黃芪提取物抗氧化活性研究

孫 晨，朱 輝，董德濤，孫文棋

(江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212009)

黃芪(RadixAstragali)為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，脫毒排膿，斂瘡生肌等功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有明顯的抗氧化[2-3]、抗心血管疾病[4-5]、免疫調節(jié)[6-7]、抗腫瘤[8-9]等藥理活性，具有廣泛的研究價值和應用前景。本研究較系統(tǒng)的研究了黃芪多糖及各萃取部位的抗氧化活性，并對其抗氧化能力進行比較。

1 材料

1.1 藥材

黃芪，購于甘肅隴西，鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

1.2 儀器

UV-2102紫外可見分光光度計(日本島津)；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)；MP502B電子天平(上海精密科學儀器)；HC-2516高速離心機(科大創(chuàng)新股份)；BuchiR-200型旋轉蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；ALPHA 1-2LD冷凍干燥機(德國Marin Christ公司)；RZ -6真空泵(德國VACUUBRAND公司)；試劑均為分析純。

2 方法

2.1 黃芪多糖的制備

將過藥典2號篩的干燥黃芪粉末適量，加入6倍于藥材質量純化水，水浴回流提取2次，每次2 h，合并濾液并減壓濃縮，得黃芪水提物。取水提物適量，加4倍量95%乙醇，靜置過夜，離心得上清液和醇沉粗多糖。通過sevage法去除粗多糖中蛋白成分，按照粗V(多糖)∶V(氯仿)∶V(正丁醇)=100∶20∶4比例加入氯仿、正丁醇劇烈振遙15min，離心15min，混合液分層，上層為多糖水溶液，取上清后，再按上述方法重復5次，將最后所得上清，加入活性炭超聲并過濾，冷凍干燥得黃芪多糖。苯酚-硫酸法測得多糖純度為68.3%。

2.2 黃芪水提物不同極性部位的制備

將2.1中醇沉上清液減壓濃縮，得黃芪水溶液。將其轉入分液漏斗中，加入相同體積的乙酸乙酯，輕輕振搖，靜置，待溶液完全分層后，放出下層水溶液，收集乙酸乙酯部分；同法再萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮后冷凍干燥，得黃芪水溶液的乙酸乙酯部位。剩余水溶液繼續(xù)用正丁醇萃取，正丁醇和剩余水溶液減壓濃縮，濃縮液冷凍干燥，得正丁醇部位及剩余水部位。

2.3 供試品溶液的制備

分別精密稱取黃芪多糖、黃芪乙酸乙酯部位、黃芪正丁醇部位及剩余水部位物質各25 mg，用去離子水定容至25 mL，乙酸乙酯部位用60%乙醇定容至25ml，得1 mg/mL的供試品溶液，備用。

2.4 陽性對照藥溶液的制備

精密稱取抗壞血酸25mg，用去離子水定容至25 mL，得1 mg/mL的陽性對照藥溶液，備用。

2.5 DPPH自由基清除能力測定

本實驗參照余以剛等[10]的實驗方法，略有改進。分別取黃芪各部位待測液100,200,400,600,800μL于具塞試管中，各自補充蒸餾水至1 mL，加入去離子水溶液2mL，0.1mmo1/L DPPH溶液(精密稱取4mgDPPH，用無水乙醇定容至50mL)1mL ，搖勻，黑暗處靜置30min。用去離子水調零，測定517nm處的吸光度A樣品。測定1mL不同濃度的樣品溶液與3mL 去離子水混合液在517nm處的吸光度A對照，再測定1mL DPPH溶液與3mL 去離子水在517nm處的吸光度A空白。DPPH清除率=[A空白-(A樣品-A 對照)/A空白]×100%。

2.6 總抗氧化能力的測定

參照Prieto等[12]的方法略作修改。分別取黃芪各部位待測液100、200、400、600、800μL于具塞試管中，各自補充去離子水至1 mL，各加3 mL混合液(精密稱取磷酸鈉1.065 g，鉬酸銨0.494 g，用少量去離子水溶解后加濃硫酸3.28 mL，定容于100 mL容量瓶中得)，加塞于95℃水浴中加熱90 min，取出后冷卻至室溫，用去離子水調零，在695 nm處測定吸光度。

2.7 鄰二氮菲-Fe3+法測定抗氧化能力

本實驗參照劉薇等[13]的實驗方法并略有改進。分別取黃芪各部位待測液100、200、400、600、800μL于10mL容量瓶中，各自補充蒸餾水至1 mL，加入1 mL 0.2%氯化高鐵溶液，500 μL 0.5%鄰二氮菲，用60%乙醇定容至10 mL，暗處放置20 min，在510 nm處測定吸光度，用60%乙醇調零。

3 結果與討論

3.1 黃芪各部位清除DPPH能力

由圖1可知，黃芪多糖、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、剩余水部位對DPPH均具有清除能力，且隨著濃度增大，清除能力逐漸增強。以IC50作為評價指標，IC50值越小，抗氧化劑清除自由基的能力越強[15]。由表1可知，黃芪正丁醇部位和多糖清除DPPH自由基的能力相對較強。

表1 黃芪各部位清除DPPH的IC50Tab 1 IC50Value of Scavenging DPPH free radicals activities of astragalus

圖1 黃芪各部位清除DPPH能力比較Fig.1 Scavenging activities of each fraction of astragalus on DPPH free radicals

3.2 黃芪各部位總抗氧化能力

由圖3可知，黃芪多糖及各萃取部位總抗氧化能力：剩余部位>乙酸乙酯部位>乙醇提取物部位>二氯甲烷部位>石油醚部位。在相同的濃度下，剩余部位的總抗氧化性能僅次于Vc。

圖2 黃芪各部位總抗氧化能力比較Fig.2 Comparison of total antioxidant activities of each fraction of astragalus

3.3 鄰二氮菲-Fe3+法測定抗氧化能力

本實驗采用鄰二氮菲-Fe3+法測定黃芪多糖及各萃取部位抗氧化能力，使抗氧化成分直接與反應體系中的Fe3+作用，避開額外產生自由基的影響，提高方法的精密度。由圖4可知，黃芪多糖與黃芪正丁醇部位有較強的抗氧化能力。

圖3 鄰二氮菲-Fe2+法評價黃芪各部位抗氧化能力Fig.3 Comparison of anti-oxidant activity each fraction of astragalus by phenanthroline-ferric ion of assay

綜合發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、剩余水部位抗氧化活性具有較明顯的差異，正丁醇部位和多糖具有較強的抗氧化活性。同時發(fā)現(xiàn)，不同方法之間測得的抗氧化活性基本一致，但研究表明有些體系證明抗氧化活性優(yōu)于Vc，有些體系證明抗氧化活性次于Vc。因此，不能僅憑一種方法就斷定某種成分或部位具有強抗氧化活性，須將多種原理的方法結合起來，才能較為準確的評價藥物抗氧化活性強弱。