來源于Dictyoglomus sp.NZ13-RE01的纖維二糖差向異構酶酶學性質和乳果糖制備研究

諸亞鋒,徐錚

(南京工業大學 食品與輕工學院,江蘇 南京,211816)

乳果糖(lactulose)是由D-半乳糖基和D-果糖基通過β-1,4糖苷鍵連接成的二糖,作為一種功能性低聚糖它無法被人體吸收,但可被腸道微生物利用,對便秘和肝性腦病患者具有較好的療效[1-3],對濫用抗生素導致的腸道菌群失調調節作用顯著[4],在動物飼料中添加乳果糖可以防止鐮刀菌毒素引發的疾病[5],還可添加到奶酪中作為益生元產品來生產功能性芝士[6]或改善酸奶的口感[7]。因此,乳果糖在醫藥、食品、飼料等領域都具有廣泛用途,經濟價值巨大。

當前乳果糖的工業化生產方法為化學催化法,即乳糖在堿性加熱環境下會部分自發異構為乳果糖[8],但該方法僅有不到25%的轉化率。加入硼酸或偏鋁酸鹽可與乳果糖形成絡合物使反應平衡向乳果糖生成方向移動,反應結束后調節pH至中性或酸性可解離出絡合物,可將轉化率提升到75%以上[9]。然而去除鋁或硼元素需要大量特種樹脂,工藝成本高昂導致產業化后利潤率低。因此化學法雖有周期短、工藝簡單等優點,卻存在污染大和提純成本高的缺點,限制了應用。酶法制備工藝無污染,下游分離方法成熟,有望取代化學法成為未來生產乳果糖的主要方式。目前可用的2類酶分別為β-半乳糖苷酶和纖維二糖差向異構酶(cellobiose 2-epimerase,CE酶),前者產量較低,例在200 g/L底物條件下產量僅為22.6 g/L[10],原因在于該酶具備水解乳果糖的副反應特性。GUERRERO等[11]研究了影響β-半乳糖苷酶轉糖苷和水解的因素,采用分批補料的方式提高了乳果糖產量,但乳果糖最終產率仍不超過45%。與之相比,CE酶僅需單一底物乳糖且轉化率高,來源多為嗜熱微生物,熱穩定性較好[12]。近年來針對CE酶的研究已成為熱點,例如沈秋云[13]通過對Caldicellulosiruptorsaccharolyticus來源的CE酶(CSCE)進行定向進化,使其對乳果糖的產率大幅提高;CHEN等[14]也通過半理性設計改造提高了該酶的異構活性和熱穩定性。由于嗜熱酶在高溫下熱穩定性好,因此純化僅需一步熱處理；本身又耐貯存、高溫催化過程不易染菌,因此嗜熱型CE酶制備乳果糖的技術更具備應用前景。

在已報道的CE酶中,CSCE純酶酶活力可達30 U/mg。然而,該酶同時還會產生15%的副產物依匹乳糖(epilactose),遠高于中國藥典所允許的副產物比例[15]；依匹乳糖的分離難度也很大,因此該工藝存在此瓶頸問題。本文對嗜熱型CE酶進行了挖掘,考慮到嗜熱微生物中含有這類酶的概率更大,在基因庫中檢索發現,超嗜熱微生物網團菌屬Dictyoglomussp.菌株NZ13-RE01編碼有CE酶基因,將該基因(簡稱NZ13-CE)在大腸桿菌BL21(DE3)中實現了活性表達。純酶性質研究表明,其催化溫度較高,所產依匹乳糖含量相對較低,這表明該酶可能是適合于乳果糖規?；a的候選酶。

1 實驗材料

1.1 實驗用試劑

DNA膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒,南京諾唯贊生物科技公司；PCR引物、目的基因DNA片段,安徽通用生物公司；DNA marker、蛋白質標準品marker,Takara(大連)公司；乳果糖標準品,北京百靈威科技有限公司,其他試劑均為國產分析純級別。

1.2 培養基

LB(種子)培養基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L NaCl,NaOH溶液調節pH值為7.0。

發酵培養基：20 g/L甘油、15 g/L酵母粉、12 g/L胰蛋白胨、2.1 g/L一水合檸檬酸、0.3 g/L檸檬酸鐵銨、2.5 g/L(NH4)2SO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、9.8 g/L K2HPO4·3H2O、15.1 g/L Na2HPO4·12H2O、3 g/L KH2PO4,NaOH溶液調節pH值為7.0。

補料培養基：500 g/L甘油、10 g/L MgSO4·7H2O。

1.3 菌株與載體

E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3),南京諾唯贊生物技術公司,表達質粒載體pET-28a由本實驗室保藏。

