多菌發(fā)酵植物源殺菌劑的成分測定及體外抑菌作用

張自平，李市場，龔明貴，張亞娟，白 軼

(1.河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.洛陽市洛龍區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 洛陽 471023)

0 引言

植物源殺菌劑是植物源農(nóng)藥的一種，是利用植物有機體的全部或部分物質(zhì)及其次生代謝物加工而成的制劑，具有環(huán)境相容性好、生物活性多樣、對非靶標物相對安全、不易產(chǎn)生抗藥性和藥效較為緩和等特點[1-2]。近年來，對植物源殺菌劑的研究，主要集中于抑菌植物資源的篩選、抑菌活性成分的鑒定、抑菌機理的研究、植物源殺菌劑的應用和植物內(nèi)有效抑菌成分的提取[3-8]。

由于生產(chǎn)工藝的限制導致植物源殺菌劑的價格高于同類型產(chǎn)品，因此，探究植物活性成分提取工藝的優(yōu)化對植物源殺菌劑的推廣具有重要意義。目前，主要的提取方式為物理萃取法、化學試劑浸泡法和酶解法。文獻[9]對香葉天竺葵采用乙醚、乙醇、索氏和超聲輔助法進行提取，結(jié)果表明4種提取法的提取物都對桃褐腐菌有抑制作用，且乙醚提取物抑菌效果最好。文獻[10]研究了水蒸氣蒸餾法、CO2超臨界流體萃取和固相微萃取法對茜草中的揮發(fā)性成分提取的差異性，其中，CO2超臨界流體萃取得到的提取物抑菌效果最好。文獻[11]采用4種有機溶劑對紫地榆的提取物進行抑菌實驗，發(fā)現(xiàn)正丁醇的熱提物有較好的抑菌活性。但是，目前關(guān)于微生物發(fā)酵生產(chǎn)植物源殺菌劑的研究還少有報道。

為了降低植物源殺菌劑的生產(chǎn)成本，本文通過微生物發(fā)酵的方式，對多種具有抑菌殺菌成分的植物進行多菌發(fā)酵，從而得到具有廣譜抑菌作用的殺菌劑。通過超高效液相色譜串列質(zhì)譜對殺菌劑進行定性和定量分析，得到殺菌劑的主要成分及其相對含量，再測定殺菌劑對病原微生物的抑菌活性，以期得到具有廣泛抑菌能力的發(fā)酵產(chǎn)物。

1 材料和方法

1.1 材料

多菌發(fā)酵植物源殺菌劑(multi-microorganism fermented botanical antimicrobial, FBA)是在10 L發(fā)酵罐中，200 r/min、30 ℃下用魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)液體厭氧發(fā)酵4 d所得。發(fā)酵底物為由紅糖、豆粕、茶粕、桔子(Citrusreticulata)、李子(PrunussalicinaLindl.)、蘋果(Malusdomestica)、辣椒(CapsicumannuumL.)、大蒜(AlliumsativumL.)、苦楝(Meliaazedarach)、印楝(Azadirachtaindica,Camellia)、煙葉(NicotianatabacumL.)、齒葉黃皮(Clausenadunniana)、雷公藤(Tripterygiumwilfordii)、狼毒(StellerachamaejasmeL.)、夾竹桃(NeriumindicumMill)、薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)、三尖杉(CephalotaxusfortuneiHook. f.)、八角(Illiciumverum)和蕓香(RutagraveolensL.)干燥研磨后過80目試驗篩的混料。FBA經(jīng)離心微濾(0.22 μm)處理后儲存?zhèn)溆谩?/p>

甲醛、乙腈和二甲基亞砜等購自西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato dextrose broth, PDB)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(nutrient broth, NB)和水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基(mueller hinton broth, MHB)，購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

供試真菌：黃曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、雜色曲霉(Aspergillusversicolor)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)和尖孢枝孢霉(Cladosporiumoxysporum)由華東師范大學生物工程實驗室提供；尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum, ACCC 31339)、山扁豆生棒孢(Corynesporacassiicola, ACCC 36068)、蘋果鏈格孢(Alternariamali, ACCC 36430)、希金斯炭疽病菌(Colletotrichumhigginsianum, ACCC 37053)、芹菜尾孢(Cercosporaapii, ACCC 37370)、灰葡萄孢(Botrytiscinereal, ACCC 36036)、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum, ACCC 37687)和馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes, ACCC 39138)，購買自中國農(nóng)業(yè)微生物保藏中心。

