白酒固態雙邊發酵糖化機理及其對發酵過程的影響

高銀濤,何璇,余博文,蔡叢菊,陳建新*,丁重陽*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)2(江蘇泰州梅蘭春酒廠有限公司,江蘇 泰州,225300)

中國白酒是一種在固態條件下以谷物為原料、酒曲為糖化發酵劑,采用邊糖化邊發酵的雙邊發酵工藝生產的蒸餾酒[1]。由于我國現代的固態發酵技術起步較晚,所以對白酒雙邊發酵過程的研究較少,就糖化來說,國內大部分白酒研究只是聚焦于對大曲和酒醅中的酶活力和糖化產物的提取和測定上,未對雙邊發酵過程提出較為精確的控制要求和方法[2-4]。

我國傳統白酒一直沿用窖池固態發酵法,糖化發酵過程受到糧食原料的糊化程度、發酵溫度、酸和酒精等多方面的影響[5]。谷物原糧的糊化是微生物能夠有效利用的關鍵步驟,蒸煮工藝條件的確定和優化對于后續的糖化過程具有重大影響[6]；確定原料糊化率、溫度、酸和酒精等各種因素對糖化速率的影響,確定對白酒發酵的控制方法,對制曲生產和釀酒生產具有極大的理論和實踐意義,對于醋、醬油等固態發酵也有一定的借鑒意義[7-9]。本文探究了糊化率、溫度、酸和酒精等因素對糖化速率的影響和控制方法,不同酒醅初始糖化酶活力和最終的酵母產酒差異,為精確控制白酒糖化過程提供參考依據和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糧食原料、糠殼,江蘇泰州梅蘭春酒廠有限公司；糖化酶,江蘇銳陽生物科技有限公司；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),安琪酵母股份有限公司；氨芐青霉素鈉,生工生物工程(上海)股份有限公司；鹽酸、可溶性淀粉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、3,5-二硝基水楊酸、酵母膏、葡萄糖等試劑(分析純),國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SHP-250 生化培養箱,上海精宏實驗設備有限公司；UVmini-1240 紫外分光光度計,日本島津公司；PB2002-N 電子天平,Mettler Toledo 公司；Freezone 6 plus真空冷凍干燥機,美國Labconco公司；Quanta 200 掃描電子顯微鏡,Fei公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄糖標準曲線繪制

葡萄糖標準曲線繪制參考文獻[10]。通過數據分析,得到回歸方程y=0.549 2x-0.033 7(R2=0.999 4,x為葡萄糖質量濃度；y為吸光度值)。

1.3.2 還原糖測定

稱取待測樣品10 g,加入100 mL去離子水,于室溫下攪拌30 min,用濾紙過濾得到待測液,用DNS法對待測液進行還原糖測定[11-12]。

1.3.3 不同條件對糖化速率的影響

研究糊化率、溫度、酸和酒精對糧食糖化速率的影響,主要通過加塞玻璃瓶模擬窖池糧食糖化發酵固態條件從而進行實驗。采用糊化率55%蒸煮工藝得到的原料,發酵溫度30 ℃,酶用量120 U/g,乳酸含量0.04 mL/g,酒精含量0 mL/g。在其他條件不變下,分別改變:原料糊化率(50%、55%、60%),溫度(20、30、40、50、60 ℃),乳酸增量(0、0.02、0.04、0.06 mL/g),酒精(0、0.05、0.1、0.15、0.2 mL/g)。糖化發酵4 h,測定還原糖量,計算糖化速率。上述條件覆蓋正常白酒發酵的酒醅的溫度、酸度和酒精含量范圍。

1.3.4 糧食原料蒸煮工藝

傳統釀酒原料堆積入窖前的蒸煮工藝依次是熱水潤糧,潤糧一段時間后拌糠殼以增加糧食的疏松度和透氣性,之后蒸糧,最后進行拌曲拌醅入池發酵[13]。根據糧食蒸煮的影響因素,選取了潤糧水量(50%、70%、90%)、潤糧時間(120、150、180 min)、蒸糧時間(30、40、50 min)以及潤糧水溫(60、80、100 ℃)4個因素進行4因素3水平正交試驗,同時結合糊化率進行判別。糊化率測定方法參考馮興垚[14]方法確定。

