禾草-內生真菌人工接種技術研究進展

李春杰，郎鳴曉，陳振江，王正鳳，陳泰祥

（蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室，蘭州大學草地農業教育部工程研究中心，蘭州大學甘肅省西部草業技術創新中心，蘭州大學草地微生物研究中心，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅蘭州730020）

禾草內生真菌（grass fungal endophyte）是指在宿主禾草中度過部分或全部生命周期，而對禾草本身不引起任何外部癥狀的一類真菌［1］。現在研究較多的禾草內生真菌是子囊菌門（Asomycota）麥角菌科（Clavicipitaceae）的有性世代Epichlo?屬內生真菌及其所對應無性世代Neotyphodium屬，2014 年，Leuchtmann 等［2］將這兩種屬的內生真菌統一歸總為Epichlo?屬。目前，在全球范圍內已發現80 個屬300 多種禾草中存在有內生真菌［3?4］。一方面，禾草內生真菌共生體能夠產生對家畜有毒的生物堿，給畜牧業發展帶來巨大阻礙和經濟損失；但另一方面，禾草內生真菌共生對宿主和內生真菌皆有利：內生真菌從宿主植物體內獲取自身所需營養、進行繁殖，并通過宿主植物傳播，而內生真菌往往能夠提高宿主植物對干旱［5］、鹽堿［6］、重金屬［7］、寒冷［8］和水澇［9］等非生物脅迫的耐受性和抵抗昆蟲［10］、病原菌［11?13］、線蟲［14］等生物脅迫的能力，部分內生真菌還能夠用于生物防治［15］、生成生長激素，以促進宿主植物生長和發育［16］，提高植物的競爭能力［17］和維持生態系統平衡［18］；同時，共生體產生的有毒生物堿能夠使家畜中毒，在一定程度上能夠減少草食動物的采食進而保護禾草［19］。內生真菌在植物中分布十分廣泛，其宿主植物包括草本、灌木、喬木及藻類等，尤其在禾本科植物中分布最多［20］。內生真菌在畜牧業和農業上都有很大的經濟價值和應用潛力［21］，然而，自然界中大多數禾草只能被一種內生真菌所侵染，僅有一小部分內生真菌可與多個宿主共生或宿主可與多種內生真菌共生［22］。研究發現，同一種內生真菌與同種宿主的不同品種共生，其對兩個不同品種宿主植物的影響有差異［23］（表1）。同時，野生禾草相較于被馴化的禾草，其內生真菌的侵染與定殖不穩定，受生長環境、宿主特性、生長年限等因素影響［24?26］，這都使得禾草?內生真菌共生體優良性狀的應用與推廣受到限制。由于禾本科植物內生真菌的宿主特異性，以及人工接種過程操作要求高，同時還需破壞植物組織而導致宿主死亡率高，使得人工接種成功率較低。1985 年Latch 等［27］用無菌苗轉接法成功接種禾草，研究不同宿主與不同內生真菌種類組合以及不同接種方法等因素對接種成功率的綜合影響，使禾草內生真菌人工接種方法逐步建立起來。

表1 不同禾草-內生真菌組合人工接種結果Table 1 Artificial inoculation results of different grass-endophytic fungi combinations

禾草內生真菌人工接種最常見的方法是切口法和注射法，但這兩種方法的缺點是可對禾草植株造成一定的物理傷害而導致植株尤其是幼苗死亡率高。種子浸菌法和種子傷口法需要在種子上造成一定的創口，再將菌懸液或菌絲接入創口內，兩種接種方法更適用于接種無性繁殖的內生真菌。愈傷組織接種法可供選擇的外植體較多：莖節、花穗、花序、幼穗、未成熟胚及成熟種子均可作為材料［28?30］，但該技術的缺點是在禾本科植物上應用相對困難，一是因為禾本科植物的組織培養再生對基因型有較強的依賴，其胚性愈傷組織再生率低；二是禾本科植物組織培養再生體系不夠完善，成熟的組織培養再生體系并不一定適用于禾本科植物；三是禾本科植物組培常用成熟種子（胚）作為外植體，其誘導的胚性愈傷組織比例低，且需要繼代培養，所需周期長，又會使愈傷組織分化率降低［31］。在禾草組織培養再生體系全面建立的前提下，愈傷組織接種法的潛在成功率相對較高。成株接種法適用于已經生長健壯的成株植物，健壯植株的抵抗力較好，對其造成物理傷害不易死亡，但缺點是由于成株具有較強抵抗外來真菌的能力而使該方法接種成功率較低（表2）。