供試細菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、鼠傷寒沙門菌氏菌(Salmonellatyphimurium)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)，由河南科技大學應用與環(huán)境微生物實驗室提供。

1.2 色譜質(zhì)譜采集條件

數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(SHIMADZU Nexera X2)和串聯(lián)質(zhì)譜(Applied Biosystems 4500 QTRAP)。

液相條件主要包括：①色譜柱：Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；②流動相：A相為超純水(含有體積分數(shù)為0.1%的甲酸)，B相為乙腈(含有體積分數(shù)為0.1%的甲酸)；③洗脫梯度： 0 min B相比例為5%，9.00 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10.00～11.00 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min;④流速0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量4 μL[12]。

質(zhì)譜條件主要包括：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓 5 500 V (正模式)/-4 500 V (負模式)，簾氣(curtain gas, CUR)25 psi，碰撞誘導電離 (collision-activated dissociation，CAD)參數(shù)設置為高。在三重四級桿(QQQ)中，每個離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(declustering potential， DP)和碰撞能 (collision energy，CE)進行掃描檢測[12]。

1.3 殺菌劑成分定性與定量分析

1.4 對細菌的抑菌性

采用96孔板微量肉湯法[14]測定最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations, MIC)。第1孔至第11孔添加190 μL MHB培養(yǎng)基和10 μL在NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期的供試菌液，培養(yǎng)基中FBA體積分數(shù)(VFBA/V總)為0%、1%～20%，第1孔為不含F(xiàn)BA的空白對照，第12孔為只含200 μL MHB培養(yǎng)基的參比調(diào)零孔，每個濃度平行測定3次。此外，對于含有FBA的孔都對應設置一個陰性對照孔(含200 μL對應殺菌劑濃度的MHB培養(yǎng)基)。在供試菌最適生長溫度下培養(yǎng)12 h，用酶標儀測定OD620。以FBA濃度為橫坐標、OD620為縱坐標，曲線拐點為MIC。

1.5 對真菌的抑菌性

采用菌落生長速率法[15]測定FBA的抗真菌活性。將FBA添加到滅菌后冷卻至45 ℃的PDA培養(yǎng)基中，制成抑菌PDA平板，體積分數(shù)(VFBA/V總)為0%～30%，0%為空白對照，每個濃度平行測定3次。取圓形濾紙片(直徑5 mm)置于抑菌PDA平板中心，吸取5 μL孢子懸液(108孢子/mL)滴于濾紙片上，在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃下避光培養(yǎng)。當空白對照中的菌落直徑大于50 mm時，用游標卡尺十字交叉法測量菌落直徑。培養(yǎng)3周后抑菌PDA平板上真菌無生長的體積分數(shù)為MIC。采用文獻[15]的方法計算菌絲體生長抑制率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Analyst 1.6.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，用MultiaQuant軟件進行色譜峰的積分和校正工作。使用GraphPad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)進行分析和作圖。通過概率值換算表將抑制百分率轉(zhuǎn)換為抑制概率值，繪制P-lgC(概率值-濃度對數(shù))回歸曲線并得到毒力回歸方程，計算抑制菌絲體生長的半最大效應濃度(half-maximal effective concentration,EC50)及其相應的95%置信限。EC50值范圍的95%置信限通過菌絲體生長抑制概率值對FBA濃度對數(shù)的最小二乘回歸分析確定。如果95%置信區(qū)間不重疊，則認為EC50值顯著不同。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵成分分析

利用Analyst 1.6.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到MRM成分檢測多峰圖，如圖1所示?；诒镜卮x數(shù)據(jù)庫，對樣本的成分進行了質(zhì)譜定性和定量分析。圖1中MRM成分檢測多峰圖展示了樣本中能夠檢測到的物質(zhì)，每個不同顏色的質(zhì)譜峰代表檢測到的一個成分，其中正離子模式檢測到316種物質(zhì)，負離子模式檢測到282種物質(zhì)。通過三重四級桿篩選出每個物質(zhì)的特征離子，在檢測器中獲得特征離子的信號強度。用MultiaQuant軟件打開樣本下機質(zhì)譜文件，進行質(zhì)譜峰的積分和校正工作，每個質(zhì)譜峰的峰面積代表對應物質(zhì)的相對含量，然后導出所有質(zhì)譜峰面積積分數(shù)據(jù)保存。最終成分分析結(jié)果如表1所示，F(xiàn)BA中主要有10類598種物質(zhì)，其中黃酮類化合物種類最多(146種)，而酚酸類化合物相對含量最高(占比29.38%)，此外有機酸、生物堿和氨基酸也都是主要組成成分。