1.3.5 實驗室模擬糖化發酵實驗

本實驗主要探究的是糖化速率對酵母發酵白酒的影響,為了降低無關因素的影響,在發酵前只添加糖化酶和釀酒酵母。具體操作：以加塞玻璃瓶模擬窖池,將經過蒸煮的原料每100 g拌入10 mL不同濃度糖化酶得到不同的初始酶活力原料(15、30、60、120、180 U/g)和10 mL活化酵母液(2×107CFU/mL),進行發酵實驗。

1.3.6 掃描電子顯微鏡微觀分析

采用掃描電子顯微鏡對糧食碎粒糖化面進行微觀分析,選取原始高粱碎粒、潤糧后高粱顆粒、蒸煮后高粱碎粒和發酵一段時間高粱碎粒。將樣品放置-70 ℃冰箱進行冷凍處理24 h,取適量入50 mL離心管中用真空冷凍干燥機進行干燥處理,最后取樣品進行掃描電子顯微鏡拍照,進行微觀結構觀察分析[15-17]。

2 結果與分析

2.1 不同因素對糖化速率的影響

2.1.1 糊化率對糖化速率的影響

由圖1可以看出,糊化率不同,糧食原料的糖化速率不同,并且糖化速率隨著糊化率上升而逐漸上升。原因可能是隨著糊化率的增加,糖化酶底物隨之增加,在酶充足的條件下,糖化速率也隨之增加[18]。在實際生產中,可以通過控制糧食原料的蒸煮工藝進而改變白酒原料的糊化程度,來控制原料的糖化速率。

圖1 糊化率對糖化速率的影響

2.1.2 糧食蒸煮工藝的優化

通過正交試驗,探究了潤糧用水量、潤糧時間、潤糧溫度和蒸糧時間對糧食糊化率的影響,其結果如表1所示。最佳工藝參數為：潤糧水量90%、潤糧時間180 min、蒸糧時間40 min、潤糧溫度60 ℃。在此條件下糊化率最高,可達61.63%,相同工藝重復驗證實驗糊化率達60.78%,誤差較小。在幾種影響因素中,蒸糧時間對糧食原料糊化影響最大,極差為6.263。但在實際生產中,蒸煮工藝還需要結合感官評價,不能一味只顧糊化率,導致發酵原料過于發黏。

表1 糧食蒸煮工藝正交試驗結果與分析

2.1.3 溫度對糖化速率的影響

由圖2可以看出,在20～50 ℃,酶反應速率隨著溫度上升而逐漸上升,50 ℃以后,酶反應速率急劇下降。原因可能有2個方面,一方面前期隨著溫度的升高,反應物能量加劇,有效碰撞增加,酶促反應速率增加,糧食糖化速率加快;另一方面,糖化酶作為一種蛋白質,溫度的升高會引起酶蛋白質的變性,導致酶促反應速率下降[19]。結合日常發酵和酶學特性判斷,當保持糖化反應溫度為40～50 ℃時,糧食糖化速率最快,在具體生產中可以結合溫控設備對酒醅發酵進行溫度實時監測并采取適宜手段進行控溫發酵。

圖2 溫度對糖化速率的影響

2.1.4 乳酸對糖化速率的影響

由圖3-a可以看出,在潤糧時加一定量乳酸,在一定范圍內可以促進原料的糊化,這是因為酸的增加有利于淀粉降解為小分子[20],但隨著酸的增加,促進原料糊化效果降低,同時還會導致原料發黏,不利于后續的發酵。由圖3-b得知,在蒸煮后添加不同含量的乳酸,糖化速率隨著乳酸含量上升而逐漸下降。原因可能是隨著乳酸含量的增加,酶活性部位基團的解離狀態不利于酶與底物的結合,酶活力相應降低,同時添加乳酸會使pH降低,對酶的構象產生影響,從而使酶變性失活[21]。

a-乳酸對糊化率的影響；b-乳酸對糖化速率的影響

2.1.5 酒精對糖化速率的影響

由圖4可以看出,糖化速率隨著酒精含量上升而緩慢下降,當酒精含量達到一定含量,隨著酒精含量上升,糖化速率變化趨于平緩,從整體趨勢來看,酒精對糖化速率影響不大。原因可能是酒精不參與糖化反應,所以對糖化反應速率影響較小,但同時另一方面酒精的存在會對酶的構象產生影響,從而使酶變性失活。

圖4 酒精對糖化速率的影響

2.2 模擬糖化發酵實驗

在糖化速率影響因素研究過程中,發現溫度、酸等因素主要是通過影響酶活力,進而影響糖化速率。在此基礎上,根據控制初始酶活力,結合酒精度測定,對糧食原料進行發酵實驗,結果如圖5所示。