2 實驗方法

2.1 重組質粒pET-28a-nz13的構建及轉化E.coli BL21(DE3)

NCBI數據庫查詢得到NZ13-CE酶的編碼基因序列,根據大腸桿菌密碼子偏好性進行優化后,由安徽通用生物公司合成并連接到表達載體pET-28a；將適量重組質粒加入到E.coliBL21(DE3)感受態中,經熱激冰浴后涂布于含25 μg/mL卡納霉素的LB平板中,37 ℃靜置培養12 h,挑取轉化子進行PCR以及DNA測序驗證。

2.2 重組大腸桿菌的誘導表達及電泳鑒定

挑取出發菌株單菌落,接入含25 μg/mL卡那霉素、裝有50 mL液體LB培養基的250 mL搖瓶中,37 ℃和220 r/min培養條件下培養至OD600值達到0.6～0.8,降溫到25 ℃加入0.5 mmol/L的IPTG進行誘導表達24 h。離心收集菌體,超聲破碎后4 ℃、12 000 r/min離心所得上清液即為粗酶液,吸取適量粗酶液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析重組酶的表達情況。

2.3 重組酶的純化

使用緩沖液(50 mmol/L PBS緩沖、pH 7.4)對鎳親和柱進行預平衡,將粗酶液以2 mL/min的速度上樣平衡后的鎳親和柱,分別使用45和300 mmol/L的咪唑緩沖液進行蛋白洗雜和洗脫,將洗脫液于透析袋中4 ℃透析8 h、重復3次得到不含咪唑的純酶溶液,加入50%(體積分數)純甘油于-20 ℃冷凍保存。

2.4 纖維二糖差向異構酶酶活測定方法

酶活力單位(U)的定義：以乳糖為催化底物每分鐘生成1 μmoL乳果糖所需的纖維二糖差向異構酶的酶量。

酶活力測定方法：取1 mL發酵液離心獲得菌體,用生理鹽水洗滌2次,再用1 mL 50 g/L乳糖溶液重懸菌體,置于80 ℃水浴反應20 min,反應結束后加入鹽酸終止反應,進一步分析生成乳果糖的濃度。

檢測方法：采用GB 1886.176—2016《食品安全國家標準 食品添加劑 異構化乳糖液》中的HPLC高效液相色譜法以及顯色法來測定乳果糖的濃度。

顯色法：將樣品稀釋到適當濃度,取100 μL樣品加入280 μL 70%的濃硫酸,置于46 ℃水浴中5 min,加入20 μL顯色劑,持續水浴50 min,測定518 nm的吸光值[16]。

2.5 NZ13-RE01 CE酶的酶學性質分析

最適反應pH測定：測定pH為7～9條件下NZ13-CE酶的活性變化(50 mmol/L Tris-HCl緩沖液),最高活性設定為100%,計算在不同pH條件下的相對酶活力。最適反應溫度：測定反應溫度在40～90 ℃范圍內重組酶的酶活力,將測得最高酶活力設為100%,計算在其他溫度條件下的相對酶活力?；钚园胨テ冢褐亟M酶在最適反應溫度下保溫0～240 min,結束后迅速加入鹽酸終止反應,測定殘余酶活力(Ut),以熱處理前的酶活力為初始酶活力(U0),計算該酶在最適反應溫度下的活性半衰期[17]。反應動力學參數測定：測定在不同底物濃度[S]下,NZ13-CE酶的催化速率v,并根據底物濃度[S]和催化速率v的雙倒數作圖,求得Km,Vmax,kcat等動力學參數的數值。

2.6 通過大腸桿菌高密度發酵表達重組酶

以篩選出的相對高酶活克隆作為出發菌株E.coliBL21(DE3)pET-28a-NZ13-CE,在7.5 L發酵罐中嘗試高密度發酵和目的酶表達。前期設定培養溫度為37 ℃來快速生長菌體,參考裴緒澤和吳彬等[18-19]對高密度發酵大腸桿菌產酶的優化策略,將溶解氧控制在20%～30%水平,通氣量5 L/min,發酵液pH 7.0,前期控制比生長速率為0.2 h-1,誘導后比生長速率控制為0.1 h-1。OD600達到40～50時降溫至25 ℃,加入IPTG開始誘導,繼續發酵至OD600不再上升時停止補料并結束發酵。發酵過程中控制發酵液中的卡那霉素終質量濃度為25 μg/mL,IPTG終濃度為 0.5 mmol/L,總發酵時間不超過30 h。

