鼓粒期淹水脅迫對大豆葉片AsA-GSH 循環的損傷及烯效唑的緩解效應

王詩雅 ，鄭殿峰 ，馮乃杰 ，梁喜龍 ，3，項洪濤 ，馮勝杰 ，王新欣 ，左官強

（1. 黑龍江八一農墾大學農學院，黑龍江大慶163319；2. 廣東海洋大學濱海農業學院，廣東湛江524088；3. 黑龍江八一農墾大學植物生長調節劑工程技術研究中心，黑龍江大慶163319；4. 黑龍江省農業科學院耕作栽培研究所，黑龍江哈爾濱150086）

大豆（Glycine max）起源于中國，隨后于18 世紀傳入歐洲和美洲，是世界上最重要的豆科作物之一［1?2］。世界大豆總種植面積為1.2 億hm2，而中國大豆的種植面積為0.065 億hm2，約占全球總種植面積的5.4%［3］。黑龍江是中國優質大豆的主產區，種植面積占全國的50.1%［4］。黑龍江地處中國最北部，是典型的“氣候脆弱區”，夏季降水率變大，時空分布不均，且大雨、暴雨較為集中，加之黑龍江地勢平坦，農田排水困難，較易形成澇災［5?6］，對大豆生長構成嚴重威脅。

澇漬脅迫是季節性發生的環境災害，也是作物生長發育過程中遭受的主要非生物脅迫之一，對作物產量和品質的提升造成嚴重的負面影響［7］。正常條件下，植物體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）在抗氧化物酶調節下維持在一個恒定水平，但在逆境脅迫下ROS 的產生和清除機制受到破壞，可導致植物細胞受損［8］。研究指出，作物在脅迫下產生的ROS 和過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）具有破壞性，可導致酶失活和膜脂過氧化，甚至使細胞死亡［9?10］。抗壞血酸?谷胱甘肽（ascorbate-glutathione，AsA-GSH）循環是植物抗氧化防御系統的重要組成部分，主要由抗氧化物質還原型抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）與抗壞血酸過氧化物酶（aseorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）及脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbatereductase，DHAR）組成［11?12］。研究表明，植物體內 AsA-GSH 循環的快速運轉，能減輕 ROS 對植物的傷害［13］。郭欣欣等［14］研究指出，淹水脅迫導致不結球白菜（Brassica rapassp.chinensis）根系中H2O2含量和超氧陰離子產生速率（superoxide anion production rates，O2—·）顯著增加，且隨脅迫時間延長，對不結球白菜的傷害越大，在淹水脅迫初期通過保持較高的關鍵酶活性，來抵御脅迫造成的損傷。齊玉軍等［15］研究表明，淹水脅迫可使大豆膜脂過氧化程度增加和ROS 積累，使細胞膜受損，AsA 和GSH 作為非酶類可直接清除O2—·，APX、GR 等酶活性的增加可減少 H2O2含量對細胞膜的氧化攻擊。因此，AsA-GSH 循環是植物清除ROS 的酶促催化系統，在植物抵抗氧化脅迫、清除逆境ROS 積累方面具有重要作用［16?17］。

烯效唑（uniconazole，S3307）作為一種重要的植物生長延緩劑，可提高作物的抗逆性［18］，目前被廣泛應用，前人對S3307 在各種作物上的應用效果也進行了大量研究和報道，發現其可有效提高作物的光合作用［19?20］，提高酶活性［21］，增強作物對逆境的抵抗力［22?24］。S3307 通過提高作物內非酶抗氧化劑和滲透調節物質含量，提高抗氧化酶活性，進而減少ROS 的積累，維持ROS 代謝平衡，進而可緩解逆境對作物造成的傷害［25?26］。目前，淹水脅迫對大豆AsA-GSH 循環的影響研究較少，且關于S3307 緩解大豆淹水傷害的相關研究也尚未報道。因此，本試驗以耐澇性不同的2 個大豆品種為材料，探究S3307 對淹水脅迫下大豆葉片ROS 及AsA-GSH 循環中關鍵酶和抗氧化劑的影響，旨在為S3307 提高大豆的耐澇性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用耐澇品種‘墾豐14’和澇漬敏感品種‘墾豐16’為大豆試驗品種［27］。供試生長調節劑選用烯效唑（S3307），由黑龍江八一農墾大學植物生長調節劑工程技術研究中心提供。