表2 不同接種方法操作步驟及接種成功率Table 2 Different inoculation methods and inoculation rate

續表1 Continued Table 1

本研究對國內外禾草內生真菌人工接種方法進行綜述，為建立創新人工接種技術，選擇合適的接種手段，充分利用內生真菌資源，構建優良禾草內生真菌共生體，以消除自然界內共生體的局限性，擴大內生真菌在禾草中的共生范圍，為創制新的禾草內生真菌共生體種質資源提供理論基礎和科學依據。

1 無菌苗接種法

禾草內生真菌人工接種方法研究初期，多以無菌苗為試驗材料，主要有兩種接種方法：將菌絲體置于無菌苗特定部位和傷口部位進行培養，其傷口部位多在無菌苗胚芽鞘和中胚軸之間。傷口接種法是事先在無菌苗特定部位切開傷口，將培養好的真菌菌絲放入其中，于適宜條件下培養幼苗。研究發現，將菌絲接入無菌苗傷口的接種效果遠好于直接將菌絲體放在無菌苗組織上［27］。最早國際知名的內生真菌學專家Latch 等［27］以多年生黑麥草（L. perenne）、高羊茅（F. arundinacea）和紫羊茅（F. rubra）為研究對象，從無內生真菌共生的植物中獲取不帶內生真菌的種子，消毒后在無菌條件下培養得到無菌苗，將培養得到的真菌菌絲體用以下3 種方法接入幼苗：1）直接在無菌苗中胚軸及胚芽鞘交界處放置菌絲體；2）在無菌苗中胚軸及胚芽鞘交界處切一個3～5 mm 的縱向切口，并取出切口植物組織，將菌絲體放入；3）在無菌苗中胚軸及胚芽鞘交界處切一個3～5 mm 的縱向切口，將菌絲體直接接入。經檢測，該試驗總的接種成功率為10.8%，對植物不同的處理方式也直接影響到幼苗接種成功率。我國第一次采用幼苗切口法將內生真菌接入高羊茅和多年生黑麥草，得到成功接種的禾草內生真菌共生體，但其接種率較低，不同組合的接種效率分別為0.94%和1.00%［21］。將Epichlo?屬內生真菌參考Latch 等［27］的方法導入小麥（T. aestivum）、大麥（H. vulgare）和黑麥（Secale cereale）中，結果僅在黑麥和小麥接種成功，但發現感染了內生真菌的植株出現了發育不良或矮化的癥狀［23］，由此可見內生真菌對親緣關系不同的宿主植物有不同的影響。2015 年，陳麗［32］將甘肅內生真菌（E. gansuensis）用無菌苗接種法接入醉馬草（A. inebrians）無菌苗中，獲得了比較高的接種率，為21%。王正鳳［33］將E. bromicola內生真菌接入大麥無菌苗中，得到侵染率為2%的新共生體，這是國內首次將禾草內生真菌接入作物大麥中，為今后禾谷類作物的種質創新提供新的研究方向。無菌苗傷口接種法操作簡單，但此方法的缺點是對幼苗產生的物理傷害往往會造成幼苗高死亡率，且不適用于相對細弱的幼苗和成熟組織。總之，無菌苗接種法仍是目前應用最為普遍的接種方法。

