低谷蛋白大米在仿生大腸反應器中對腸道菌群結構及代謝的影響

胡國奧,詹曉北*,李志濤,朱莉,趙志超,張洪濤

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214125) 2(無錫格萊克斯生物科技有限公司,江蘇 無錫,214125)3(中國農業科學院作物科學研究所,北京,100081)

大米是人類消費蛋白質的重要來源,并且作為人類膳食蛋白質來源的需求將隨著世界人口的增加而顯著增加。大米中蛋白相對含量約為8%～10%,根據溶解度的不同可分為白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[1-2]。其中谷蛋白是水稻籽粒中主要的蛋白質貯存物,也是主要的可溶性蛋白,富含易被人體消化吸收的賴氨酸,位于胚乳細胞內的蛋白質體II中,約占大米總蛋白干質量的80%左右[3-4]。然而過高的可溶性蛋白的吸收可能會導致蛋白質代謝紊亂,尤其是對于糖尿病、腎臟病的患者來說,不宜食用可溶性蛋白含量超過4%的大米,同時過高的谷蛋白含量還會影響以大米為原料的發酵產品的質量[5-6]。因此低谷蛋白大米可以為人們帶來潛在的健康益處,但目前關于低谷蛋白大米經胃消化后對腸道菌群結構和代謝的影響還鮮有研究。

人體腸道中居住著高度多樣化的微生物群落,主要由細菌組成,是人體最龐大、最復雜的微生態系統[7-8]。腸道除了吸收營養、排出廢物之外,其中的細菌還能產生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)和支鏈脂肪酸(branched chain fatty acids,BCFAs)等有益或有害的物質,從而影響人體健康[11-12]。腸道菌群作為人體代謝的重要參與者,不僅能夠為人體代謝提供有益或有害的物質、酶和能量,而且可以通過從糞便中檢測菌群的DNA信息,幫助了解腸道功能及代謝性或免疫性疾病隱患,為醫療診斷提供多方面的探析數據[13]。因此,研究低谷蛋白大米對腸道菌群的益生效果具有重要意義。

應用體內消化模型研究食品藥品在人體內的消化過程往往存在著成本高、實驗周期長、可靠性差等缺點,因此使用體外消化模型反應器來模擬人體腸道已逐漸成為一種趨勢。體外消化模型分為靜態模型和動態模型,但靜態模型不能模擬體內發生剪切、混合等物理過程,且不會吸收消化過程中的代謝產物,而動態模型正好彌補了靜態模型的不足,不僅能夠對胃腸道中物理過程進行模擬,而且可以對不同消化時間下發生的其他變化進行觀測[14-15]。基于張文龍[16]設計的動態模型改進而成的仿生大腸反應器,是一種利用可編程邏輯控制的反應器,相比于其他動態模型,具有可視化好、結構高度仿生、準確性高等特點。

本研究以淀粉、低谷蛋白大米和普通大米為碳源,通過在仿生大腸反應器中發酵健康志愿者的糞便菌群,探究低谷蛋白大米對健康人群腸道菌群結構和代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要實驗材料

低谷蛋白大米,北京中國農科院作物科學研究所；普通大米,營口禾豐源米業有限公司；淀粉、耐高溫α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶、L-半胱氨酸鹽酸鹽、膽汁鹽,Sigma-Aldrich公司；TIANamp糞便基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設備

厭氧培養箱(HYQX-II),上海躍進醫療器械有限公司；紫外分光光度計(TU-1810),北京普析通用儀器有限公司；氣相色譜儀(7890A),安捷倫科技有限公司；生物傳感分析儀(SBA-40E),山東省科學院生物研究所。

1.1.3 仿生大腸反應器結構

仿生大腸反應器結構如圖1所示,由3個連續的玻璃反應容器構成,兩側為具有硅膠仿生大腸的直形容器,一側設有氮氣通氣口,一側設有透析口和排料口,中間為不設有硅膠仿生大腸的拱形容器,其上設有腸液流加口、堿液流加口、加樣口、補料口和排氣口。通過在反應瓶內套設具有真實大腸紋路的硅膠管,模擬人體大腸；通過玻璃瓶與硅膠仿生大腸之間的37 ℃恒溫循環水,模擬人體真實的內環境溫度；通過玻璃瓶和硅膠仿生大腸之間循環水的壓力實現對仿生大腸的擠壓,模擬大腸的蠕動；通過控制電磁閥的開啟和閉合時間與順序控制大腸蠕動的頻次,模擬在食物在大腸的蠕動頻率；通過發酵液在中空纖維濾膜的過濾吸收,來模擬人體腸道對營養物質和代謝產物的吸收。