1.2 試驗設計與處理

試驗于2019 年在黑龍江八一農墾大學國家雜糧工程技術研究中心盆栽場進行，采用帶有隔水層和排水口的樹脂花盆（上口徑×底徑×高=32 cm×23 cm×31 cm）進行盆栽試驗。試驗用土為栽培土、腐殖土和沙子按7∶2∶1 體積比例混合組成，每盆裝土18 kg。5 月19 日進行播種，試驗共設6 個處理，4 個單元為一個處理，每盆播種10 粒，子葉期定苗5 株，具體設計見表1。待植株生長至R5 期（鼓粒期，播種后95 d），進行葉面噴施S3307（濃度為 50 mg·L?1，噴施量為 225 L·hm?2），并于噴藥后第 5 天（播種后 100 d，淹水脅迫處理第 0 天，簡稱 R5+5）進行淹水處理（套盆淹水，水淹沒土表面高于土面2～3 cm 為準），淹水持續5 d（播種后第105 天，淹水第5 天，簡稱R5+10），5 d 后（播種后110 d，簡稱R5+15）放水恢復正常水分管理。處理期間，在上述3 個時間點進行取樣，每次選取4 株并采集功能葉片（倒三葉），各處理分別取樣后立即放入液氮中，而后置于?80 ℃冰箱中保存，供測定生理指標使用。

表1 試驗設計方案Table 1 Experiment design

1.3 測定項目及方法

按照高俊鳳［28］的方法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧陰離子（O2—·）產生速率、還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（glutathiol，GSSG）含量和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性；采用碘化鉀法［29］測定過氧化氫（H2O2）含量；采用 Zhang 等［30］的方法測定還原型抗壞血酸（AsA）和氧化型抗壞血酸（dehydroascorbate，DHA）含量；根據 Zhu 等［31］的方法測定谷胱甘肽還原酶（GR）活性；根據 Murshed 等［32］的方法測定脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性。采用試劑盒法（Solarbio 公司）測定單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2013 進行數據錄入及整理，用SPSS 25 作方差分析，用Origin 2018 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片膜脂過氧化程度的影響

由圖 1 可知，（R5+5）d 時，與各自對照相比，S3307 處理有效降低了兩大豆品種葉片的MDA 含量，但未達顯著差異水平。（R5+10）d 時，淹水脅迫下兩大豆品種葉片內MDA 含量顯著增加，其中，T2較T1顯著增加37.69%，T5較T4顯著增加70.09%；而與淹水脅迫相比，S3307 處理顯著降低淹水脅迫下兩大豆品種葉片內MDA 含量，其中，T3較T2降低4.57%，T6較T5降低24.69%，各處理間均達顯著差異水平。恢復正常水分處理5 d（R5+15）后，T2和T5的葉片內MDA 含量雖有降低，但仍高于T3和T6，且二者顯著高于兩品種的對照（T1和T4），說明葉面噴施S3307 可緩解淹水脅迫對大豆葉片膜脂過氧化的損傷，減輕淹水脅迫造成的傷害。

圖1 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片MDA 含量的影響Fig. 1 Effects of S3307 on MDA content in leaves of soybean under waterlogging stress at R5 stage

