200

類風濕性關節炎作為一種自身免疫性疾病，主要臨床表現為關節晨僵、腫脹、疼痛等，如果得不到及時治療，則會導致關節畸形，使關節喪失正常功能[1-2]。類風濕性關節炎主要以關節病變為主，有著較高的發病率和致殘率，是一種全身性的疾病，嚴重影響患者的生活質量[3-4]。該病的發病較為隱匿，通常是從手指的近端關節、手掌關節最先起病，逐漸變為對稱性的關節受累。類風濕性關節炎的病因仍未完全明確，目前該病仍未找到治療的理想藥物[5]?？ǚ亲裘鬃鳛榈诙鞍酌敢种苿噍^于第一代蛋白酶抑制劑，具有抗多發性骨髓瘤的高效性及低毒性，且能夠一定程度地破壞類風濕性關節炎誘導的核因子-κB(NF-κB)活化，抑制破骨細胞的分化和形成，但第二代蛋白酶抑制劑能否用于臨床治療類風濕關節炎目前尚不清楚。所以，本研究使用第二代蛋白酶體抑制劑對類風濕性關節炎模型大鼠進行治療，旨在探討第二代蛋白酶體抑制劑對類風濕性關節炎模型大鼠的干預效果及作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取健康SD雄性大鼠(上海杰思捷公司) 30只，體質量165～190 g，平均(177.5±11.87)g，按照隨機數字法分為正常組、模型組、抑制劑組，各10只，于23 ℃、45%～55%濕度環境下喂養，飲用水與飼料均進行消毒后供實驗大鼠自由進食。

1.2主要試劑 兔源織織NF-κB/p65單克隆抗體(CST公司)；兔源核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)單克隆抗體(Abcam公司)；卡非佐米(艾酶捷科技有限公司)；完全弗氏佐劑(北京博蕾德生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1類風濕性關節炎建模及給藥 建模：參照陳璐璐等[6]研究中的方法造模，30只大鼠正常喂養1周后，正常組10只SD大鼠不予處理，對剩余20只大鼠進行建模。對模型組大鼠及抑制劑組大鼠右后足進行消毒后注射完全弗氏佐劑，每只0.1 mL，1周后在模型組、抑制劑組大鼠右后足進行消毒，消毒后注射不完全弗氏佐劑進行強化免疫，造模11 d后，當各組造模大鼠耳部、尾部結節等部位出現全身炎性反應時，視為造模成功。最終建模成功18只，隨機分為模型組9只，抑制劑組9只。給藥：抑制劑組SD大鼠在建模成功第1天起每隔2天對大鼠腹腔內注射第二代蛋白酶體抑制劑(溶解于0.5 mL DMSO溶劑中的1.5 mL卡非佐米)。

1.3.2關節炎評分標準[7]評分標準：無紅腫為0分，小趾關節輕度紅腫為1分，小趾關節和足跖腫脹為2分，踝關節下指甲腫脹為3分，所有指甲、關節腫脹為4分。按此標準對大鼠四肢病變程度進行評價并積分，計算關節炎評分。

1.3.3標本制備及染色 實驗第28天時，全身麻醉處死各組大鼠，在大鼠股動脈處取15 mL股動脈血，離心取得上清液，于-80 ℃冰箱保存待檢，另取得大鼠踝關節及膝關節滑膜組織，置于-80 ℃冰箱保存待檢。取大鼠踝關節液氮冷凍后常規脫水、透明、石蠟包埋，3 μm連續切片，將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的乙醇中。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用1% HCL-乙醇分化處理30 s，清洗之后使用1%伊紅染色，使用乙醇進行脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進行觀察。

1.3.4檢測方法 采用透射比濁法[8]檢測TNF-α、IL-6、IL-10、ALT、AST水平，采用Western blot法檢測NF-κB/p65、IκBα蛋白表達情況，采用酶聯免疫吸附試驗檢測SD大鼠IgA、IgM水平。

2 結 果

2.1各組大鼠關節滑膜組織病理圖 正常組大鼠關節滑膜組織健全，表面較平整光滑，關節滑膜組織中未見充血、水腫、增生的現象，未見炎癥細胞的侵入；模型組大鼠關節滑膜組織厚度增加，滑膜組織絨毛狀增生，并伴有大量的炎癥細胞入侵；抑制劑組大鼠關節滑膜組織細胞增生減少，有著少量的炎癥細胞入侵。見圖1。

注：A為正常組；B為模型組；C為抑制劑組。

2.2抑制劑組與模型組大鼠不同時間點關節炎評分比較 建模后第7、14、21天，抑制劑組大鼠的關節炎評分較模型組下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 抑制劑組與模型組大鼠不同時間點關節炎評分分]

