馬鈴薯黑脛病離體葉柄接種方法的應用效果分析

蘇玉靜 張樂樂 楊正威 陳紅旭 劉帥 楊世瑋 申順善 孫凱樂 孫治強

摘 要：利用馬鈴薯離體葉柄接種方法分別比較了5種不同接種濃度、4個不同接種時間的接種效果的差異，并利用該方法鑒定了14份馬鈴薯品種對黑脛病的抗性。在試驗中發現，使用馬鈴薯黑脛病菌濃度為103 CFU·mL-1，并且在接種馬鈴薯離體葉柄后36 h記錄統計的接種效果較好。同時，利用該方法對14份馬鈴薯品種進行接種鑒定，鑒定出高抗品種2份、中抗品種5份、中感品種3份、高感品種4份，并且與傳統主莖注射接種方法進行了比較，發現2種方法的抗性鑒定結果相近。因此利用離體葉柄接種方法鑒定出的馬鈴薯品種的抗性可為今后馬鈴薯黑脛病抗性育種提供一定的理論支持。

關鍵詞：馬鈴薯;黑脛病;離體葉柄接種;抗病鑒定

中圖分類號：S532 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）05-093-08

Inoculation method of potato black leg using the detached petiole

SU Yujing 1， ZHANG Lele1， YANG Zhengwei1， CHEN Hongxu1， LIU Shuai 1， YANG Shiwei1， SHEN Shunshan2， SUN Kaile1， SUN Zhiqiang1

（1. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Plant Protection， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to find a simple and repeatable inoculation method for potato black leg， five inoculation concentrations and four inoculation time points were tested by using the detached potato petioles. And then， 14 potato varieties were identified by using this method. The inoculated concentration with setting as 103 CFU·mL-1 and the infected petioles scored at 36 hour post inoculation （hpi） showed the stable infection results. 14 potato varieties were inoculated and identified the resistance by using this method. Also， it compared with the injection method using stem. The results shown that 14 potato varieties were distinguished into four groups： the resistance （2 varieties）， the medium resistance （5 varieties）， the medium susceptibility （3 varieties）， and the susceptibility （4 varieties）. In conclusion， the inoculation method using the detached petiole can be applied in? potato resistance breeding of black leg.

Key words： Potato; Potato black leg; Detached petiole inoculation; Resistance identification

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）營養豐富，是世界上廣泛種植的塊莖作物，也是僅次于小麥、水稻和玉米種植面積和總產量的第四大糧食作物[1]。根據聯合國糧農組織數據，全球馬鈴薯產量和種植面積分別在2014年和2015年達到最大值，之后每年的產量一直保持在4.5億t以上，種植面積一直保持在2.4×107 hm2左右[2]。但馬鈴薯的生產過程受到一系列病害的威脅，其中黑脛病是危害馬鈴薯生產的破壞性病害之一，在我國的病害發生面積總體呈上升趨勢[3]。黑脛病作為溫帶地區對馬鈴薯造成嚴重損害的重要細菌性病害之一，病株率的平均水平為3%～5%，嚴重時可達50%[4]。引起黑脛病最常見的細菌種類是果膠桿菌屬Pectobacterium，包括Pectobacterium carotovora subsp. carotovora （Pcc）（原稱Erwinia carotovora subsp. carotovora）;P. atrosepticum（Pca）（原稱 E. carotovora subsp. atroseptica） [5-8]。該病菌主要通過維管束組織侵染馬鈴薯的塊莖和地上莖部，在馬鈴薯整個生長發育階段都可發病[9]，發病癥狀主要表現為植株矮化，葉片卷曲萎焉、黃化脫落，莖部組織發黑，塊莖腐爛[10]。該病菌的主要傳播方式是借助帶病種薯通過土壤、灌溉水、昆蟲等傳播途徑傳染給其他有傷口的健康種薯，并且在高溫高濕條件下會大大增加發病概率[11]。

黑脛病菌入侵馬鈴薯的機制主要是產生多種細胞壁降解酶，包括果膠酶、纖維素酶、蛋白酶和木聚糖酶，尤其是果膠酶分解果膠物質，釋放出營養物質供病菌生活，使植物組織腐爛變軟，由于腐爛組織的高滲透壓，水分從細胞擴散到細胞間隙，導致細胞質壁分離、塌陷和死亡[12-13]。細菌在細胞間隙移動并繁殖，產生的酶會提前進入細胞為入侵組織做好準備[14]。此外，還有其他致病因子的協助入侵，包括胞外水解酶、脂多糖、碳青霉烯抗生素等，并通過一系列的分泌系統來分泌這些致病因子[15-23]。黑脛病菌還存在著依靠群體密度的群體感應（Quorum sensing，QS）調控系統，利用可自由擴散的化學信號分子，在病菌入侵植物時發揮著重要作用[24]。

