產胞外多糖植物乳桿菌WHH589的免疫活性及其在發酵乳中的應用

孫盛,陳作國,俞赟霞,曲冬梅,余騰斐,李言郡,陳蘇

(杭州娃哈哈集團有限公司，杭州娃哈哈科技有限公司，浙江省食品生物工程重點實驗室,浙江 杭州,310018)

微生物產生的胞外多糖(extracellular polysaccharides,EPS)是其在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的黏液多糖或夾膜多糖[1]。自然界中產生胞外多糖的微生物很多,傳統的發酵食品(如酸奶、泡菜、酸面團等)中含有大量產胞外多糖的乳酸菌[2]。傳統發酵食品來源的微生物胞外多糖被公認為是安全的,特別是乳酸菌產生的胞外多糖,可以直接作為發酵劑或添加物應用于發酵食品中[3]。研究發現,產胞外多糖的乳酸菌能夠改善乳制品的質構、黏度和風味,使其發酵乳質構細膩黏稠、結構穩定、口感潤滑[4]。乳酸菌胞外多糖還具有提高免疫力、降膽固醇、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等多種生理活性[5]。乳酸菌胞外多糖的免疫調節功能是研究最為廣泛的,也是被普遍認同的,其作用機制主要是通過增強細胞介導的免疫反應(如促進T/B淋巴細胞增殖、激活NK細胞活性、增強單核細胞吞噬能力等)來加強機體的免疫防護作用,從而提高免疫力[6]。

乳酸菌被認為是綠色安全的益生菌,因此產胞外多糖的乳酸菌可以直接應用到發酵生產中[7]。同時,乳酸菌胞外多糖還可作為益生元促進腸道內其他益生菌的生長,改善腸道微生態環境,促進機體健康[8]。鼠李糖乳桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG,LGG)是研究最多的益生菌之一。研究發現,LGG能夠在胃腸道內存活并定植[9],具有產胞外多糖的特性[10],同時也可促進有益菌在腸道定植,并激活腸道免疫反應,提高機體免疫力[11]。

本研究從傳統發酵食品中分離乳酸菌,以LGG菌株為對照,進行產胞外多糖乳酸菌的篩選,并對高產胞外多糖乳酸菌特性進行研究,同時探索了乳酸菌和其胞外多糖的免疫活性,及在發酵乳中的應用。以期為開發具有一定生理活性的產胞外多糖的乳酸菌功能性發酵劑提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

雄性SPF級昆明小鼠,浙江省中醫藥大學動物實驗中心。人結直腸腺癌細胞HT-29,中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。鼠李糖乳桿菌GG分離自市售產品康萃樂益生菌粉,杭州娃哈哈集團菌種保藏中心。

MRS培養基,英國Oxoid生物試劑有限公司；細菌/細胞總DNA提取試劑盒,北京天根生化科技有限公司。

1.2 實驗儀器

DU800紫外分光光度計,美國Beckman公司；Multiskan Sky酶標儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司；OLYMPUS BX61光學顯微鏡,日本Olympus株式會社；DV2T黏度計,美國BROOKFIELD公司；AFL-W15A乳品發酵監控儀,法國AMS Alliance iCinac公司；905 Titrando電位滴定儀,瑞士Metrohm公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株分離純化與鑒定

1.3.1.1 菌株分離純化

稱取1 mL(或1 g)樣品(采集西藏、新疆、貴州、青海和四川的泡菜、酸奶等)加入9 mL無菌生理鹽水中,充分混勻,10倍梯度稀釋,取適當稀釋梯度稀釋液0.1 mL,涂布于固體MRS培養基上,于37 ℃厭氧培養48 h。根據菌落形態特征挑選典型單個菌落,劃線分離2～3次,獲得純菌株,編號,于杭州娃哈哈集團菌種保藏中心保藏。

1.3.1.2 16S rDNA鑒定

用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA,用引物27-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492-R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行16S rDNA片段擴增,擴增產物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序,測序結果通過NCBI-BLAST數據庫比對[12]。根據菌株16S rRNA序列,通過MEGA5軟件,采用最大似然法構建系統發育進化樹。