2.2 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片O2—·產生速率和H2O2含量的影響

由圖 2 可知，（R5+5）d 時，與對照（T1和 T4）相比，S3307 處理有效抑制墾豐 14 和墾豐 16 葉片內 O2—·產生速率，其中T3較T1降低6.77%，達顯著差異水平；T6較T4降低5.77%，未達顯著差異水平。（R5+10）d 時，兩大豆品種葉片內O2—·產生速率在淹水脅迫下與對照相比顯著增加，其中T2較T1顯著增加55.75%，T5較T4顯著增加32.05%。S3307 處理則有效抑制了兩大豆品種葉片內O2—·的產生速率，其中與T2相比T3略有降低，未達顯著差異水平；T6較T5顯著降低15.81%。恢復正常水分處理［（R5+15）d］后，淹水脅迫處理的墾豐14 T2和墾豐16 T5葉片內O2—·產生速率明顯降低，但高于兩品種S3307 處理，且均高于對照，其中墾豐14 T3處理恢復至T1水平，說明S3307 處理可抑制葉片內O2—·產生速率，且S3307 處理后，耐澇品種恢復能力強于澇漬敏感品種。

（R5+5）d 時，與對照（T1和 T4）相比，S3307 處理顯著降低了 T3和 T6葉片內 H2O2含量，其中 T3較 T1顯著降低2.72%；T6較 T4顯著降低 1.85%（圖 2）。（R5+10）d 時，墾豐 14 和墾豐 16 變化趨勢相同，淹水脅迫處理顯著增加了兩大豆品種葉片內H2O2含量，墾豐14 T2較T1顯著增加30.28%，墾豐16 T5較T4顯著增加15.74%，S3307 處理可減少H2O2的積累，其中，墾豐14 T3較T2降低3.52%，墾豐16 T6較T5降低2.4%。恢復正常水分處理［（R5+15）d］后，墾豐14 T2和T3與R5+10 d 時相比變化趨勢相同，但T2和T3的H2O2含量明顯降低，方差分析結果表明T2和 T3均顯著高于 T1；墾豐 16 T5和 T6與（R5+10）d 后相比略有降低，T5顯著高于 T6和 T4，T6顯著高于 T4。說明，葉面噴施S3307 后，耐澇品種墾豐14 在恢復正常水分處理后可有效抑制H2O2含量的積累，減緩脅迫對葉片的傷害；而對于澇漬敏感品種墾豐16 來說，淹水脅迫后葉片恢復能力較慢，淹水脅迫所造的傷害較大。

2.3 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片AsA 和DHA 含量的影響

由圖 3 可知，（R5+5）d 時，墾豐 14 和墾豐 16 在 S3307 處理下（T3和 T6）與各自對照（T1和 T4）相比，顯著增加了葉片內 AsA、DHA 和 AsA+DHA 含量，其中 T3較 T1分別顯著增加 4.44%、17.25%、3.02%；T6與 T4相比分別顯著增加8.65%、2.50%、6.05%。（R5+10）d 時，墾豐14 和墾豐16 各處理之間高低趨勢表現為：S3307＞淹水脅迫＞對照，且各處理間均達顯著差異水平，說明淹水脅迫提高了葉片內AsA、DHA 和AsA+DHA 含量，S3307 可進一步促進上述指標的增加。恢復正常水分處理［（R5+15）d］時，兩品種淹水脅迫和S3307 處理均有所降低，但S3307 處理仍顯著高于淹水脅迫處理，說明S3307 在恢復正常水分脅迫仍可使上述指標保持較高的含量，可有利于ROS 的清除。

2.4 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片GSH 和GSSG 含量的影響

由圖 4 可知，（R5+5）d 時，S3307 處理提高了 T3葉片內 GSH、GSSG 和 GSH+GSSG 含量，分別較 T1增加11.97%、15.35%、14.12%，達顯著差異水平；S3307 處理也提高了 T6葉片內 GSSG 和 GSH+GSSG 含量，T6較T4分別顯著增加19.16%和9.35%，但對提高GSH 含量效果不明顯。（R5+10）d 時，墾豐14 和墾豐16 各處理之間高低趨勢分別表現為T3＞T2＞T1和T6＞T5＞T4，方差分析結果表明各處理之間差異顯著，說明葉面噴施S3307 可提高淹水脅迫下大豆葉片內GSH、GSSG 和GSH+GSSG 含量。恢復正常水分處理［（R5+15）d］后，墾豐14 和墾豐16 淹水脅迫和S3307 處理與（R5+10）d 時相比明顯降低，但高低順序保持不變，說明恢復正常水分處理后，S3307 可維持墾豐14 和墾豐16 葉片內GSH、GSSG 和GSH+GSSG 含量，進而防止淹水脅迫對細胞膜的損傷，提高大豆的耐澇性。