目前針對馬鈴薯黑脛病的防治方法除了農業栽培管理防治措施和化學防治措施以外，利用抗病品種也是防治細菌病害最重要的措施。盡管不同馬鈴薯品種對黑脛病菌的易感性各不相同，但目前還沒有一個已知品種對該病菌存在完全抗性[25]。雖然有些栽培種如Karaka和Dawn，以及來自中美洲和南美洲的野生馬鈴薯品種，對黑脛病菌表現出良好的抗性，但這些野生二倍體馬鈴薯品種和四倍體馬鈴薯品種的雜交后代表現出產量低、塊莖中存在對人體和動物有毒的生物堿糖苷等缺點[26-28]。除此之外，阻礙馬鈴薯黑脛病抗性育種的一個重要問題是在目前的抗性材料篩選過程中篩選黑脛病抗性品系比較困難，在篩選過程中沒有具體的指導方針，缺乏一種普遍接受的接種和鑒定方法。當使用不同的篩查方法時，病害的嚴重程度可能會大不相同。目前常用的接種鑒定方式有如下幾種，宋揚等[29-30]對健康塊莖進行穿刺后注入菌懸浮液，待5 d或者7 d后調查病情，這種方式的局限性在于需要等馬鈴薯整個種植收獲期結束才能獲得試驗薯塊;其次還存在接種之后的薯塊無法再食用造成的資源浪費以及病情調查鑒定時間久等問題。除此以外，還有Mohan[31]使用的主莖注射接種鑒定法，該方法選取植株（約4周齡）第2片完全展開的真葉連接的莖部進行穿刺注射菌懸浮液，等待10 d左右調查病情;Marquez-Villavicencio[32]對生長4周齡植株的莖部每隔3 cm的5個不同位置進行穿刺注射菌懸浮液后，將接種的植株放入塑料袋等待13.5 h進行相關試驗研究。這2種注射或穿刺接種的方式會將病菌帶入土壤造成污染，植株也會由于病菌侵染而無法繼續生長。綜上，目前對馬鈴薯黑脛病接種鑒定方式存在著接種過程時間較長、資源浪費、污染土壤等問題。本研究的目的是開發一種穩定、快捷評價馬鈴薯黑脛病抗性的簡單可重復的離體葉柄接種方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病菌及培養基：病原菌菌株P. carotovorum subsp. brasiliense strain 212由河南農業大學植物保護學院提供。14個供試馬鈴薯品種為河南農業大學園藝學院茄科抗病種質創新研究團隊收集并保存，材料名稱、來源及類型見表1。

病菌培養所用的培養基為胰酪大豆胨瓊脂培養基（tryptic soy agar，TSA），制備病菌懸浮液（簡稱“菌懸液”）的MES溶液組成為MES 2.13 g，MS 4.3 g，無菌水1000 mL，pH 5.8。接種工具及測定儀器：接種菌懸浮液倒入60 mm×60 mm×90 mm的方形透明組培瓶，離體葉柄插入長度5.8 cm、厚度0.5 cm的正方形干燥花泥（Oasis）中，發病高度用刻度尺測量。

1.2 試驗設計

將14個不同的馬鈴薯品種的塊莖進行赤霉素浸種催芽，整薯催芽用10～20 mg·kg-1赤霉素溶液浸泡20 min ，浸泡撈出后堆積在陰涼處，使用經過500倍甲基硫菌靈溶液浸泡的刀具切薯，每塊種薯大概25 g，保留2個芽眼，以30 kg為一堆，覆蓋沙子與草席保溫，8 d后檢查薯堆，選取芽長2 cm的薯塊種植在河南農業大學科教園區的日光溫室內，每種試驗品種種植100個塊莖種薯，隨機區組排列，每個小區種植面積為31.86 m2，每小區5壟，壟寬0.75 m，壟長8.5 m，每壟20株，株距40 cm，3次重復。試驗材料分別于2019年8月15日、2020年1月23日、2020年8月25日種植。試驗按照田間常規管理，及時培土除草，各小區間水肥管理一致。

1.3 方法

1.3.1 病原菌培養以及病菌懸浮液制備 將純化后的病菌單菌落在TSA培養基上全皿劃線28 ℃暗培養36 h。用9 mL MES溶液洗滌培養36 h的平板上的菌體，混合均勻后用分光光度計測定菌懸液的OD600值判斷菌懸浮液的濃度，用MES溶液對上述菌懸液進行稀釋直至試驗所需濃度。