2 注射接種法

注射法常以幼苗為對象，取內生真菌菌絲制成菌懸液或直接將菌絲隨無菌水一同注入幼苗內以侵染植株，其注射部位通常為幼苗莖基部分生區［34］和幼苗生長點［35］。將扁芒草屬（Danthoniasp.）、針茅屬（Stipasp.）和洋狗尾草屬（Cynosurussp.）種子消毒后在無菌條件下培育成幼苗，待幼苗培育好后，用無菌注射器將菌絲體或分生孢子隨無菌水注入幼苗分生組織上方中，經檢測，接種成功率為0～100%。該試驗接種成功率差異較大，其結果與宿主及內生真菌是否兼容有極大關聯，同時，接種成功率與接種時幼苗的年齡密切相關，且接種后菌絲的定殖環境對接種成功率也有影響［36］。用從羊茅中分離出的E. typhina內生真菌制成菌懸液注射侵染5 種高羊茅商業品種，得到總接種成功率為2.5%［35］。注射法的缺點是其操作過程較為繁瑣，接種過程中技術要求和環境條件較高，但通過試驗，發現注射法相較于種子浸菌法侵染率更高［35］。建議在進行無菌苗接種法和注射接種法之前做足夠的預試驗，待充分掌握此兩種技術后再進行后續大量接種。

3 種子接種法

3.1 種子浸菌法

Epichlo?內生真菌菌絲在宿主植物中的侵染過程為先侵入芽原基，而后侵入花原基，并隨著花原基發育為小花最后侵染進入種子，并通過種子進行垂直傳播［33］。因此，Epichlo?內生真菌可通過菌絲接種于種子進行侵染。將不含內生真菌的高羊茅種子消毒處理后剪破，置于含有菌懸液的培養皿或錐形瓶中封口培養，并按時澆灌菌懸液，其接種成功率為2.1%。注射法和種子浸菌法都是將菌懸液導入植株體內［35］，與注射法相比，種子浸菌法操作簡便，但該方法的缺點是需要破壞種子，雖利于菌絲侵入，卻同時破壞了種子結構，影響了種子正常生長發育，降低了種子的存活率，進而導致菌絲體在種子發芽生長過程中難以進入幼苗而繼續正常生長。

3.2 種子傷口法

種子傷口法是直接使菌絲體生長進種子傷口的方法。通過嘗試試驗，在消毒后的多年生黑麥草、高羊茅和冰草（Agropyron cristatum）種子胚部剪一小口，將內生真菌菌絲接入傷口，最終種子成活率低且成活的接種苗均未被感染［21］。發明專利表明，用無菌的接種針刺穿消過毒的種子，將刺穿的種子放在有內生真菌菌落的培養瓶中繼續培養［37］。種子接種法的優點是其接種周期短，且操作要求較低［37］，但缺點在于該方法是一種新的人工接種技術的嘗試，目前接種成功率并不高，需要在接下來的試驗中探索該方法的可行性。在要求高接種成功率的同時，還要保證種子發芽率和幼苗成活率。

4 愈傷組織接種法

組織培養是指在無菌環境中，以植物組織為材料進行人工培養，獲得再生完整植株的技術，是利用愈傷組織人工接種法培育禾草內生真菌共生體的首要條件［21］。胚和幼苗是植物生命周期中內生真菌自然侵入的唯一階段，因此，許多學者試圖在體外模擬這一過程［38］。愈傷組織接種法需要經過愈傷組織的誘導、分化、生根和再生等過程，其中，誘導和分化是關鍵步驟，且愈傷組織的誘導率和分化率與外植體類型、植物基因型、培養基種類以及培養基中激素濃度及比例有關［39］，不同的外植體最佳激素濃度不同，以幼穗和未成熟胚為外植體誘導的愈傷組織分化率高于莖和花序，且出愈率高于成熟種子，但其取材易受時空條件限制，而由成熟種子為外植體誘導的愈傷組織植物再生頻率高且取材方便，因此成為誘導愈傷組織的理想材料［30］。Johnson 等［40］研究發現，將E.coenophiala接入高羊茅由花梗誘導出的愈傷組織中，最終得到侵染成功率為17%的高羊茅內生真菌共生體，同時在新的共生體中檢測到了生物堿的積累。用E. coenophiala侵染高羊茅，發現內生真菌接種在體細胞胚上得到最高的侵染率為5%［38］。國內首次將E. typhina、E. coenophiala和Epochlo?sp. 內生真菌接入由禾本科植物：多年生黑麥草、高羊茅和翦股穎（Agrostis stolonifera）的種子和胚為外植體所誘導的愈傷組織中。當愈傷組織上出現黃綠色幼芽，將內生真菌菌絲制成的孢子懸液接入分化芽切口，再進行培養得到共生體，不同組合的接種效率分別為3.6%、3.6%和7.9%，并通過分離培養驗證得到了新的多年生黑麥草?E. typhina共生體［21］。與無菌苗轉接法相比，愈傷組織法的缺點在于操作更為繁瑣，周期長且制作成本高。但該方法的優點是不受季節和地理位置的限制［41］，有研究者通過試驗對比愈傷組織和傷口法的接種成功率，發現愈傷組織法接種的幼苗更易受到內生真菌的侵染［21］，且選用成熟胚作為外植體的愈傷組織誘導效果好于種子［42?43］。提高愈傷組織接種的成功率，要提高愈傷組織誘導率和分化率，在操作過程中減少愈傷組織的感染，優化再生植株的生長條件［21］（表3）。