2.3各組大鼠體內炎癥因子水平比較 與正常組相比，模型組大鼠TNF-α、IL-6水平上升，IL-10水平下降，且抑制劑組大鼠TNF-α、IL-10水平下降，IL-6水平上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組大鼠相比，抑制劑組大鼠TNF-α、IL-6水平下降，IL-10水平上升，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.4各組大鼠關節滑膜組織NF-κB/p65、IκBα蛋白表達水平比較 與正常組相比，模型組大鼠關節滑膜組織NF-κB/p65水平上升，IκBα水平下降，且抑制劑組大鼠關節滑膜組織NF-κB/p65水平下降，IκBα水平上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組關節滑膜組織NF-κB/p65水平下降，IκBα水平上升，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、4。

注：A為正常組；B為模型組；C為抑制劑組。

2.5各組大鼠IgA、IgM水平比較 與正常組相比，模型組大鼠IgA、IgM水平上升，且抑制劑組大鼠IgA、IgM水平上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組大鼠IgA、IgM水平下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

2.6各組大鼠ALT、AST水平比較 與正常組相比，模型組大鼠ALT、AST水平上升，且抑制劑組大鼠ALT水平下降，AST水平上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組大鼠ALT、AST水平下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

3 討 論

類風濕性關節炎是一種以關節病變為主的慢性自身免疫性疾病，該病在任何年齡段均可發病，以20～50歲為主，女性發病率是男性的2～3倍[9]。蛋白酶抑制劑在廣義上指的是與蛋白酶分子活性中心上的一些基團的結合，使得蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白變性的物質[10]。第二代蛋白酶抑制劑相較于一代蛋白酶抑制劑而言，具有抗多發性骨髓瘤的高效性和低毒性的特點?？ǚ亲裘鬃鳛榈诙鞍酌敢种苿?，是一種特異性、不可逆的靶向抑制劑,適用于多發性骨髓瘤患者的治療[11]。

臨床研究表明，類風濕性關節炎的發生、發展與機體炎癥有著密切關聯[12-13]。TNF-α、IL-6、IL-10是臨床較為常用的炎癥因子，通過檢測TNF-α、IL-6、IL-10水平能夠較為準確地評價類風濕性關節炎發展情況[14]。當關節滑膜周圍的巨噬細胞被激活，產生大量的炎性介質，炎性介質配合促炎因子、生長因子、趨化因子等，能夠引發炎癥，從而導致關節出現損傷。張傳英等[15]的研究顯示，類風濕性關節炎大鼠炎性標志物水平出現異常，對類風濕性關節炎大鼠進行有效的治療，能夠調控炎性標志物水平，抑制機體炎性反應。本研究結果顯示，采用第二代蛋白酶體抑制劑對類風濕性關節炎模型大鼠進行治療后，大鼠TNF-α、IL-6水平下降，IL-10水平上升，說明TNF-α、IL-6、IL-10有著密切關系，對TNF-α、IL-6、IL-10進行檢測有助于判斷類風濕性關節炎的發生、發展情況。

ALT存在于各種細胞內，以肝臟、心臟組織細胞為主，當其發生病變時，ALT水平會急劇增加[16]。AST主要分布在心肌，其次是肝臟、骨骼肌等組織中[17]。肖燕等[18]的研究顯示，類風濕性關節炎大鼠ALT、AST水平異常上升，進行有效治療后，類風濕關節炎大鼠ALT、AST水平降低。本研究結果顯示，使用第二代蛋白酶體抑制劑對類風濕性關節炎大鼠進行治療后，大鼠ALT、AST水平下降，與上述研究一致，說明使用第二代蛋白酶體抑制劑對類風濕性關節炎大鼠的治療效果較好。

相關資料顯示，NF-κB在眾多炎癥和免疫反應的調節中具有重要作用，也是炎性反應調控機制中的中心環節[19]。NF-κB參與多種細胞因子表達調控，如抗凋亡蛋白、Toll受體、細胞因子受體及誘導型氧化氮合酶的表達。有研究表明，NF-κB的激活、失活與泛素-蛋白酶體通路之間存在密切聯系，在免疫細胞炎性反應機制研究中是關注熱點[20]。泛素系統通過蛋白酶體降解NF-κB的抑制蛋白IκB，參與調節免疫炎癥細胞NF-κB的激活和再循環。NF-κB通常以無活性的形式存在于未受刺激的細胞內，其能夠調節免疫、炎性反應、細胞增殖及細胞凋亡[21]。本研究結果發現，使用第二代蛋白酶體抑制劑對類風濕性關節炎大鼠進行治療，能夠激活IκBα，抑制NF-κB/p65通路。

綜上所述，利用第二代蛋白酶體抑制劑對類風濕性關節炎模型大鼠進行治療，能夠通過抑制NF-κB/p65通路，調節大鼠體內的炎癥因子水平，降低關節炎的嚴重程度，效果顯著。