核桃青皮主要功能成分變化規律

左力翔，牛 艷，安曉寧，高 磊，秦國杰

（山西農業大學園藝學院，山西太原030031）

核桃青皮占果實質量的1/2 以上，含有大量生物活性物質。近年來，越來越多的研究集中于開發這些活性物質的生物化學功能，為提升核桃青皮資源價值提供更多潛能。有研究指出，核桃青皮提取物對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲具有明顯抑制作用[1]；NH2SO3H 溶液中加入核桃青皮提取物對冷軋鋼具有緩蝕作用[2]；產蛋后期添加核桃青皮提取物可維持蛋雞的產蛋性能[3]；5%的核桃青皮乙醇提取物不僅對無花果果實具有保鮮效果，且無花果果實的品質和風味均能得到較好的保持[4]。除此之外，核桃青皮還應用于生物有機肥、殺蟲滅菌劑、染色劑及天然食用色素等很多方面[5-9]。這些研究結果為核桃青皮高值利用提供了大量實踐經驗和理論依據。

新形勢下，核桃產業已發展成為宜栽區農民脫貧增收的主要致富產業[10-11]。發展核桃青皮高值利用產業對改善農業生態環境、提高核桃產業經濟效益具有重要意義。核桃青皮中的醌類、酚類以及多糖是核桃青皮最主要的3 種活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、殺蟲、化感作用等[12-14]。目前對于核桃青皮主要活性物質的研究大多集中在提取、功能和應用方面[15-19]，對于何時收獲可以最有效地獲取此類物質的研究較少。楊漓等[20]研究了不同核桃品種核桃青皮中胡桃醌含量的變化規律，結果發現，核桃青皮中胡桃醌含量在7 月下旬到8 月初達到峰值，然后隨著果實成熟逐漸下降。王紅霞等[21]通過對6 種核桃青皮多糖含量變化規律的研究發現，果殼硬化期核桃青皮多糖含量最高，果實速長期次之，成熟期最低。SHI 等[22]對核桃青皮中酚類物質的季節變化規律研究發現，8 月下旬酚類物質含量開始下降。以上研究分別討論了不同地區單種功能成分的季節變化規律。但目前依然沒有同時分析核桃生育期青皮中醌類、酚類和多糖的變化規律的研究，且山西省本地核桃品種青皮中功能成分的季節變化規律尚未開展相關研究。

為提高核桃青皮功能成分的利用效率，本研究以山西省汾陽核桃主產區主栽品種晉龍1 號為材料，研究了不同生長時期核桃青皮中的醌類、酚類及多糖含量的變化規律，旨在為核桃青皮功能成分的高值利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

2019 年 6 月 15 日至 9 月 15 日，每隔 15 d 分別采集山西省汾陽市威雄經濟林合作社優種核桃苗木繁育基地的晉龍1 號（樹齡20 a）核桃，將核桃青皮50 ℃條件下烘干，粉碎、封裝后保存于冰箱（4 ℃）備用。

1.2 試劑及儀器

無水乙醇，丙酮，乙醚，福林- 酚，碳酸鈉，沒食子酸，苯酚，濃硫酸，葡萄糖，冰乙酸，氫氧化鈉，氨水，胡桃醌標準品，所有試劑藥品均為分析純，并不做其他任何二次處理。去離子水通過電阻率為18.2 Ω/cm 的ELGA PURELAB 超純水設備制得。

恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司），超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司，KQ5200DE），紫外可見分光光度計（安捷倫，Cary8454），超高效液相色譜儀（島津，LC-30）。

1.3 高效液相色譜鑒定核桃青皮內物質種類

稱取0.500 0 g核桃青皮樣品，加入5 mL 甲醇∶水＝1∶1（體積比），浸泡 4 h，隨后 40 ℃超聲處理40 min；然后于 4 ℃下 12 000 r/min 離心 10 min，取5 μL 上清液進行高效液相色譜檢測。

色譜條件：色譜柱為Waters HILIC BEH Column（100 mm×3 mm，1.7 μm），流速為 0.300 mL/min，柱溫為35 ℃。流動相A 為乙腈（acetonitrile），流動相B 為0.1%乙酸（CH3COOH-H2O）。具體流動相比例及其時間為：流動相A 5%、流動相B 95%，0 min；流動相A 50%、流動相B 50%，10 min；流動相A 95%、流動相B 5%，13 min；流動相A 5%、流動相B 95%，14 min；流動相A 5%、流動相B 95%，16 min。

1.4 總醌含量的測定

根據報道方法并做相應調整測量總醌含量[23]。將核桃青皮樣本過0.425 mm 篩之后，稱取約0.025 0 g，加入6 mL 混合酸（25%鹽酸∶冰乙酸＝2∶18（體積比）），沸水浴回流15 min，冷卻至室溫，加入8 mL 乙醚洗滌殘渣，取出上清液，重復洗滌3 次，每次6 mL，將3 次得到的上清液樣品合并于分液漏斗中。在分液漏斗中先加入20 mL 的混合堿（10%氫氧化鈉∶4%氨水＝1∶1（體積比））進行萃取，取出下層溶液，重復萃取3 次至乙醚層無色，合并3 次萃取得到的下層溶液，放置30 min，同時以混合堿為空白于525 nm 處檢測吸光度。重復3 次。