(a) 正離子模式

由表1可知：黃酮類化合物和酚酸類化合物是最為突出的兩類物質(zhì)，通常集中于植物的葉、果實、根莖、皮和花中，具有多種生物活性如抗氧化、抗微生物、抗病毒和抗腫瘤活性等[16]。這兩類物質(zhì)與發(fā)酵底物原料的組成和微生物發(fā)酵有關(guān)。在選擇發(fā)酵底物時優(yōu)先考慮到底物本身的功能性，選擇黃酮類化合物和酚酸含量較多的原料，如李子、蘋果、洋蔥、辣椒、大蒜和豆粕等；而多菌的混合發(fā)酵可將體系中的大分子通過微生物代謝降解為小分子的次級代謝產(chǎn)物，這也是殺菌劑中有機酸、脂質(zhì)和氨基酸及衍生物的主要來源。此外，為了增加FBA中抑菌物質(zhì)的種類和含量，在底物中添加了苦楝、印楝、雷公藤、狼毒和夾竹桃等植物。鑒于FBA的成分主要為黃酮、酚酸、有機酸和生物堿等，而這些物質(zhì)大都具有抗菌的生物活性[17-19]，因此接下來測定了FBA的體外抑菌作用。

表1 FBA成分分析

2.2 FBA對細菌的抑菌性

FBA對細菌的抑菌性總體呈現(xiàn)先促進后抑制的趨勢，如圖2所示。FBA在體積分數(shù)較低時，對大腸桿菌沒有表現(xiàn)出明顯的促進或抑制作用，對嗜水氣單胞菌有略微的抑制作用，而對副溶血性弧菌、單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌和痢疾志賀氏菌有明顯促進生長的作用；當FBA達到一定體積分數(shù)后，隨著殺菌劑體積分數(shù)的升高，除了副溶血性弧菌外對其他幾株菌的抑制效果明顯。FBA對這幾株菌的MIC皆大于等于10%，其中，大腸桿菌MIC=10%、副溶血性弧菌MIC=18%、單增李斯特菌MIC=14%、鼠傷寒沙門氏菌MIC=10%、嗜水氣單胞菌MIC=12%、痢疾志賀氏菌MIC=10%。

FBA對供試細菌的作用是兩面性的，其最終的抑制效果也是一種復合的體現(xiàn)。由成分分析結(jié)果可知：FBA中含有大量的單糖、氨基酸及衍生物，這些成分都在一定程度上對細菌的生長具有促進作用。研究表明：微生物對混合底物利用的策略為優(yōu)先利用容易吸收轉(zhuǎn)化的小分子營養(yǎng)物質(zhì)[20]，如FBA中的D-葡萄糖、D-果糖和各種氨基酸及衍生物。向培養(yǎng)基中添加FBA時，培養(yǎng)基中的單糖和氨基酸等微生物能直接利用的營養(yǎng)物質(zhì)就會增加，細菌的生長繁殖速度就會相對加快，但與此同時培養(yǎng)基中的抑菌物質(zhì)也會增加。如前所述，F(xiàn)BA中含有大量黃酮類化合物、酚酸、有機酸、鞣酸和生物堿等物質(zhì)，已有研究表明這些物質(zhì)會抑制細菌的生長。如高良姜素對萬古霉素中間型金黃色葡萄球菌(ATCC 25293，N315和Mu50)具有顯著的生長抑制效果[21]；沒食子酸對惡臭假單胞菌具有明顯的抑菌效果(MIC=2.5 mg/mL、MBC=10 mg/mL)，并且沒食子酸在2.5 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/mL下，對惡臭假單胞菌的殺滅時間分別為12 h、6 h和1 h[22]；辣椒堿單體、二氫辣椒堿單體、降二氫辣椒堿單體及辣椒素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉菌均有抑菌效果，其中，辣椒堿單體對供試菌抑菌效果最好，降二氫辣椒堿單體對供試菌抑菌效果最差[23]。此外，F(xiàn)BA中含有的大量有機酸將殺菌劑的pH降到了3.25左右，隨著FBA體積分數(shù)的升高培養(yǎng)基的pH也在下降，當pH不在供試菌最適范圍之內(nèi)時，就會對供試菌的生長產(chǎn)生抑制作用[24]。因此，在低體積分數(shù)時，F(xiàn)BA中的營養(yǎng)物質(zhì)對供試菌生長的促進作用大于抑菌物質(zhì)和pH對供試菌生長的抑制作用；當培養(yǎng)基中FBA體積分數(shù)超過促進和抑制之間的臨界濃度后，抑制作用才大于促進作用。每種供試菌對抑菌物質(zhì)和pH耐受的不同導致了臨界濃度和MIC的不同，而大腸桿菌和嗜水氣單胞菌可能對抑菌物質(zhì)或pH的耐受較低，所以從一開始就沒有出現(xiàn)FBA促進生長的現(xiàn)象。