圖4 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片GSH、GSSG 和GSH+GSSG 含量的影響Fig. 4 Effects of S3307 on GSH and GSSG and GSH+GSSG content in leaves of soybean under waterlogging stress at R5 stage

2.5 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片關鍵酶活性的影響

2.5.1 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片APX 活性的影響 由圖5 可知，（R5+5）d 時，與各自對照（T1和T4）相比，S3307 處理（T3和 T6）顯著提高了墾豐 14 和墾豐 16 葉片內 APX 活性，其中，T3較 T1增加 23.53%，T6較T4增加 26.83%。（R5+10）d 時，兩大豆品種淹水脅迫處理（T2和 T5）的葉片內 APX 活性顯著增加，S3307 處理（T3和T6）后可進一步促進淹水脅迫下APX 活性的增加。恢復正常水分處理［（R5+15）d］后，墾豐14 和墾豐16 淹水脅迫和S3307 處理APX 活性均有所下降，且高低趨勢與（R5+10）d 時相同，但 S3307 處理仍保持較高水平，說明恢復正常水分后，S3307 處理可維持較高的APX 活性，進而有效清除淹水脅迫產生的H2O2。

圖5 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片APX 活性的影響Fig. 5 Effects of S3307 on APX activity in leaves of soybean under waterlogging stress at R5 stage

2.5.2 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片GR 活性的影響 由圖 6 可知，（R5+5）d 時，S3307 處理對兩大豆品種葉片內GR 活性無明顯影響。（R5+10）d時，墾豐14 和墾豐16 各處理之間高低趨勢表現為T3＞T2＞T1和 T6＞T5＞T4，各處理間均達顯著差異水平，說明淹水脅迫可提高葉片內GR 活性，以抵御淹水脅迫造成的傷害，噴施S3307 后，可進一步促進葉片內GR 活性的提高。恢復正常水分處理［（R5+15）d］后，T3和 T2處理與（R5+10）d 時相比顯著下降，但趨勢相同；墾豐 16 T6和 T5與（R5+10）d 時相比略有降低，但T6仍保持較高水平。S3307 可延緩兩大豆品種葉片內GR 活性降低，但恢復正常水分處理后，澇漬敏感品種墾豐16 淹水脅迫處理降幅略小，說明澇漬敏感品種淹水后恢復能力較差。

圖6 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片GR 活性的影響Fig. 6 Effects of S3307 on GR activity in leaves of soybean under waterlogging stress at R5 stage

2.5.3 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片MD?HAR 活 性 的 影 響 由 圖 7 可 知 ，（R5+5）d 時 ，S3307 處理后T6葉片內MDHAR 活性與T4相比增加24.61%，達顯著差異水平；但S3307 處理對墾豐14 葉片內MDHAR 活性的增加效果不明顯。（R5+10）d時，顯著增加兩品種葉片內MDHAR 活性，且葉面噴施烯效唑后可進一步促進MDHAR 活性的提高，其中墾豐14 各處理之間高低趨勢表現為T3＞T2＞T1，墾豐16 各處理之間高低趨勢表現為T6＞T5＞T4，方差分析表明各處理之間差異顯著。恢復正常水分處理［（R5+15）d］后，墾豐 14 T3降幅小于 T2，T2恢復至 T1水平；墾豐16 T6降幅小于T5，T5恢復至T4水平。說明恢復正常水分處理后，葉面噴施S3307 具有延緩葉片內MDHAR 活性的作用。