1.5 總酚含量的測定

研究采用福林- 酚法測定樣品中總酚含量[24-25]。將核桃青皮樣品過0.425 mm 篩之后，稱取約0.025 0 g，加入1 mL 60%乙醇提取液，先在60 ℃水浴處理10 min，然后超聲處理30 min，最后于12 000 r/min 離心10 min，待測。重復3 次。

1.6 多糖含量的測定

采用苯酚- 硫酸法檢測多糖[26]。將樣本過0.425 mm篩，稱取約0.025 0 g，加入6 mL 二次水并用封口膜封蓋，之后沸水浴5 min，然后離心10 min（4 000 r/min，25 ℃）。離心結束后取 200 μL 上清液加入95%乙醇，靜置過夜。最后，將靜置后的溶液離心10 min（12 000 r/min）并去除上清液，沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌2 次，再加入6 mL 去離子水振蕩至溶解，隨后稀釋10 倍，待測。重復3 次。

1.7 標準曲線的繪制

總醌標準曲線以胡桃醌為標準品，分別配制180、120、60、12、6、0 μg/mL 的標準溶液，在 525 nm處測量其吸光度值。總酚標準曲線以沒食子酸為標準品，分別配制 124、62、31、15、7.5 μg/mL 的標準溶液，在760 nm 處測量其吸光度值。多糖標準曲線以葡萄糖為標準品，分別配制 100、80、60、40、20、0 μg/mL 的標準溶液，在490 nm 處測量其吸光度值。

1.8 數據分析

數據采用Excel 和Origin Pro 8.5 進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制結果

從圖1 可以看出，總醌標準曲線方程為：y＝0.007 8x－0.013 2（R2＝0.999 8）。總酚標準曲線方程為：y＝0.004 4x－0.008 3（R2＝0.999 8）。多糖標準曲線方程為：y＝0.003 2x－0.006 5（R2＝0.996 5）。結果表明，在各自相應的檢測范圍內各標準品濃度與吸光度值具有良好的線性關系，可用于檢測核桃青皮內總醌、總酚以及多糖的含量。

2.2 核桃青皮生物活性物質種類鑒定分析

為確定核桃青皮含有的生物活性物質的種類，采用高效液相色譜對核桃青皮進行鑒定分析。從圖2 可以看出，通過鑒定發現，該核桃青皮樣品內共有107 種各類活性物質。其中，酚類主要包括黃岑素、兒茶素、飛燕草素、花旗松素、楊梅素、柚皮素、刺槐黃素、黃豆苷等在內的黃酮類，包括沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、丁香酸、咖啡酸、鞣花酸、斛皮素、胡桃醌等在內的單體酚酸，以及水解單寧。醌類物質主要包括胡桃醌、羥基茜草素、1，4- 萘二酮、2，5- 二甲氧基苯醌、核桃酮等。糖和糖苷包括D 蘇糖、番石榴苷、葡萄糖苷、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖等。除此之外，還包括氨基酸（纈氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、蛋氨酸、胱氨酸等）、有機酸（烏頭酸、尿酸、富馬酸、琥珀酸、蘇糖酸、龍膽酸、壬二酸、檸檬酸、酒石酸、粘酸、亞油酸、亞麻酸、反式牛磺酸等）、生物堿（葫蘆巴堿、禾草堿、膽堿、D- 肉堿、磷酸膽堿、毛果蕓香堿、胡椒堿等）、維生素（生物素、維生素B5等）、其他結構的生物活性物質（黃豆苷、科羅索酸、異櫻草苷7-O- 新橙皮苷、苯并噻唑等）和一些鹽如葡萄糖酸鹽等。其中，酚類物質達19 種之多，醌類物質雖然種類比較少，但是單種成分含量較高。鄭曉寧等[27]研究表明，胡桃醌在核桃青皮中的含量最高。此外，樣品中的多糖含量也較為豐富，共檢測到6 種主要單糖成分，與謝東雪等[19]對多糖分離純化的研究結果類似。如此豐富的活性物質使核桃青皮具有抗菌、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗真菌、殺幼蟲、防腐等一系列功能。如表1 中列舉的具有抗菌、抗氧化、抗突變作用的香豆酸；具有抗腫瘤、抗真菌、殺幼蟲作用的香豆素；對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌及綠膿桿菌均有不同程度抑制作用的對香豆酸；具有消炎、抗滲出、增加靜脈張力、改善血液循環以及糾正腦功能失常等作用的七葉皂苷；具有抗菌消炎、清除自由基的柚皮素；具有抗真菌和抗腫瘤的鷹嘴豆素A；具有抗菌、抗病毒的綠原酸；用于抗病毒、殺菌劑、抗氧化劑、殺蟲增效劑的芝麻素以及可用作食品防腐劑的壬二酸等。這些功能成分表明，核桃青皮作為一種農業資源具有巨大發展潛力。因此，本研究基于此結果檢測此3 類物質的總量，并研究果實發育過程中此3 類物質在核桃青皮內含量的變化規律。