1-PLC；2-觸控屏；3-恒溫水浴鍋；4-廢液瓶；5-中空纖維濾膜；6-補堿瓶；7-補料瓶；8-腸液流加瓶；9-蠕動泵；10-尾氣收集裝置；11-接種口；12-內層軟管；13-反應容器；14-pH電極；15-電磁閥；16-取樣口

1.2 實驗方法

1.2.1 腸道菌群培養體系

選取3名3個月內未接受抗生素治療的健康志愿者的糞便,制成糞便菌懸液接種于仿生大腸反應器內。反應器的裝液量為230 mL,接種量為10%(體積分數),pH設定為5.8,每天向反應器中通10 min氮氣,以維持反應器的厭氧環境,每隔12 h無菌取樣10 mL,并立即補充新鮮的發酵培養基,并以1 mL/min的速率進行透析,維持1 h。腸道菌群接種物的生長培養基每1 L包含6.0 g淀粉、1.0 g阿拉伯半乳糖、2.0 g果膠、1.0 g木聚糖、3.0 g酵母提取物、1.0 g胰蛋白胨、2.0 g酪蛋白、0.5 gL-半胱氨酸、1 g KCl、4.5 g NaCl、0.5 g K2HPO4、0.5 g KH2PO4、0.15 g CaCl2·6H2O、0.01 g MgSO4·7H2O、0.005 g FeSO4·7H2O、0.025 g氯化血紅素、1 mL吐溫-80、0.4 g膽汁鹽、1.0 mL維生素混合液。每1 L維生素混合液包含1.0 mg甲萘醌、2.0 mg D-生物素、0.5 mg維生素B-12、10 mg泛酸、5.0 mg煙酰胺、5.0 mg對氨基苯甲酸、4 mg硫胺素[19]。其余2組將淀粉換成等量的經唾液、胃腸液消化過后的低谷蛋白大米和普通大米。

1.2.2 SCFAs和BCFAs分析

參考王如月等[20]的方法,使用乙醚從樣品中提取SCFAs和BCFAs,并用安捷倫7820 A氣相色譜儀測定。使用HP-INNOWAX(19091 N-133)30 m毛細管柱分離SCFAs和BCFAs,內徑250 μm,膜厚0.25 μm。色譜升溫程序：初始溫度60 ℃保持1 min,以20 ℃/min升至190 ℃,保持7.5 min；進樣口溫度：220 ℃；氫火焰離子化檢測器(FID)溫度：250 ℃；進樣體積：5 μL,分流比20∶1；載氣：高純氮氣(純度>99.999%),流速：1.5 mL/min；尾吹氣：高純氮氣(純度>99.999%),流速：30 mL/min；氫氣流速：40 mL/min；空氣流速：400 mL/min。

1.2.3 氨的測定

使用靛酚藍-分光光度法[21]測定發酵液中的氨含量。向400 mL水中加入5 g苯酚和2.0 mL質量分數為1.25%的亞硝基鐵氰化鈉溶液,定容至500 mL配制溶液A；向400 mL水中加入2.5 g NaOH、3.5 mL NaClO和2.0 g檸檬酸三鈉,定容至500 mL配制溶液B,取100 μL發酵液樣品,分別加入5 mL溶液A和溶液B,充分混合后放入37 ℃恒溫水浴鍋中水浴顯色20 min,取出后冷卻至室溫,并在637 nm下測量其吸光度。

1.2.4 乳酸的測定

使用生物傳感儀測定發酵液中的乳酸含量。

1.2.5 微生物分析

1.2.5.1 平板計數

采用選擇培養基[22-23]對雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、糞大腸桿菌和總厭氧菌進行計數,本實驗所用的培養基條件及生長條件如表1所示。

表1 分析微生物群使用的選擇培養基和培養條件

1.2.5.2 DNA提取

分別提取淀粉組、大米組和低谷蛋白大米組發酵72 h后的基因組DNA。采用TIANamp糞便基因組DNA提取試劑盒提取DNA,并將提取的基因組DNA貯存在-40 ℃冰箱。

1.2.5.3 16S rDNA擴增子測序方法

16S rDNA擴增子測序技術是一種研究環境樣品中各種微生物分子的組成和結構問題的重要方法和手段[24]。將提取的DNA稀釋至1 ng/μL,以稀釋后的基因組DNA為模板,使用帶Barcode的特異引物對16S V3-V4區域進行PCR擴增。然后對得到的PCR產物進行純化,最后通過TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建,構建好的文庫使用Qubit和Q-PCR定量,文庫合格后,使用NovaSeq 6000進行上機測序。根據所擴增的16S區域特點,構建小片段文庫,基于Illumina NovaSeq 測序平臺對該文庫進行雙末端測序。經過Reads拼接過濾,以97%的一致性將序列聚類成為可操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs),進行物種注釋及豐度分析。