3 實驗結果

3.1 NZ13-CE酶的一級序列分析

將NZ13-CE酶的一級序列與已發表的幾種產乳果糖CE酶進行比較,包括C.saccharolyticus(CSCE)、Dictyoglomusturgidum(DTCE)、Caldicellulosiruptorobsidiansis(COCE)等來源。結果表明該酶和DTCE、COCE、CSCE的一致性分別為54.2%、51.5%和51.0%。這表明在已報道能產乳果糖的CE酶中,NZ13-CE的序列一致性相對較低,是比較新的酶家族成員。在保守殘基方面,CE酶家族的催化殘基H245和H373也存在于NZ13-CE(圖1)。

圖1 NZ13-CE酶和已報道其他CE酶的一級序列比對

3.2 表達載體pET-28a-NZ13CE的轉化與驗證

將構建好的pET-28a-NZ13CE質粒表達載體轉化表達宿主E.coliBL21(DE3)并進行菌落PCR驗證,由圖2-a可知PCR產物條帶約為1.2 kbp,與NZ13-CE編碼基因的片段大小一致,表明該表達質粒成功構建。

圖2 轉化克隆的PCR和SDS-PAGE電泳驗證

將重組菌進行搖瓶發酵與誘導表達,結束后離心取菌泥重懸于PBS緩沖液,超聲破碎30 min進行SDS-PAGE凝膠電泳,由圖2-b可知在44 kDa附近有明顯的蛋白表達條帶,證明E.coliBL21(DE3)pET-28a-NZ13-CE表達宿主構建成功。

3.3 不同陽性克隆表達NZ13-CE基因的酶活力差別驗證

為研究不同陽性克隆表達酶活力的水平差異,用LB液體培養基對隨機挑取的10個陽性克隆進行搖瓶培養和酶表達。結果如圖3所示,表明不同克隆的酶活力差別較小,其中酶活力最高的#8號克隆為0.53 U/mL,最低的#7號克隆為0.46 U/mL,是前者的87%。該結果表明大腸桿菌BL21(DE3)菌株對NZ13-CE酶的表達穩定性較好,選擇#8號克隆進行后續實驗。

圖3 平板挑取不同重組克隆的表達酶活力比較

3.4 重組纖維二糖差向異構酶的純化

由于克隆所選擇的pET-28a載體插入位點為NdeI和XhoI,使得重組酶N-端帶有his-tag組氨酸標簽,進而可利用鎳親和柱對其進行高效的蛋白純化,在純化過程中收集各步驟所得樣品進行SDS-PAGE電泳。由圖4可知,泳道1為咪唑洗脫步驟收集的重組酶,從條帶可以看出此時酶濃度和純度均很高；泳道2為洗雜液洗出的較高濃度雜蛋白,表明雜蛋白得到了有效去除；泳道3為上樣后的穿透液；泳道4為上樣的細胞破碎離心上清液。洗脫所得目的蛋白在5 kDa分子質量的透析袋內透析3次去除咪唑,再添加甘油至終濃度50%(體積分數)于-20 ℃保存。

泳道M-蛋白質分子質量標準品；泳道1-洗脫液；泳道2-洗雜液；泳道3-穿透液；泳道4-破碎離心上清液

3.5 重組NZ13-CE酶的全酶分子質量測定

參考已發表文獻,使用凝膠排阻色譜法[20]測定NZ13-CE重組酶的分子質量,根據280 nm紫外吸收值監測蛋白質含量變化。由圖4可知,重組酶出峰體積為77.65 mL,根據測定不同標準蛋白樣品出峰時間得到的標準曲線方程為：Y=-0.041 3X+7.864 9,其中X代表出峰體積(mL),Y代表蛋白質總分子質量(Da)的log值。將數據帶入計算得到NZ13-CE酶的分子質量為45.5 kDa,接近理論分子質量46.5 kDa,可知NZ13-CE酶為單亞基酶,這與文獻報道結果一致[12]。