1.3.2 產胞外多糖乳酸菌的篩選和胞外多糖的提取純化

1.3.2.1 胞外多糖乳酸菌的篩選

將分離純化得到的菌株,在固體MRS培養基上劃線,于30和37 ℃厭氧培養24 h。用無菌牙簽挑取單菌落,比較菌落拉絲的長度。

1.3.2.2 胞外多糖提取和純化

菌株種子液接種于MRS液體培養基中,在30和37 ℃恒溫培養箱中培養24 h,收集菌液。菌液煮沸10 min后,冷卻,7 000 r/min,4 ℃離心20 min收集上清液,加入質量分數為80%的三氯乙酸溶液至質量分數為4%,4 ℃靜置過夜。7 000 r/min,4 ℃離心20 min收集上清液,加入2.5倍體積的體積分數為95%冰乙醇4 ℃過夜,7 000 r/min,4 ℃離心20 min收集沉淀。沉淀用蒸餾水溶解,裝入透析袋(截留分子質量14 kDa)中透析48 h,每8 h換一次蒸餾水,透析液冷凍干燥96 h[6,13]。LGG菌株為對照菌。

1.3.2.3 胞外多糖檢測

采用苯酚-硫酸法[14]測總糖含量,3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)比色法測定還原糖含量,用總糖含量減去還原糖含量,差值即為胞外多糖含量。

1.3.3 菌株生物學特性研究

1.3.3.1 生長和產酸曲線

菌株種子液接種于MRS液體培養基中,在37 ℃下培養24 h,每隔2 h取樣1次,測定在600 nm波長的光密度(OD)值和pH值,繪制生長曲線和產酸曲線。

1.3.3.2 耐受性實驗

菌株活化后,取對數生長末期菌液,4 000 r/min離心10 min,棄上清液,獲得菌泥。分別進行如下操作：①加入等體積pH 2.5的MRS培養基,充分混勻,37 ℃培養4 h,用平板計數法測定0、1、2和4 h后活菌數。②加入等體積質量分數為0.3%膽鹽的MRS培養基,充分混勻,37 ℃培養8 h,用平板計數法測定0、4和8 h后活菌數[15]。LGG菌株為對照菌。按公式(1)計算菌株存活率：

(1)

式中：S為菌株存活率,%；N1為菌株培養后活菌數對數值,CFU/mL；N0為菌株培養0 h活菌數對數值,CFU/mL。

1.3.3.3 菌株的黏附特性

建立HT-29細胞培養體系,以1×106細胞/孔的密度接種于已放置細胞爬片的12孔細胞培養板中,37 ℃ 5% CO2培養箱中培養2 d。菌株活化后,取對數生長末期菌液,4 000 r/min離心10 min,棄上清液,獲得菌泥,重懸于含質量分數為10%胎牛血清的DMEM完全培養基中,取2×108CFU/mL的菌液1 mL接種于上述12孔細胞培養板中,37 ℃ 5% CO2培養箱中孵育2 h。孵育結束后,吸去培養液,PBS溶液洗滌2次,甲醇固定8 min。取出細胞爬片靜置20 min,經革蘭氏染色后,用中性樹脂封片[16]。于光學顯微鏡下進行觀察,每個片子隨機選取10個視野計數。LGG菌株為對照菌。

1.3.4 菌株及其胞外多糖免疫活性

1.3.4.1 菌株免疫活性

昆明小鼠飼養溫度為(21±2)℃,濕度為 40%～70%,12 h光照交替,自由攝入小鼠維持飼料和飲水。昆明小鼠脫頸椎處死,無菌取小鼠脾臟,經200目金屬篩網過濾后,加入ACK細胞裂解液(5倍于細胞體積)裂解5 min,加入無菌Hank’s液(9倍體積于裂解液)終止裂解,1 000 r/min,4 ℃離心5 min。沉淀重懸于5 mL 含質量分數為10%胎牛血清的RPMI-1 640培養基[17-18]。用臺盼藍染色,血細胞計數板計數,調整細胞濃度為5×106cells/mL。菌株活化后,菌液濃度調整至2×108CFU/mL。