1.3.2 馬鈴薯離體葉柄的接種 選取有10片完全展開葉的馬鈴薯植株（約幼苗出土后35 d）的第4片到第6片葉的葉柄，將相同馬鈴薯品種的葉柄統一切割成6.5 cm高度，并將處理好的葉柄插入長度5.8 cm、厚度0.5 cm的正方形干燥花泥中，每個花泥上插有5～8段同一試驗品種的葉柄;在60 mm×60 mm×90 mm的方形組培瓶里分別倒入40 mL試驗所需濃度的MES稀釋菌懸液，空白對照組的組培瓶中倒入40 mL的不含菌液的MES溶液，將插有葉柄的花泥放入方形組培瓶，蓋上組培蓋。將組培瓶放入25 ℃、16 h/8 h（光/暗）的光照培養箱進行培養觀察。試驗設置6瓶生物學重復。

1.3.3 馬鈴薯主莖注射接種 依照Mohan使用的主莖注射接種鑒定法，選取植株（生長約4周齡）第2片完全展開的真葉連接的莖部，用一次性無菌注射器針頭穿刺，用移液槍配合滅菌的槍頭吸取10 ?L濃度為108 CFU·mL-1（OD600=0.89）的MES稀釋菌液，接種于穿刺部位，每株馬鈴薯主莖在5個不同的位點接種，間距約為3 cm;接種后將接種部位覆蓋保鮮膜12 h保持濕度（覆蓋保鮮膜可以穩定發病率），空白對照組的植株穿刺后接種所用的為10 ?L的MES溶液[31]。

1.4 病情調查

1.4.1 離體葉柄接種病情調查 接種之后在固定時間，觀察葉柄軟化腐爛情況（圖1-A），用刻度尺測量發病高度（圖1-B）并拍照記錄。對接種36 h的發病高度按分級標準（圖1）進行分級并計算病情指數，最后依據計算的病情指數來確定抗性水平。病害等級根據（表2）的標準確定。

病情指數計算公式如下：

[? ? ? ? ?病情指數=∑（各級感病葉柄數×相應級數）調查葉柄數×最高級數]。

根據以下病情指數來確定馬鈴薯抗性水平： R（0.2≤病情指數<0.4）;MR（0.4<病情指數≤0.6）;MS（0.6<病情指數≤0.8）;S（病情指數>0.8）。

1.4.2 主莖注射接種病情調查 14 d后將馬鈴薯植株接病位置縱切，觀察植物組織壞死范圍，超過2 cm為感病材料（Susceptibility），低于1 cm為抗病材料（Resistance），組織壞死范圍介于1～2 cm之間為部分抗性材料（Partially resistance）[31]。

1.5 實時熒光定量PCR驗證

使用黑脛病病菌特異性引物（Y1：5-GAATATCAATAGCACTATCCTCAG-3，Y2：5-CACATTATCAACCAACAGAACC-3）與馬鈴薯內參引物StEFIα （F：5-ATTGGAAATGGATATGCTCCA -3，R： 5-TCCTTACCTGAACGCCTGTCA-3）對接種后同一時間（36 h）不同病情指數的馬鈴薯葉柄，按每個品種隨機選取3瓶葉柄，利用CTAB法提取DNA后進行實時熒光定量PCR（Quantitive Real-Time PCR，qPCR）檢測黑脛病菌含量[33-35]。Q-PCR數據分析采用2-ΔΔCt法，樣品數據來自3次重復試驗，設定3次技術重復。

1.6 數據分析

采用SPSS 24.0統計分析軟件，應用單因素ANOVA進行處理間差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯黑脛病菌濃度的確定

為了方便確定試驗所使用的菌懸液濃度，利用分光光度計測定菌懸液的OD600值，用9 mL MES溶液洗滌培養36 h的平板上的菌體，混合均勻后吸取100 ?L菌液均勻涂布在TSA平板上，28 ℃暗培養12 h后計算平板上的菌落數（圖2），并用分光光度計測定此時菌懸液的OD600值，則可以得到此時菌液濃度所對應的OD600值;繼續用MES溶液對上述菌液進行10倍的梯度稀釋，并測出相應的OD600，以此類推（表3）。