(a) 大腸桿菌

2.3 FBA對真菌的抑菌性

FBA對13種真菌的菌絲生長具有顯著抑制作用，圖3顯示了不同體積分數(shù)FBA對部分供試真菌的抑制效果。由圖3可以看到：雖不同真菌對FBA的耐受性不同，但隨著FBA體積分數(shù)的升高，抑制作用也在明顯增強。表2為FBA對真菌的抑菌性分析結(jié)果。如表2所示，根據(jù)EC50的顯著性差異將FBA的抑菌效果分為a、b、c、d、e和f共6組。FBA對a、b組的常見腐敗真菌菌絲生長抑制活性較弱，EC50分布在16.37%～19.82%，其中對桔青霉的抑制性最弱(MIC=30%)。與腐敗真菌對FBA耐受性較強形成鮮明對比的是c、d、e和f組的植物病原菌。FBA對9種常見的植物病原真菌菌絲生長具有優(yōu)異的抑制活性，其中對c組的灰葡萄孢、尖孢枝孢霉和尖孢鐮刀菌的抑制性較弱(EC50>8%)，對其余d、e和f組的6株植物病原菌(馬鈴薯炭疽病菌、山扁豆生棒孢、蘋果鏈格孢、希金斯炭疽病菌、禾谷鐮孢和芹菜尾孢)抑制性較強(EC50<5.55%)，其中對f組的芹菜尾孢抑制性最強(EC50=2.74%、MIC=4%)。

表2 FBA對真菌的抑菌性

FBA對真菌并沒有表現(xiàn)出對細菌那樣明顯的生長促進作用，隨著殺菌劑濃度的升高，供試真菌菌絲的生長速度減緩，菌落大小明顯受到不同程度的抑制。事實上，基于本文方法，F(xiàn)BA對真菌的抑制分為兩部分，包括對孢子萌發(fā)的抑制和對菌絲體生長的抑制，因此這里的EC50實際上指的是FBA對菌絲體生長抑制的半最大效應濃度，而MIC實際上指的是FBA對孢子萌發(fā)抑制的最低濃度。從實驗結(jié)果來看，F(xiàn)BA對菌絲體生長和孢子萌發(fā)的抑制具有一致性，對菌絲體抑制效果強的也對孢子萌發(fā)抑制效果理想，因此可以認為供試菌的菌絲體和孢子對FBA具有相似的耐受性，此外，F(xiàn)BA對供試的植物病原菌的抑菌活性尤為出色，這是因為殺菌劑中含有大量的酚酸、黃酮和生物堿等物質(zhì)[25-27]。

(a) 黑曲霉

3 結(jié)論

(1)FBA的成分中共有598種物質(zhì)，其中黃酮146種、有機酸83種、酚酸82種、氨基酸75種、生物堿60種、脂質(zhì)35種、木脂素和香豆素21種、鞣酸10種、萜類10種；此外，還有76種其他類物質(zhì)，如低級糖和維生素等。

(2)FBA對供試細菌的影響具有兩面性。當FBA體積分數(shù)≤5%時，對鼠傷寒沙門氏菌和痢疾志賀氏菌具有生長促進作用；5%

(3)FBA對黑曲霉、黃曲霉、雜色曲霉和桔青霉等腐敗真菌的抑菌能力較差，EC50分別為16.37%、19.82%、17.54%和17.82%，MIC分別為26%、26%、22%和30%。FBA對植物病原菌的抑菌效果根據(jù)EC50的顯著性差異分為4組(c、d、e和f)：c組對灰葡萄孢、尖孢枝孢霉和尖孢鐮刀菌的EC50分別為8.60%、8.87%和8.64%，MIC分別為14%、12%和13%；d組對馬鈴薯炭疽病菌的EC50和MIC分別為5.53%和10%；e組對山扁豆生棒孢、蘋果鏈格孢、希金斯炭疽病菌和禾谷鐮孢的EC50分別為3.45%、4.04%、3.78%和3.67%，MIC分別為8%、7%、5%和8%；f組對芹菜尾孢的EC50和MIC分別為2.74%和4%。