表3 不同植物及外植體誘導愈傷組織所需激素濃度Table 3 Hormone concentration required for callus induction in different plant species and explants

5 成株接種法

成株接種法是將菌絲體或菌懸液直接塞入或注入事先在成株基部切好的傷口中進行培養。研究者將內生真菌菌絲接入或注射于黑麥草成熟分蘗基部［27］，以及將菌絲塞入事先在生長健壯的成株高羊茅基部劃開的傷口中進行培養［35］，結果發現這兩項試驗均未獲得成功感染的植株。該方法在使用時需要選取健壯的禾草植株，且在基部的傷口不可過深，在試驗過程中注意保持植株的直立狀態，避免其出現倒伏。南開大學高玉葆課題組用成株分蘗轉接法接種高羊茅，得到接種成功率為3%的高羊茅內生真菌共生體［33］。成株接種法缺點在于成熟植株傷口較大，病菌容易侵入而影響植株的正常生長，而且健壯的植株自身具備抵御外源菌侵入的能力，塞入切口中的菌絲體很難定殖［35］，但相較于無菌苗接種法，該方法的優點在于可應用于成熟的禾草植株，且接種條件要求較低。

6 展望

我國幅員遼闊，地大物博，有著豐富的植物物種資源，其中包括超過225 個屬近1200 個種的禾本科植物［50］，且目前已在全世界范圍內發現至少80 個屬300 余種禾本科植物帶有內生真菌［33］，在我國，早熟禾屬（Poa）、羊茅屬、披堿草屬（Elymus）等21 屬77 種禾草植物中發現Epichlo?內生真菌［51］。研究發現，禾草與內生真菌共生能夠在其品質、產量、抗性等方面發揮積極作用，因此，利用內生真菌對禾草進行種質創新是近年來國際草業領域的發展趨勢［52］。關于內生真菌對寄主禾草的生長發育、品質及抗逆性影響的研究很多，但由于內生真菌的宿主特異性，其對宿主的良性影響并不能在多種禾草上體現，新西蘭學者嘗試用人工接種技術將從小麥族植物分離出的內生真菌接入小麥、大麥和黑麥等麥類作物中，發現不同宿主基因型對內生真菌侵染的效應存在差異［23］。內生真菌具有雙重特性，通過在內生真菌菌種資源中篩選對家畜不產生有毒物質及提高宿主抗性等具有優良特性的菌株，并利用人工接種技術建立新的高產優質、抗逆無毒的禾草?內生真菌共生體，在提高禾草產量、品質、確保人類及家畜食用安全性方面有重要意義［53］。