2 結果與分析

2.1 SCFAs和乳酸

結腸健康對維持整體健康狀態和降低疾病風險方面有重要作用。SCFAs是腸道菌群在發酵過程中的重要代謝產物,乳酸被認為是腸道微生物學的中間代謝物。乳酸和SCFAs可使結腸pH值降低至5～6,這對于抵抗病原體的定植具有重要作用[24]。由圖2可知,與淀粉組和普通大米組相比,低谷蛋白大米組的總SCFAs濃度顯著升高(P<0.05),其中乙酸濃度達到49.70 mmol/L,比淀粉組和普通大米組提高33.60%和18.42%；丙酸濃度達到26.68 mmol/L,比淀粉組提高47.32%；丁酸濃度達到28.47 mmol/L,比淀粉組和普通大米組提高67.18%和41.78%,總SCFAs的濃度達到104.85 mmol/L,比淀粉組和普糖大米組提高44.94%和25.33%。相比于淀粉組,低谷蛋白大米組的乳酸濃度也顯著升高,乳酸濃度達到18.19 mmol/L,比淀粉組提高60.55%。綜上所述,以低谷蛋白大米為碳源,對健康人群腸道菌群代謝產生SCFAs和乳酸具有顯著的促進作用。

圖2 腸道菌群以不同碳源發酵72 h后SCFAs和乳酸含量

2.2 BCFAs和氨

大多數微生物喜歡發酵碳水化合物,當有足夠數量的可發酵的碳水化合物存在時,蛋白質(或蛋白質中的氨基酸)被用于構建到微生物的生物量中,而不是用于蛋白水解發酵。當不存在碳水化合物時,或當碳水化合物不易發酵時(如纖維素),微生物群轉向蛋白質發酵,產生腐敗的、有毒的代謝物,如BCFAs和氨[25]。當體系中SCFAs和氨的含量減少時,蛋白質被更多地應用于構建微生物的生物量中,這對于增加微生物種群豐度具有重要意義。由圖3可知,相比于普通大米組,低谷蛋白大米組異丁酸、異戊酸、總BCFAs和氨濃度均顯著降低,其中,異丁酸的濃度為0.14 mmol/L,比普通大米組降低85.71%；異戊酸的濃度為0.15 mmol/L,比普通大米組降低73.33%,總BCFAs的濃度為0.29 mmol/L,比淀粉組降低79.31%；氨的濃度為2.60 mmol/L,比普通大米組降低16.15%。與淀粉組相比,普通大米組的BCFAs和氨含量均有顯著增長,低谷蛋白大米組BCFAs和氨的含量則沒有顯著增長,推測是因為普通大米中可溶性的谷蛋白含量高,使微生物群轉向蛋白質發酵,而低谷蛋白大米中,谷蛋白含量少,更多的以發酵碳水化合物為主。以上代謝數據表明,使用低谷蛋白大米為碳源,可以減少腐敗代謝物質的產生,對促進健康人群身體健康有積極作用。

圖3 腸道菌群以不同碳源發酵72 h后BCFAs和氨的含量

2.3 微生物分析

2.3.1 平板計數

采用平板計數法對部分腸道有益菌和有害菌的計數結果如圖4所示。低谷蛋白大米組的腸道有益菌的菌群濃度相較于淀粉組和普通大米組均有所增長,其中以雙歧桿菌和擬桿菌的增長最為顯著,濃度為8.27和8.92 lg CFU/mL,比淀粉組濃度提高0.67和0.85 lg CFU/mL,比普通大米組濃度提高0.41和0.23 lg CFU/mL；而腸道有害菌糞大腸桿菌濃度相較于淀粉組也顯著降低,濃度為7.39 lg CFU/mL,比淀粉組和普通大米組濃度降低0.41 lg CFU/mL。由平板計數結果可知,使用低谷蛋白大米為碳源,能顯著增加健康人群腸道有益菌的濃度,降低腸道有害菌濃度。

圖4 腸道菌群以不同碳源發酵72 h后的菌群濃度

2.3.2 菌群組成

由圖5可知,在門水平上,體外發酵不同碳源后的優勢菌群均為擬桿菌門(Bacterioidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria),占菌群總數的95%以上。體外發酵健康人糞便菌群72 h后,相比于淀粉組,普通大米組和低谷蛋白大米組的擬桿菌門和厚壁菌門增多,變形菌門和梭桿菌門減少,以低谷蛋白大米組的變化尤為明顯。厚壁菌門和擬桿菌門存在一種相互促進的共生關系,共同促進宿主吸收和儲存能量[26]；變形菌門和梭桿菌門中多數細菌對人體具有致病性,變形菌門是典型的腸道菌群失調標志物,其中低谷蛋白大米組的變形菌門菌群數量明顯減少,推測可能是因為短鏈脂肪酸和乳酸產量升高,降低了腸道pH,從而抑制了腸道有害菌的生長[24],由此可知,低谷蛋白大米可以改善健康人群的腸道菌群生態平衡。結果表明,低谷蛋白大米能改善健康人群門水平上腸道菌群的結構,促進腸道菌群的生態平衡。