將細胞懸液加入96孔細胞培養板,分為調零組、空白對照組、誘導劑組(10 μg/mL Con A或LPS)和菌處理組(10 μg/mL Con A或LPS+菌懸液),37 ℃ 5% CO2培養箱中培養72 h。培養結束后,每孔加入20 μL 2.5 g/L MTT溶液,37 ℃顯色4 h后,加入100 μL DMSO,用酶標儀于490 nm下測定吸光值[19]。LGG菌株為對照菌。

1.3.4.2 菌株胞外多糖免疫活性

將昆明小鼠脾淋巴細胞細胞懸液(5×106cells/mL)加入96孔細胞培養板,分為調零組、空白對照組、誘導劑組(10 μg/mL Con A或LPS)和胞外多糖處理組(10 μg/mL Con A或LPS+不同質量濃度胞外多糖,質量濃度為0.001、0.005、0.01、0.025、0.050和0.100 g/L),37 ℃ 5% CO2培養箱中培養72 h。培養結束后,進行MTT實驗。

1.3.5 發酵乳中的應用

稱取脫脂乳100 g,45～50 ℃的純水900 g,50 ℃溫水溶解,剪切30 min,50 ℃水化30 min,均質,95 ℃殺菌10 min,降溫備用。菌株以1×106CFU/mL接種于上述脫脂乳中,37 ℃發酵12 h,4 ℃后熟8～12 h。觀察凝乳狀態,用打蛋器破乳后,檢測其拉絲長度、產酸曲線、黏度、酸度,并對其發酵風味進行評估。

2 統計分析

每個實驗設置3次重復,數據分析用SPSS 17.0軟件,作圖用Graph Pad Prism 6.01版本軟件,顯著性分析用Duncan’s多重比較檢驗法進行,測定指標均表示為“平均值±標準差”,顯著水平設置為0.05和0.01。

3 結果與分析

3.1 產胞外多糖菌株篩選與胞外多糖含量測定

36個樣品共計分離得到224株乳酸菌。經菌落拉絲初篩,獲得4株有明顯單菌落拉絲的菌株,編號為WHH483、WHH589、WHH647和WHH997。其中WHH589拉絲長度最長,依次是WHH483、WHH647和WHH997。提取胞外多糖后,產量最高的菌株為WHH589(圖1),達0.58 g/L,顯著高于對照菌LGG和其他3株乳酸菌,胞外多糖產量是LGG(0.28 g/L)的2.07倍。

圖1 胞外多糖產量

3.2 WHH589菌株鑒定與保藏

WHH589分離自四川泡菜樣品,WHH589的16S rRNA基因序列測序結果于NCBI的GenBank數據庫進行同源性比對分析,并構建系統發育進化樹。結果顯示WHH589為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),命名為植物乳桿菌WHH589(圖2)。植物乳桿菌WHH589于2018年5月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏,微生物保藏編號為CGMCC No.15811。

圖2 植物乳桿菌WHH589 16S rRNA序列系統發育樹

3.3 植物乳桿菌WHH589基礎特性

3.3.1 植物乳桿菌WHH589生長和產酸曲線

生長曲線和產酸速率是反應乳酸菌活力的重要特征。由圖3可知,植物乳桿菌WHH589顯示出較好的生長和產酸能力。植物乳桿菌WHH589在經過0～2 h的遲緩期后,從2 h開始快速生長,進入對數生長期,14 h結束對數期后進入穩定期；植物乳桿菌WHH589在接種后10 h產酸趨于平穩,pH達3.80～4.00。

a-生長曲線；b-產酸曲線

3.3.2 植物乳桿菌WHH589耐受性

胃腸道環境極其復雜和嚴苛,乳酸菌能否順利通過胃腸道,并保持活性,對發揮其益生功能至關重要。由表1可知,植物乳桿菌WHH589具有良好的耐酸和耐膽鹽的特性。在酸環境下孵育4 h后,存活率高達97.77%,達到5.91×108CFU/mL,優于對照菌LGG,其存活率僅為92.22%。在膽鹽環境下孵育8 h后,存活率高達94.81%,雖然低于對照菌LGG,但也達到4.71×107CFU/mL,表現出較好的膽鹽耐受性。

