小麥TraesCS7A02G543300 基因的克隆及生物信息學分析

楊 茜，黃文芳，王雪琳，任豫超，史敏莉，賀立恒

（山西農業大學農學院，山西太谷030801）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界三大糧食作物之一，其種植面積在谷物類作物中位居首位，是全球2.5 億余人的主糧[1]。小麥還為人類提供了約21%的膳食熱量和20%的蛋白營養，在保障糧食安全方面發揮著突出作用[1-3]。

氣孔作為植物水分排出和二氧化碳進入的主要通道，其狀態強烈影響著蒸騰作用和光合作用的生理過程[4]。在擬南芥中，表皮成熟的氣孔是由表皮原細胞（Protodermal cell，PC）經一系列的分裂和分化活動發育而來的，3 種緊密相關的basic helixloop-helix（bHLH）家族蛋白 SPCH、MUTE 和 FAMA介導了這一過程[5]。其中，SPCH 是氣孔發育起始的關鍵因子，控制著PC 向擬分生組織母細胞（Meristemoid mother cell，MMC）的分化和 MMC 向擬分生細胞（Meristemoid cell，MC）的分裂[6]；MUTE 控制著 MC向保衛母細胞（Guard mother cells，GMCs）的分裂[7]；FAMA 控制著 GMC 向成熟保衛細胞（GC）的轉變[8]。研究發現，ICE1/SCREAM（SCRM）和 SCRM2 直接與SPCH、FAMA 和MUTE 相互結合形成二聚體，并影響其功能發揮[5]。此外，為了協調發育中的氣孔和表皮細胞之間的信號，防止氣孔彼此相鄰形成，許多胞外質膜結合蛋白也是必不可少的[9]，包括表皮模式因子EPF 以及EPF-like 信號肽、Leu-rich repeat ERECTA 家族受體激酶以及TOO MANY MOUTHS（TMM）[10-11]。

單子葉植物和雙子葉植物的氣孔形態有著較大的差異，其中，單子葉植物的氣孔成排排列，呈啞鈴型；雙子葉植物的氣孔在葉片上不規則排列，呈腎型[12]，盡管二者在氣孔形態上存在較大的差異，但陸生植物氣孔形成的基本機制是相對保守的[13]。在水稻中，OsSPCH、OsMUTE、OsFAMA和OsICE1是成熟氣孔形成所必需的，其基本功能與擬南芥同源基因類似[14-15]。在現存最古老的氣孔譜系植物苔蘚中，成熟氣孔的形成同樣需要擬南芥中SPCH、MUTE、FAMA和ICE/SCRM的同源基因PpSMF1和PpSCRM1的介導[16-17]。在小麥近緣種二穗短柄草（Brachypodium distachyon）中，氣孔發育的起始同樣是由BdISCRM、BdSPCH1和BdSPCH2組成的氣孔發育模塊調控的[18]。

ICE1/SCRM 與 SPCH、MUTE 和 FAMA 的伙伴關系對于單子葉植物氣孔的啟動和成熟是必不可少的，但它們在單子葉植物中的蛋白功能可能與擬南芥中略有不同[14，19]。例如，在禾本科植物二穗短柄草中，存在著ICE1 和SCRM2 功能的特異化，而在擬南芥中這些蛋白似乎是冗余的[12，14]。類似地，在二穗短柄草中也發生了新的SPCH 重復和新功能化[20]，MUTE 對于二穗短柄草氣孔的副衛細胞的形成具有決定性作用[18]。

中國農業科學院小麥基因資源課題組利用基因定位獲得了1 個與小麥氣孔密度相關的候選基因TraesCS7A02G543300。本研究利用生物信息學軟件對小麥TraesCS7A02G543300基因的基本理化性質、蛋白質結構等進行分析，同時利用RT-qPCR分析小麥根、葉、莖在3 個時期的基因表達模式，旨在為進一步研究小麥TraesCS7A02G543300基因的功能和調控機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為普通小麥品種矮抗58。

1.2 試驗方法

本試驗于中國農業科學院國家小麥改良中心完成，采用盆栽法進行小麥植株的培養，分別于兩葉一心期、拔節期和抽穗期收集健壯小麥根、莖、葉，并進行液氮速凍。

1.2.1TraesCS7A02G543300基因的克隆 使用北京莊盟公司的Plant Total RNA Kit（ZP405）提取小麥總RNA，使用EX RT kit（gDNAremover）（ZR108）試劑盒逆轉錄為cDNA。根據Ensembl Plants 登錄的TraesCS7A02G543300基因序列，設計基因組特異引物（表1）。根據WANG 等[21]所述的方法進行PCR反應。PCR 產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收純化并進行測序。

表1 用于基因克隆及表達分析的引物

1.2.2 TraesCS7A02G543300 蛋白的生物信息學分析 利用NCBI-ORF finder 工具獲取基因的開放閱讀框[22]；用Expasy-ProtParam 進行蛋白質等電點、親疏水性等基本的理化性質分析[23]；用NLS Mapper 預測核定位信號[24]；用Plant-mPLoc 預測蛋白質亞細胞定位[25]；用 SignalP 4.0 預測蛋白的信號肽[26]；用NetPhos 3.1 分析蛋白質序列潛在磷酸化位點[27]；用NPS-SOPMA 和SWISS-MODEL 分別對蛋白質的二級結構和三級結構進行預測[28-29]；利用DNAMAN 軟件進行序列比對。