圖7 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片MDHAR 活性的影響Fig. 7 Effects of S3307 on MDHAR activity in leaves of soybean under waterlogging stress at R5 stage

2.5.4 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片DHAR 活性的影響 由圖8 可知，（R5+5）d 時，S3307 處理對墾豐 14 和墾豐 16 葉片內 DHAR 活性無顯著影響。（R5+10）d 時，墾豐 14 各處理之間高低趨勢表現為 T3＞T2＞T1，墾豐16 各處理之間高低趨勢表現為T6＞T5＞T4，方差分析表明各處理之間差異顯著，淹水脅迫增加了兩大豆品種葉片內DHAR 活性，S3307 處理可進一步促進兩大豆品種葉片內DHAR 活性的提高。恢復正常水分處理［（R5+15）d］后，墾豐 14 和墾豐 16 淹水脅迫和 S3307處理DHAR 活性均有所下降，但淹水脅迫處理的降幅大于S3307 處理，且各處理間高低趨勢與（R5+10）d時相同，說明在恢復正常水分處理后，S3307 處理的兩大豆品種葉片內DHAR 活性可保持較高水平，延緩了DHAR 活性的降低，增強清除ROS 的能力。

圖8 烯效唑對R5 期淹水脅迫下大豆葉片DHAR 活性的影響Fig. 8 Effects of S3307 on DHAR activity in leaves of soybean under waterlogging stress at R5 stage

3 討論

3.1 R5 期淹水脅迫及S3307 處理對大豆膜脂過氧化程度的影響

MDA 是膜脂過氧化的主要產物，會對植物細胞產生氧化脅迫并導致膜系統損傷，造成氧化傷害，因此，MDA 含量的高低可直接反應膜脂過氧化的程度，常用作判斷脅迫損傷程度的指標［33］。MDA 可與膜上的蛋白質、酶等結合，從而引起蛋白質分子內和分子間的交聯，最終破壞膜的完整性以及喪失選擇透過性，引起質膜透性的升高，膜系統受到損傷［34］。本試驗結果表明，R5期淹水脅迫導致墾豐14 和墾豐16 葉片內MDA 含量大幅增加，加劇了膜脂過氧化程度，且澇漬敏感品種墾豐16受到的脅迫程度大于耐澇品種墾豐14，這與于奇等［24］對綠豆（Vigna radiata）的研究結果一致。研究表明，S3307能夠影響植物體內自由基和△-二氫吡咯-5-羧酸合成酶的合成，自由基作用于膜脂過氧化合成，最終產物是MDA，S3307 處理可抑制自由基的合成，并降低MDA 含量，提高作物的耐寒性［22］。本試驗結果表明，葉面噴施S3307 后，可抑制淹水脅迫下兩品種葉片內MDA 含量的增加，并在恢復正常水分處理后顯著降低，與耐澇品種墾豐14 相比澇漬敏感品種墾豐16 恢復較慢，說明外施S3307 可緩解淹水脅迫對大豆葉片膜脂過氧化程度的影響，增強大豆的耐澇性。

3.2 R5 期淹水脅迫及S3307 處理對大豆活性氧代謝的影響

ROS 是植物生長發育中非常重要的角色，正常條件下濃度較低，主要作為信號分子調節植物的生長發育；當受到逆境脅迫時，植物體內的ROS 會急劇積累，而高濃度的ROS 會直接影響細胞的正常發育［35］，加快O2—·產生速率和增加H2O2含量，進而破壞膜脂過氧化程度，抑制植物正常生長發育。本試驗結果表明，淹水脅迫導致兩品種葉片內O2—·產生速率顯著增加，這與于奇［36］研究淹水脅迫對綠豆O2—·產生速率影響的結果類似。同時，淹水脅迫還增加了兩大豆品種葉片內H2O2含量，與對照相比，分別增加了1.48 和1.43 倍。研究指出，S3307 處理后可降低ROS 過度積累造成的膜損傷，提高作物在逆境脅迫下的耐受性［37］。本試驗表明，S3307 可有效降低淹水脅迫下兩大豆品種葉片內O2—·產生速率和H2O2含量的積累，說明S3307 對維持ROS 平衡具有積極作用。