2.2 接種濃度對接種效果的影響

為了得到最適宜的接種病菌濃度，將病菌用MES溶液進行了梯度稀釋，終濃度分別為10、102、103、104和105 CFU·mL-1。選用馬鈴薯品種Désirée進行離體葉柄接種，每隔2 h測量葉柄的發病高度并記錄。從圖3可以看出，發病速率與接種濃度成正比，接種濃度越高，發病速率越快。當接種濃度為105 CFU·mL-1時，在40 hpi（hour post inoculation）葉柄發病高度已高于4 cm，屬于發病最高級4級，在整個發病進程中，接種濃度105 CFU·mL-1發病速率太快，不適合作為篩選不同品種抗性的濃度;當接種濃度選擇10 CFU·mL-1時，在72 hpi時，葉柄的發病高度未達到1 cm，發病進程緩慢，離體葉柄長時間在液體中浸泡會造成植物免疫力下降，難以分辨葉柄是由于病原菌侵染還是長時間浸泡所導致的腐爛變軟。當接種濃度選擇102、104 CFU·mL-1時，在整個接種進程中葉柄發病高度數據誤差較大（圖3）。當接種濃度為103 CFU·mL-1時，葉柄發病高度的數據誤差較小，葉柄發病高度緩慢上升，在70 hpi達到了4級的發病高度，可作為篩選不同品種抗性的適宜濃度。

2.3 處理時間對接種效果的影響

為了確定病害評價鑒定合適的時間點，用MES溶液將病菌稀釋為103 CFU·mL-1，分別對馬鈴薯品種Désirée、Nicola、法阿利塔、荷15、威芋7號進行離體葉柄接種，并選擇12、24、36、48 hpi 4個時間點進行觀察，測量葉柄發病高度并記錄。從圖4可以看出，在12 hpi和24 hpi，Désirée、Nicola、法阿利塔、荷15、威芋7號均沒有出現腐爛變軟的癥狀，在36 hpi時不同品種之間葉柄發病高度呈現出顯著性差異，不同品種的葉柄發病高度在病害等級分級中的級別分布也不相同，病害等級覆蓋了1～4級。從圖4可以看出，48 hpi時Désirée、Nicola、荷15、威芋7號這4個品種之間沒有顯著差異，并且此時5個品種的發病高度均達到了病害等級分級中的最高級別4級。結果表明，選擇在36 hpi時進行葉柄發病高度的相關觀察統計，可以作為確定不同品種抗性標準的時間點。

2.4 不同馬鈴薯品種的接種效果

為了驗證在本試驗中所用接種方法的可靠性，選取14個不同品種的馬鈴薯（Désirée、豫馬鈴薯1號、中薯2號、中薯3號、中薯8號、克新3號、克新4號、威芋7號、大西洋、夏波蒂、 Nicola、法阿利塔、荷15、Bintje）進行離體葉柄接種鑒定。接種濃度選取103 CFU·mL-1，測量36 hpi葉柄發病高度，按照分級標準（圖1）進行分級并計算病情指數，最后根據病情指數來確定品種的抗性。14個馬鈴薯材品種的黑脛病抗性評價結果如表4所示，高感品種有中薯8號、大西洋、法阿利塔、Bintje;中感品種有中薯2號、夏波蒂、Désirée;中抗品種有豫馬鈴薯1號、中薯3號、克新3號、威芋7號、Nicola;高抗品種有克新4號、荷15。14份馬鈴薯品種表現出了不同的抗性，表明在本試驗中采用的接種方法可以鑒別出不同品種的抗性。

2.5 不同馬鈴薯抗性品種黑脛病菌qPCR檢測

為了驗證利用該接種方法接種鑒定的14份馬鈴薯品種表現出的抗性與植株中的病菌含量是否相關，分別以14份馬鈴薯品種接種36 hpi提取的DNA為模板，以Y1/Y2為引物進行實時熒光定量PCR檢測黑脛病菌含量，數據處理以Désirée作為對照。從圖5可以看出，中薯8號、大西洋、法阿利塔、Bintje的病菌相對含量最高;Désirée、中薯2號、夏波蒂的病菌含量次之;豫馬鈴薯1號、中薯3號、克新3號、威芋7號、Nicola的病菌含量居第三;克新4號、荷15的病菌含量最低。這與鑒定得到的抗性結果一致，說明了該接種方法具有一定的可靠性。

2.6 離體葉柄接種法與田間主莖注射接種法的比較

對14個馬鈴薯品種采用田間主莖注射鑒定法進行了接種鑒定，并將鑒定結果與離體葉柄接種鑒定法進行了對比。從表5可以看出，14個馬鈴薯品種中，利用離體葉柄接種法鑒定出的S和R材料在主莖注射鑒定法中分別符合感病和抗病的發病癥狀，證明了離體葉柄接種法的準確性。與此同時，利用離體葉柄接種法鑒定出的MR、MS材料在主莖注射鑒定法中都歸類到了部分抗性之中。