圖5 初始酶活力對發酵產酒精的影響

由圖5可以看出,發酵原料初始酶活力高于120 U/g,即發酵原料的初始酶活力相對較高情況下,最后酒精產量變化不大；當發酵原料初始酶活力低于120 U/g,即發酵原料的初始酶活力相對較低的情況下,初始酶活力與酒精的最終產量存在顯著相關。分析原因可能是因為發酵前期底物充足,在發酵原料的初始酶活力較低階段,這時的糖化速率主要取決于初始酶活力,進而造成后續的發酵產酒差異；到了后期,因為酵母大量死亡和發酵底物的減少,導致最終產酒存在差異。同時由圖5中可以看出,在發酵前期,酒精快速生成,酒精逐漸積累,隨著時間的延長,在發酵4 d之后,酒精含量不再顯著增長,結合圖6分析可知,這是因為在發酵過程中,酵母數量在4 d左右急劇減少所致,這與高大禹等[22]的白酒發酵酵母數量研究結果相符,還可能的原因是隨著糊精等糖化酶底物逐漸減少造成了糖化發酵基本停滯。

由圖6-a可以看出,隨著發酵的進行,糧食原料的淀粉含量逐漸降低,與產酒精趨勢基本相符。由圖6-b可得還原糖含量呈現先減少,后增加的趨勢,初始酶活力越高,該趨勢越顯著,結合圖6-c和圖6-d分析發現，這是因為在發酵過程中酵母數量逐漸降低,而酶活力基本不變,進而導致初始酶活力的情況還原糖會呈現先減少后增加的變化趨勢。在實際生產中,可以通過控制大曲的產糖化酶菌株的比例、拌曲發酵時的用曲比例以及改變堆積時間來控制入窖前酒醅的初始糖化酶活力,進而達到控制白酒發酵的目的。

a-淀粉；b-還原糖；c-糖化酶活力；d-酵母數量

2.3 高粱的微觀結構觀察

由圖7所示,在不同條件下高粱碎粒淀粉的微觀結構顯著不同。如圖7-a所示,潤糧前高粱淀粉顆粒立體結構比較完整,呈現橢圓粒狀,表面比較光滑。如圖7-b所示,經過一段時間潤糧,淀粉顆粒吸水膨大,從圖7-b-3與圖7-a-3對比來看,圖7-b-3所示的淀粉顆粒相對更大,立體結構呈圓球狀,淀粉顆粒表面也相對光滑。在經歷蒸煮過程中,膨大的淀粉顆粒因為物理作用糊化破開,原本結構被破壞,形成不規則的蜂窩狀立體結構如圖7-c-2所示,此時一些淀粉變成容易被糖化酶利用的糊精等物質。經過糖化酶的分解作用,容易被分解的物質被分解,形成如圖7-d-2所示的網狀結構,在圖7-d-3可以看到上面由一些明顯可見的橢球形顆粒,根據查閱資料發現酵母菌的常規大小為1～10 μm[23],根據結構和大小合理推測網狀結構上的橢球形小顆粒為發酵前添加的酵母菌。

a-未處理高粱；b-潤糧后高粱；c-蒸煮后高粱；d-發酵后高粱

3 結論與討論

控制原料的蒸煮工藝可以間接控制白酒后續的糖化發酵。通過正交試驗,在優化后的工藝參數下糊化率可達61%,在影響白酒原料蒸煮工藝的條件中,蒸煮時間對糊化率影響最大。實際生產中蒸煮工藝要結合感官評價,不能一味追求糊化率的提高而造成糧食原料蒸煮過后過于發黏。

此外通過對糖化速率的影響因素研究發現,溫度、酸等因素主要是通過影響酶活力對糖化速率產生影響。本實驗研究的糖化酶適宜溫度為40～50 ℃,酸對糖化的影響有兩方面,一方面適量的酸能夠促進原料糊化,另一方面酸會導致糖化酶活力降低影響糖化速率。當發酵原料初始酶活力低于120 U/g,發酵原料的初始酶活力與酒精的最后產量存在顯著相關。在實際生產中,可以通過控溫發酵和選育耐酸性菌株來提高糖化速率和發酵出酒率,還可以通過控制大曲中的產糖化酶菌株的比例、拌曲發酵時的用曲比例以及改變酒醅堆積時間來控制入窖前酒醅的初始糖化酶活力,進而達到控制白酒雙邊發酵的目的。