3.3 R5 期淹水脅迫及S3307 處理對大豆AsA-GSH 循環的影響

當植物處于淹水脅迫狀態時，細胞內正常的ROS 代謝平衡會遭到破壞，進而影響植物的正常生長代謝［38］。前人曾指出，為應對氧化脅迫，植物體內進化出復雜的防御系統，其中，AsA、GSH 含量和AsA-GSH 循環中關鍵酶活性可起到清 除 ROS 的作用［16］。APX 可 催化 AsA 清除 H2O2生成 MDHAR，且 MDHAR 可協同 APX 清除H2O2；GR 可生成 AsA 進一步降低氧化應激［39?40］。本研究結果表明，淹水脅迫可導致兩大豆品種內 APX、GR 和MDHAR 活性升高，說明在淹水脅迫下，H2O2的產生促使兩大豆品種葉片APX、GR 和MDHAR 活性的增加，以清除過量的H2O2，該結果與齊玉軍等［15］研究淹水脅迫對大豆AsA-GSH 循環中關鍵酶活性的影響相似。外施S3307 后，可進一步促進上述3 種酶活性的增加，說明S3307 增強了清除H2O2的能力。DHAR 是存在于AsA 和DHA 之間的一種關鍵酶，在GSH 存在的條件下，催化DHA 向AsA 轉變［41］。本研究表明，淹水脅迫下DHAR 含量也呈增加趨勢，且S3307 處理后進一步增加了DHAR 活性，說明S3307 可促進DHAR 活性的提高，有助于AsA的產生。恢復正常水分處理后，淹水脅迫解除，抗氧化酶活性降低，但未能恢復至正常生理狀態，說明淹水脅迫對葉片的傷害較大；S3307 處理的葉片內關鍵酶活性和在脅迫解除后維持較高水平，說明S3307 具有延緩關鍵酶活性降低的作用。AsA 和GSH 是重要的抗氧化劑，可降低O2—·產生速率，并催化 H2O2生成 H2O 和 O2，促進膜蛋白的穩定性，同時，也可作為清除ROS 的調控信號［42?43］。本試驗結果表明，淹水脅迫導致葉片內AsA、GSH、DHA、GSSG、AsA+DHA 和GSH+GSSG 含量顯著增加，S3307 處理后對上述指標有更明顯的促進作用，維持更高的抗氧化能力。脅迫解除后，S3307 可保持較高的抗氧化劑含量，有助于兩大豆品種快速恢復至正常生理狀態。

4 結論

R5 期，葉面噴施S3307 能有效提高大豆葉片AsA-GSH 循環中非酶抗氧化劑和關鍵酶活性，維持大豆的正常生長發育；淹水脅迫后導致大豆葉片內ROS 積累和膜質過氧化程度的提高，且澇漬敏感品種墾豐16 的增幅大于耐澇品種墾豐14，同時，促進AsA-GSH 循環中非酶抗氧化劑和關鍵酶活性的提高，是大豆對淹水脅迫所產生的應激反應，通過兩者的協同作用，抵抗ROS 和MDA 對細胞造成的傷害，兩品種非酶抗氧化劑和關鍵酶活性雖有提高，但墾豐16 的幅度低于墾豐14，說明墾豐16 受到的傷害大于墾豐14。葉面噴施50 mg·L?1S3307 具有抵御淹水脅迫，減緩作物受損的作用，增加淹水脅迫下關鍵酶活性和抗氧化劑含量，有效減少ROS 積累，并維持ROS代謝平衡，緩解淹水脅迫對大豆造成的氧化損傷，在恢復正常水分處理后，通過保持較高的非酶抗氧化劑含量和關鍵酶活性，促進兩大豆品種恢復至正常生長狀態。