表1 植物乳桿菌WHH589的耐受性

3.3.3 植物乳桿菌WHH589黏附性

乳酸菌黏附性是評價其能否在腸道定植,發揮益生功能的重要標準。由圖4可知,植物乳桿菌WHH589具有良好的黏附特性。黏附率為(1.96±0.15)菌數/細胞,與對照菌LGG相當,LGG黏附率為(1.75±0.30)菌數/細胞。

圖4 植物乳桿菌WHH589的黏附性

3.4 植物乳桿菌WHH589及其胞外多糖免疫活性

3.4.1 植物乳桿菌WHH589免疫活性

由圖5可知,植物乳桿菌WHH589能夠顯著促進脾臟中T、B淋巴細胞的增殖,具有免疫調節活性,且優于LGG菌株。在沒有誘導劑的條件下,促脾淋巴細胞增殖提高79.79%,與LGG相當；在LPS誘導的條件下,促脾淋巴細胞增殖提高110.36%,是LGG的1.20倍；在Con A誘導的條件下,促脾淋巴細胞增殖提高127.55%,是LGG的1.13倍。

圖5 植物乳桿菌WHH589的促脾淋巴細胞增殖

3.4.2 植物乳桿菌WHH589胞外多糖免疫活性

由表2可知,植物乳桿菌WHH589分泌的胞外多糖能夠顯著促進脾淋巴細胞增殖。在沒有誘導劑的條件下可提高93.27%～164.42%；在LPS誘導的條件下可提高80.15%～125.95%；在Con A誘導的條件下可提高81.58%～149.12%。說明植物乳桿菌WHH589分泌的胞外多糖不同濃度作用效果不同,但都能夠顯著促進脾臟中T、B淋巴細胞的增殖,具有免疫調節活性,質量濃度在1～100 μg/mL都有顯著效果,且10～25 μg/mL效果最佳。

表2 植物乳桿菌WHH589的胞外多糖促脾淋巴細胞增殖結果

3.5 植物乳桿菌WHH589在發酵乳中的應用

由表3和圖6可知,植物乳桿菌WHH589發酵乳凝乳狀態緊實,表面光滑,無乳清析出,破乳后絲滑黏稠,拉絲長度(25.57±0.57)cm,活菌數達4.97×108CFU/g,感官和風味良好,奶香明顯,口感細膩絲滑。植物乳桿菌WHH589可以作為發酵劑應用于發酵乳制品中。

表3 發酵乳特性

圖6 發酵產酸速率曲線

4 討論

胞外多糖產量除受到菌株本身遺傳特性的影響外,培養基組成、培養時間、培養溫度、pH等也是影響胞外多糖產量的重要因素[20]。同時,胞外多糖的提取、純化方法也很關鍵,如提取的方法(甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮)、除蛋白的方法(Sevage法、三氟三氯乙烷法和三氯乙酸法)、除去雜質的方法(透析法、離子交換樹脂法和凝膠過濾法),對獲得高純度的胞外多糖十分重要[21]。研究發現,LGG是1株產胞外多糖的乳酸菌,不同文獻報道其胞外多糖產量不同,CLAS等研究發現LGG菌株在牛奶中培養胞外多糖產量為0.08 g/L[11],張娟等[22]研究了不同培養條件和提取方法對LGG菌株胞外多糖產量的影響,發現其產量在0.025～0.296 g/L,這與菌株的培養條件、胞外多糖的提取方法有關。本研究以LGG菌株為對照菌,在同一條件下,與篩選到4株產胞外多糖的乳酸菌進行比較,經過除蛋白、醇沉和透析獲得胞外多糖,發現其中一株植物乳桿菌WHH589胞外多糖產量顯著高于LGG菌株(P<0.01),達到0.58 g/L,LGG胞外多糖產量為0.28 g/L,其他3株乳酸菌胞外多糖產量與LGG相當,說明植物乳桿菌WHH589是一株高產胞外多糖的乳酸菌。