a-重組酶的凝膠排阻色譜法出峰圖譜；b-凝膠排阻色譜法標準曲線以及重組酶分子質量計算

3.6 重組NZ13-CE酶的酶學性質

重組酶在不同溫度下的相對酶活如圖6-a所示,結果表明其最適反應溫度為80 ℃,在70～85 ℃仍能保持80%以上的相對酶活力,當溫度超過85 ℃后,酶活力急劇下降。重組NZ13-CE酶在不同pH條件下的酶活力如圖6-b所示,可見該酶對于極端pH的耐受力很弱。當pH值為8.0時(緩沖液為Tris-HCl),其酶活力達到最高；隨著pH的增加,酶活力急劇降低,僅在pH值為7.5～8.0才能使得該酶保持80%以上的活性。這與已報道的其他CE酶較為相似,其原因可能是CE酶催化殘基為組氨酸,僅在中性條件下可同時作為質子供(受)體,因此在其他pH條件下活性變差。由于80 ℃是NZ13-CE酶的最適反應溫度,因此繼續研究80 ℃下的活力半衰期。由圖7-a可知,ln(Ut/U0)數值和保溫時間t可擬合成線性關系,線性方程為ln(Ut/U0)=-0.003 84t+0.003 91,當Ut/U0為0.5時,計算得到半衰期t1/2為181.5 min。由于異構酶均存在可逆反應平衡的特征,因此纖維二糖差向異構酶同樣存在反應平衡限制。使用過量酶與底物反應足夠長的時間即可得到對乳糖至乳果糖的最高轉化率。由圖7-b可知,重組酶對這一反應的最高轉化率為52.5%(質量分數)。進一步通過HPLC分析了反應產物中各組分的比例,由峰面積比較(圖8)可知,副產物依匹乳糖含量為總糖含量的9.2%；該數值低于已報道的CE酶,表明NZ13-CE酶形成依匹乳糖的能力較弱,有利于減少最終產品中依匹乳糖的含量。

a-NZ13-CE重組酶的最適反應溫度；b-NZ13-CE重組酶的最適反應pH

圖8 酶催化產物的HPLC圖譜分析

最后測定了NZ13-CE酶的反應動力學參數,雙倒數法求得方程Y=1 021.93X+1.77(R2=0.99),其中Y為1/v,X為1/[S]；結果表明其Km值為577.4 mmol/L,kcat值為12 150 min-1,Vmax值為0.565 mmol/(L·s)。以上數據與已報道的CE酶相比具有優勢,例如轉換數kcat值僅低于C.obsidiansis(14 004 min-1)和D.thermophilum來源(26 484 min-1)[12]；而其催化效率kcat/Km值為21.0 L/(min·mmol),遠高于C.saccharolyticus來源(CSCE),后者僅為4.2 L/(min·mmol)[15]。

3.7 E.coli BL21(DE3)-NZ13菌株的高密度發酵與基因表達

將E.coliBL21(DE3)作為NZ13-CE酶高密度發酵用菌株,總發酵周期為27 h,具體過程：37 ℃培養5 h,在重組大腸桿菌進入對數生長期后降溫至25 ℃開始誘導,添加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,加入IPTG后重組酶開始表達；同時進行流加補料,菌濃度逐漸上升并測得了酶活力不斷提高。為模擬實際工業化生產中更加嚴苛的客觀條件,對7.5 L罐發酵實驗中的攪拌轉速和通氣量進行限制,分別為最高800 r/min和5 L/min。發現在第5 h,誘導時溶氧僅有3%左右,低溶氧限制了菌體的快速生長,因此需要更長的發酵周期。OD600在27 h時停止上升達到81(DCW = 27.6 g/L),此時結束發酵并測得發酵液酶活力為4.30 U/mL。

4 討論

大腸桿菌是遺傳背景最為清晰的工程菌株之一,且生長速度快、蛋白表達能力強、易于高密度培養。盡管會產生內毒素,但現有技術已完全可以通過下游分離來去除[21]。本研究中將網團菌屬Dictyoglomussp.NZ13-RE01來源的纖維二糖差向異構酶在大腸桿菌BL21(DE3)中表達,搖瓶酶活力為0.53 U/mL發酵液；該酶催化乳糖獲得乳果糖的最高轉化率為52.5%,而副產物依匹乳糖比例僅為9.2%。經過27 h的高密度發酵,成功將發酵液酶活力提升到4.30 U/mL；反應動力學研究表明NZ13-CE酶具有相對較高的kcat值和kcat/Km值。盡管該酶活力仍有待提高,但未來可對NZ13-CE酶進行蛋白質工程改造,從而將其單酶活力進一步提升,實現乳果糖的生物法制備。

5 結論

本研究首次將網團菌屬Dictyoglomussp.NZ13-RE01菌株來源的CE酶編碼基因轉化大腸桿菌BL21(DE3)進行表達,結果表明NZ13-CE重組酶的最適反應溫度為80 ℃、最適反應pH為8.0,重組酶分子質量為45.5 kDa,在80 ℃下的活性半衰期為181.5 min,催化底物乳糖的最高轉化率為52.5%,重組菌株通過高密度發酵發酵液酶活可達4.3 U/mL,是搖瓶水平的8.1倍。