表1 核桃青皮中部分生物活性物質

2.3 核桃青皮內總醌、 總酚及其多糖含量的生長期變化規律

不同產地、品種核桃所經歷的果實生長發育時間不同，大體經歷緩慢生長期、快速膨大期、硬核期和種仁成熟期[28]。本試驗研究了從快速膨大中期（6 月15 日）到種仁成熟期（9 月15 日）核桃青皮中總醌、總酚及其多糖的變化規律。由圖3 可知，6 月15 日總醌含量相對較低，約53.36 mg/100 g，且增長速率較慢，到7 月1 日僅增長至55.36 mg/100 g，進入7 月以后總醌含量不斷增加并在7 月30 日達到最高，為77.36 mg/100 g，之后逐漸降低并且降低的速率逐漸增加，到9 月15 日達到最低，為36.76 mg/100 g。

由圖4 可知，核桃青皮內總酚含量的變化規律同總醌類似，開始階段均保持較低的含量和增長率，從6 月15 日到 7 月 1 日僅增加2 mg/100 g。進入7 月后含量迅速積累，并在7 月上旬增速最大，8 月15 日達到最大，為50.64 mg/100 g，比總醌稍有滯后，然后含量迅速降低，最終在種仁成熟階段達到最低，為18.97 mg/100 g。

由圖5 可知，多糖含量的變化規律也呈現先增后減的變化趨勢，但是整體趨勢提前，在7 月15 日達到最高，為212.23 mg/100 g，后開始逐漸降低，同樣在種仁成熟期達到最低，為86.82 mg/100 g。

3 結論與討論

對比3 種物質含量的變化趨勢可以發現，從6 月15 日開始3 種物質增長速率都相對緩慢，這可能是由于核桃快速膨大期的光合同化產物及其礦質元素主要用于核桃的生長[29]，同時該階段果實增長速率很快，抵消了部分醌類、多酚及多糖的積累速率，使其表現出來的單位質量內的增量不大[22]。當核桃生長至硬殼期，核桃個體生長緩慢，同時醌類、多酚、多糖等物質合成速度加快，因此，表現出各種成分的含量急劇上升。此外，有研究表明，該時期各種功能性成分的增多有利于核桃緩解此時高溫、高輻射等不利條件帶來的環境壓力[30]。當核桃生長至種仁成熟期，此時的生長中心轉移至核桃仁，大量的能量用于合成核桃仁內的蛋白質和脂肪，因此，核桃青皮內的各種功能成分含量開始下降。此外，當核桃成熟之后核桃青皮表面會產生裂痕，加速醌類和酚類物質的氧化，使其含量加速下降。對于多糖而言，不僅在果實膨大期需要大量的糖分，在果殼硬化期為了給果仁成熟期的發育做準備，也需要大量糖分的積累。因此，糖分等營養物質積累非常迅速，從而更早達到最高值；當核桃進入種仁成熟期，核桃青皮中包括鉀在內的各種元素增多，促進糖分的加速轉化，因此，多糖含量最低。

根據本研究結果，可以將快速膨大中期（6 月15 日）到種仁成熟期（9 月15 日）的核桃青皮內功能成分的積累大致分為4 個階段。第1 個階段為緩慢增長期，第2 個階段為快速增長期，第3 個階段為穩定期積累期，第4 個階段為快速消耗期。醌類、多酚和多糖3 類物質在具體變化節點上存在差異，但都經歷上述4 個階段。如：本研究中總醌含量在7 月30 日達到最大，這與楊漓等[20]的研究結果類似，該研究認為核桃青皮中胡桃醌的含量在7 月下旬到8 月初達到峰值，然后隨著果實成熟呈下降趨勢。SHI 等[22]研究了不同發育階段（4 月 25 日至 9 月19 日）核桃青皮酚類物質含量及抗氧化活性的變化規律，結果表明，總酚含量在快速膨大期出現了下降，硬殼期呈上升趨勢直到8 月初達到最高，之后呈下降趨勢，完全成熟后達到最低值。本研究中總酚含量在8 月15 達到最高，之后快速下降并在成熟期達到最低，與其研究結果類似。同樣，本研究中多糖含量在果殼硬化期達到峰值，與王紅霞等[21]的研究結果一致，其含量的變化規律和進程具有相似性。

本研究討論了核桃青皮功能成分變化規律同核桃仁生長發育規律之間的關系。由于核桃的生長發育是以核桃仁為核心，核桃青皮中各種營養及其功能成分的變化規律應與核桃仁的發育進程具有相關性。因此，今后應進一步研究核桃青皮中功能成分的轉移及轉化規律，為揭示核桃青皮與核桃仁中各種營養成分在生長發育過程中的關系等方面具有重要啟示。