3 討論與結論

種質資源的抗病性篩選是抗病育種工作的重要部分，因此選取一種穩定準確有效的接種馬鈴薯黑脛病的方法十分重要。研究認為黑脛病菌是通過傳播媒介對有傷口的莖和塊莖進行侵染，因而國內外有關黑脛病的接種大多是通過馬鈴薯塊莖和主莖注射病菌進行研究[29-32]。但考慮到馬鈴薯黑脛病可以通過侵染維管束組織感染馬鈴薯植株的多個部位[12，36-37]，筆者采用了馬鈴薯離體葉柄接種黑脛病的方法，結果表明，接種濃度選擇103 CFU·mL-1，并且在36 hpi時進行觀察測量發病高度，可以獲得穩定的發病效果，并可區別不同馬鈴薯品種間的抗性差異。

病菌可以通過細胞間的交流機制來感知它們的種群密度，在這種機制中，只有當病菌密度達到閾值時，特定的基因才會表達[38]。細胞之間的通信是通過小的、可擴散的信號分子進行的，而在革蘭氏陰性菌中，它主要是由AHLs（酰基高絲氨酸內酯）介導的[39]。AHLs可以調節果膠桿菌的致病基因表達，保證了只有當病菌密度大到足以攻破植物的防御反應時，侵染才會開始[40-41]。在研究不同接種濃度對接種效果影響的試驗中，發現病菌侵染葉柄需要一定時間的潛伏期，接種濃度越低潛伏期越長，當接種濃度為10 CFU·mL-1時，潛伏期達到了58 h;當接種濃度高達105 CFU·mL-1，潛伏期縮短到只有24 h，這種情況也表明了病菌濃度越高發病速度越快[42]。筆者選用了5種不同的病菌濃度進行接種測試，避免了因濃度過高或過低導致不準確的接種結果，結果表明，只有選擇合適的濃度進行接種鑒定，才能獲得穩定可靠的接種結果。

馬鈴薯對黑脛病菌的抗性除了與自身抗性機制有關以外，還與接種的時間長短有關。接種時間過短，品種的抗性差異不能體現出來;接種時間過長，抗病品種也會表現出感病癥狀。這主要是QS所致。QS作為種群密度依賴的調控機制，可以利用自由擴散的化學信號分子控制病菌對植物的感染[24]。病菌主要通過協調生產各種植物細胞壁降解酶來致病，研究表明QS調控細胞壁降解酶[43]。病菌剛進入植物內不能產生足量的細胞壁降解酶使組織降解變軟，病菌只有在足夠的時間內產生大量細胞壁降解酶，才能降解植物組織。在本試驗中筆者也發現在24 hpi時，5個試驗品種都未發病，不同品種的抗性差異未能體現出來，可能就是由于時間短病菌還未產生足量的細胞壁降解酶使組織降解死亡;而在48 hpi時，5個品種都達到了最大發病等級，說明病菌產生的大量細胞壁降解酶也使抗病品種受到威脅，很顯然這2種處理時間都不能作為篩選品種抗性的接種時間;本研究的結果表明，36 hpi時可以觀察到不同品種有不同的發病等級，猜測是由于合適的時間積累，病菌產生的細胞壁降解酶可使感病品種死亡但又不致于威脅到抗病品種的生命。

離體葉柄接種法與田間主莖注射接種法的比較結果表明，2種方法的發病情況基本一致，但由于田間主莖注射接種法的材料存在鑒定周期長的問題，在抗病鑒定過程中也會出現肉眼難以觀察的腐爛癥狀或者發病不穩定的情況，從而導致無法定性定級，最終造成分析結果不準確。

由于馬鈴薯黑脛病是馬鈴薯栽培過程中的普遍性病害，西方國家很早就開展了馬鈴薯黑脛病抗性研究，而我國對該病的研究起步較晚、進程較慢，因此應該注重抗性品種的鑒定篩選。

綜上，筆者在本試驗中探索的馬鈴薯離體葉柄接種法即接種濃度選擇103 CFU·mL-1，并且在36 hpi時進行觀察測量發病高度，可以用來鑒定評估馬鈴薯對黑脛病的抗性。用離體馬鈴薯葉柄接種法評估了14個馬鈴薯品種對黑脛病的抗性，鑒定周期短且不浪費馬鈴薯塊莖，對馬鈴薯抗黑脛病生產具有實際的指導意義。

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