在國際學術界，關于禾草內生真菌人工接種技術的研究并不多，且成功的人工接種技術受專利保護［52］。而關于內生真菌與非禾本科植物的接種技術及禾草與病原菌［54?55］、菌根真菌［56?57］的接種技術研究較多，但這兩方面的接種技術并不完全適用于共生真菌接種禾本科植物。在許多研究中，用不同內生真菌接種禾草，禾草未必能夠被所有真菌侵染，這不僅僅是由于宿主特異性的影響，在接種方式的選擇、宿主植物基因型、內生真菌基因型、植物組織類型、宿主處理方式及后續培養條件等方面對接種成功率都有極大的影響。目前，國內外針對禾草的人工接種方法，主要是以無菌苗、愈傷組織、種子及成株為材料的方式。無菌苗接種法和注射接種法在目前研究中廣泛使用，其操作簡便高效，適用于大批量接種，但其缺點在于操作過程需對幼苗造成傷口，易被其他病原菌感染，且幼苗較弱易死亡；愈傷組織接種法優點在于成功率相對較高，而缺點是需建立成熟的組織培養再生體系，目前只有少數禾草建立起完整的組織培養再生體系，故該方法的應用具有較大局限性；以種子為材料進行的人工接種方法如種子傷口法和種子浸菌法，是基于內生真菌能夠通過垂直傳播直接進入植物地上部，因而是人工接種技術創新的一個重要方向；種子浸菌法優點是在內生細菌、病原菌、內生真菌接種方面都有很好的應用，且其宿主植物不局限于禾草，但該方法的缺點是接種過程中可能由于破壞種子結構而造成種子失活，同時其侵染率往往低于無菌苗接種法，故此方法在試驗研究中應用較多，而實際生產操作中推廣不足；以成株為材料的接種方法和種子接種法目前在試驗階段，接種成功率尚且不高，在實際操作中并未廣泛使用。學者們提出并嘗試了愈傷組織與內生真菌共培養的接種新方法，在不傷害植物組織的前提下，使內生真菌與植物自然共生，但尚未成功，方法還正在優化中。

針對人工接種技術對試驗材料的破壞及在培養過程中易受到雜菌污染導致接種成功率低等問題，應當通過大量試驗操作，對不同禾草品種建立起最適接種條件和接種操作要求，在保證接種成功率的同時要盡量簡化接種步驟，以便進一步在實際生產中推廣應用。對于尚在試驗階段的人工接種技術，應當分析試驗材料生理特點與試驗操作技術在科學性和操作性方面是否切實可行。近年來，分子生物技術和基因組學研究發展迅速，對內生真菌的系統研究也有了很大的促進作用。新一代測序技術，如全基因組測序技術的應用，對內生真菌生物堿合成相關基因的探索分析，為了解寄主與真菌相互作用的基因表達奠定了基礎［58］。美國肯塔基大學Christopher Schardl 教授和澳大利亞維多利亞農業生物研究中心German Spangenberg 教授在實驗室相繼完成了對不同禾草內生真菌的全基因組測序，使全球的科學家能夠共同探索影響真菌與宿主關系的相關基因［59?61］。因此，應進一步借助分子生物學手段解決內生真菌與宿主的遺傳穩定性和相容性差的問題，為禾草內生真菌共生體的研究提供更多理論支持。總之，不同領域的研究與技術相互融合，更加系統和完善的新技術與新發現都將應用于禾草內生真菌人工接種技術中，為創建新的禾草內生真菌共生體提供理論依據。

隨著禾草內生真菌共生體建立與功能等領域研究的不斷深入，接種的內生真菌在禾草子代中穩定遺傳成為一大研究趨勢。結合現有接種和生物工程技術，建立能在禾本科植物中穩定遺傳的禾草內生真菌共生體的人工接種方法勢在必行。研究發現內生真菌基因組中帶有能使家畜等其他動物中毒的基因，這為禾草內生真菌新共生體的建立帶來新的問題，新共生體的建立不應只局限于高接種成功率這層次，應當深入到內生真菌產堿基因中，研究產堿基因的表達及調控機理，分析其對家畜、生態環境甚至人類的潛在危險，并進行風險評估，以期獲得最有利于人類及生態環境的真菌與植物資源。現有的內生真菌接種方法只能針對內生真菌對宿主是否能夠侵染及兼容，并不能準確判斷內生真菌對宿主的影響。目前，新接種方法研究的不斷發展為禾草內生真菌人工接種技術提供了更多啟示。因此，應結合傳統與新開發的人工接種技術，針對禾草植株的外部形態、物種特異性、受體組織類型及其生長狀態，建立適用于不同禾草和內生真菌的技術手段進行人工接種，這樣才能更好更快地建立目標共生體，創制優異種質，培育抗逆的優良品種。