圖5 不同碳源發酵72 h后的腸道菌群在門水平上的影響

為了研究低谷蛋白大米對腸道菌群在屬水平上的影響,根據所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息繪制成熱圖。由圖6可知,在屬水平上,不同碳源發酵72 h后,各組糞便菌群的組成差異較大。相比于淀粉組,普通大米組的梭菌嗜膽菌屬(Bilophila)、狄氏副擬桿菌屬(Parabacteroides)、黃桿菌屬(Flavonifracto)的相對豐度顯著增多,嗜血桿菌屬能引起原發性化膿性感染及嚴重的繼發感染,狄氏副擬桿菌屬可以產生有益的代謝終產物,如乙酸、琥珀酸等,而黃桿菌屬多為條件致病菌。低谷蛋白大米組的梭菌屬(Fusobacterium)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的相對豐度顯著減少,梭桿菌屬、檸檬酸桿菌屬和克雷伯氏菌屬中的多數細菌具有致病性；芽孢桿菌屬(Bacillus)、柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、巨型球菌屬(Megasphaera)的相對豐度顯著增多,其中,芽孢桿菌屬可以拮抗腸道內的有害菌,柔嫩梭菌屬是主要的產丁酸菌屬,羅姆布茨菌屬對維持宿主健康狀態有重要作用,巨型球菌屬參與人體乳酸和果糖的發酵。這也與BONDER等[27]關于低谷蛋白谷物可以減少梭桿菌屬等有害菌豐度研究結果相似。同時,以低谷蛋白大米為碳源發酵腸道菌群,部分有益菌屬增多,這部分菌通常是一些產SCFAs和乳酸的細菌,也從側面解釋了以低谷蛋白大米為碳源,SCFAs和乳酸的含量會較淀粉組和普通大米組有顯著提高的原因。綜合上述結果,低谷蛋白大米能改善健康人群屬水平上的腸道菌群結構。

圖6 不同碳源發酵72 h后的腸道菌群在屬水平上的物種豐度聚類圖

將樣本中的OTUs數目按相對豐度由大到小排序得到對應的排序編號,再以OTUs的排序編號為橫坐標,OTUs中的相對豐度為縱坐標,繪制得到等級聚類曲線,它可直觀地反映樣本中物種的豐富度和均勻度。由圖8可知,使用低谷蛋白大米組的曲線在橫軸的跨度最大,且垂直方向,曲線也最為最為平緩,而曲線在橫軸上的跨度越大,物種的豐富度越高,垂直方向上曲線越平緩,物種分布越均勻。以上結果表明,低谷蛋白大米可以有效增加健康人群腸道菌群的豐富度和均勻度。推測是由于低谷蛋白大米中谷蛋白含量低,而其余大米大白如醇溶性蛋白比例升高,谷蛋白主要由賴氨酸組成,而醇溶性蛋白組要由脯氨酸和酰胺組成,因此氨基酸的比例也更加均衡,且由BCFAs和氨含量下降可知,腸道菌群多以發酵碳水化合物為主,蛋白質被更多的應用于構建微生物的細胞量中,這些均有助于促進菌群多樣性。

圖7 不同碳源發酵72 h后的腸道菌群等級聚類曲線

3 結論

本研究以淀粉、低谷蛋白大米和普通大米為碳源在仿生大腸反應器中對健康人群的糞便微生物進行發酵,探究低谷蛋白大米對腸道菌群結構及其代謝產物的影響。通過對在仿生大腸反應器中發酵72 h后的SCFAs、BCFAs、乳酸和氨含量進行測定,及對發酵72 h后腸道菌群的部分菌群進行選擇性培養可知,相較于淀粉和普通大米,低谷蛋白大米對SCFAs和乳酸的生成具有促進作用,并對一些不好的代謝產物,如BCFAs和氨的生成具有一定程度的抑制作用,還可以增加一些腸道有益菌的菌群數量,如雙歧桿菌和擬桿菌等,降低有害菌的濃度,如糞大腸桿菌。由16S rDNA測序可知,低谷蛋白大米能顯著提高腸道菌群的相對豐度,尤其是一些腸道有益菌的相對豐度,如擬桿菌門和厚壁菌門,降低腸道有害菌的豐度,如變形菌門和梭桿菌門。綜合以上結論,低谷蛋白大米對健康人群腸道菌群的結構和代謝均有正向影響。