1.2.3TraesCS7A02G543300基因的表達分析 以1.2.1 獲得的 cDNA 為模板，參考 WANG 等[30]所述的方法進行實時熒光定量 PCR（RT-qPCR）（TaTubulin為內參基因，引物序列如表1 所示）。相對表達量的計算參考文獻[30]進行。采用SPSS 25.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 TraesCS7A02G543300 基因的克隆

以1.2.1 得到的cDNA 為模板進行TraesCS7A02 G543300基因的擴增，電泳結果表明，在1 100 bp 左右有1 條明顯的特異性條帶（圖1）；測序結果表明，TraesCS7A02G543300基因的cDNA全長為1084bp；ORF 分析結果表明，該序列包含一個990 bp 的開放閱讀框，編碼329 個氨基酸。

2.2 TraesCS7A02G543300 蛋白的生物信息學分析

TraesCS7A02G543300 蛋白理化性質分析表明，該蛋白分子式為C1540H2447N435O476S25，分子質量為35.473 5 ku，理論等電點為5.1，親水系數為-0.182，脂溶系數為73.98，不穩定系數是57.3（＞40），預測該蛋白為穩定的酸性、親水性蛋白。在氨基酸序列第47—57 位含有核定位信號序列PASRKKRVEGM，表明該蛋白定位于細胞核。SignalP 4.0 分析無信號肽，表明該蛋白不是分泌型蛋白。NetPhos 3.1 分析結果表明，該蛋白中有18 個氨基酸可能被磷酸化，其中，包含11 個絲氨酸、5 個蘇氨酸和2 個酪氨酸。

通過NCBI 數據庫對該蛋白進行了功能結構分析，結果表明，該蛋白包含1 個保守的堿性/螺旋-環- 螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）結構域。利用 BLAST 程序在 The Arabidopsis Information Re-source 數據庫中進行比較分析，結果表明，與其相似度最高的3 個擬南芥蛋白分別為AtbHLH093（相似性 51.76%）、AtICE1/AtSCRM（相似性 31.61%）和AtSCRM2（相似性33.6%），這3 個蛋白同屬于bHLH-LZs 亞家族，在擬南芥中參與了氣孔的發育過程。氨基酸序列比對結果表明，TraesCS7A02G543300蛋白與擬南芥SPCH、FAMA、MUTE 的相似度較低，其氨基酸一致性分別為20.00%、11.81%和21.15%（圖 2）。

TraesCS7A02G543300 蛋白的二級結構預測結果如圖3 所示，其主要由α- 螺旋和無規則卷曲組成，分別占比47.72%和40.73%；此外，N 端以α-螺旋的形式存在，C 端以延伸鏈的形式存在。以AtbHLH093 為模型蛋白對TraesCS7A02G543300 進行了三維結構的建模，預測結果如圖4 所示，TraesCS7A02G543300 蛋白具有典型的螺旋- 環-螺旋（HLH）結構。

2.3 TraesCS7A02G543300 基因的表達分析

RT-qPCR 結果表明（圖5），TraesCS7A02G543300基因在小麥葉中表達量極顯著高于根和莖；且在兩葉一心期的表達量極顯著高于拔節期和抽穗期，預測TraesCS7A02G543300基因在小麥的生長發育前期發揮主要作用。

3 結論與討論

為進一步了解TraesCS7A02G543300基因在小麥中的功能，本研究對TraesCS7A02G543300基因進行了生物信息學分析，并研究了TraesCS7A02G543300基因在矮抗58 不同組織及不同發育時期的表達特性。結果表明，TraesCS7A02G543300基因包含的完整開放閱讀框長度為990 bp，編碼了329 個氨基酸。TraesCS7A02G543300 蛋白的亞細胞定位被預測位于細胞核，這與其作為轉錄因子的功能是一致的。TraesCS7A02G543300 蛋白包含1 個保守的b HLH 結構域，屬于 bHLH-LZs 亞家族，與擬南芥中的AtICE1/SCRM 高度同源，因此，TraesCS7A02G 543300 的功能可能與擬南芥AtICE1/SCRM 類似[5]。TraesCS7A02G543300基因在小麥葉中的表達量顯著高于其他組織，在兩葉一心期的表達量明顯高于其他時期，這與ICE1/SCRM等氣孔發育調控因子在擬南芥等植物中的表達特性一致[5，13]。這些結果為TraesCS7A02G543300基因在小麥葉片中參與氣孔的發育過程奠定了理論基礎。

前人研究表明，ICE1/SCRM 能與SPCH、FAMA和MUTE 相互作用并影響氣孔的形成[6]。本研究對TraesCS7A02G543300 蛋白的基本理化性質進行了預測分析，但關于其蛋白功能的研究相對粗淺。接下來可以利用酵母雜交等驗證TraesCS7A02G543300是否能與SPCH、FAMA 和MUTE 形成二聚體，從而研究TraesCS7A02G543300基因在小麥中的功能。除了參與氣孔發育過程外，ICE1/SCRM 和SCRM2還能參與植物的逆境響應過程，過表達SCRM 能夠增強水稻的耐逆性[31]。因此，下一步可分析TraesCS7A02G543300基因在逆境脅迫下的表達量，從而驗證TraesCS7A02G543300基因是否參與了小麥的逆境響應過程。但由于單子葉植物氣孔結構及氣孔調控機制的差異，TraesCS7A02G543300基因的功能在小麥中是否有功能特化等還需進一步驗證。