人胃內的pH值空腹到餐后范圍在1～4.5變化,食物在胃內停留在3 h左右；膽鹽濃度在0.03%～0.3%,但也會隨著飲食的變化而改變,食物在小腸內停留在4 h左右[23]。乳酸菌能否在胃腸道低pH、高膽鹽濃度的環境下存活,并黏附于腸道上皮細胞,對其在腸道內定植和功能發揮至關重要。本研究分析了植物乳桿菌WHH589菌株在pH 2.5和0.3%膽鹽條件下的存活情況,以及在HT-29細胞表面的黏附性,發現植物乳桿菌WHH589菌株在pH 2.5條件下可存活4 h以上,存活率高達97.77%；在0.3%膽鹽環境下可存活8 h以上,存活率高達94.81%；在HT-29細胞表面的黏附率為(1.96±0.15)菌數/細胞,表現出良好的耐受性和黏附特性。

脾臟是T/B淋巴細胞定居的主要場所,也是初次免疫應答產生抗體的主要器官。T淋巴細胞和B淋巴細胞是兩類重要的免疫激活細胞,T淋巴細胞主要參與細胞免疫,而B淋巴細胞則是產生抗體。Con A作為T淋巴細胞的有絲分裂原,僅對T淋巴細胞的增殖起促進作用,對B淋巴細胞不起作用；反之LPS僅能誘導B淋巴細胞增殖[6]。當有病原體入侵時,T、B淋巴細胞被激活,參與免疫應答,清除病原體,保護機體健康。KIM等[24]研究發現LGG能夠促進小鼠脾淋巴細胞增值,具有免疫調節功能。胞外多糖具有免疫活性,一方面它能夠通過激活非特異性免疫中巨噬細胞和NK細胞活性,提高機體分泌免疫分子的能力；另一方面又能通過激活T淋巴細胞和B淋巴細胞活性,作用于特異性免疫系統,增強機體免疫力[25]。本研究分析了植物乳桿菌WHH589菌株對小鼠脾淋巴細胞增殖效果,以LGG菌株為陽性對照,發現菌濃度在1×107CFU/mL時,植物乳桿菌WHH589能顯著促進T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖(P<0.01),與LGG相當。同時,植物乳桿菌WHH589胞外多糖質量濃度在1～100 μg/mL時,也能顯著促進T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖(P<0.01),提高機體免疫力。

乳酸菌胞外多糖可作為增稠劑、穩定劑和保鮮劑等應用于食品領域。產胞外多糖的乳酸菌作為發酵劑可以改善乳制品的質地、穩定性和口感,同時乳酸菌胞外多糖能夠解決發酵乳凝膠易破裂和易脫水收縮等問題,使得發酵乳結構更加穩定,延長保質期[26]。本研究對植物乳桿菌WHH589在發酵乳中的應用進行探究,發現植物乳桿菌WHH589發酵乳質構黏稠,拉絲明顯,長度達25.57 cm,口感細膩絲滑,活菌數達4.97×108CFU/g,同時植物乳桿菌WHH589及其胞外多糖又具有免疫活性,可以作為功能性發酵劑用于發酵食品中,提高產品附加屬性。

5 結論

綜上所述,本研究從四川泡菜樣品中分離得到1株植物乳桿菌,命名為WHH589,微生物保藏編號為CGMCC No.15 811。研究發現植物乳桿菌WHH589具有良好的耐受性和黏附性,能夠產生大量胞外多糖,菌株及其胞外多糖能夠顯著促進脾淋巴細胞增值,且發酵特性優良,可作為功能性發酵劑應用于發酵乳中。