微波對沒食子酸和PPO相互作用特性的影響

候增超，原江鋒,1b,2，賴鈺婷，王大紅,1b,2，龔明貴,2，張 彬,2

(1.河南科技大學 a.食品與生物工程學院;b.微生物資源開發與利用重點實驗室,河南 洛陽 471023；2.東部戰區總醫院藥理科，江蘇 南京 210002)

0 引言

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)的酶促反應是加工產品貯存過程中引起褐變的主因之一[1]。一系列的不利變化不僅使加工產品品質劣變，而且酚類化合物的氧化褐變導致營養物質的生物利用度降低，因此，有效抑制PPO活性對于延緩酶促褐變和提高加工產品品質是一種非常有效的途徑[2]。對于PPO的鈍化和抑制一直是研究的關注點[3-8]。

多酚是植物體內的次級代謝產物，已受到國內外不同領域學者的廣泛關注[9]。文獻[10]研究表明：多酚類化合物如沒食子酸在PPO的作用下能夠氧化成醌類化合物，醌再經非酶促聚合發生褐變，影響加工產品的品質和多酚的生物利用率。沒食子酸作為一種廣泛應用的多酚類化合物，近年來一直是研究的重點[11-12]。因此，研究加工產品體系中多酚與PPO之間的相互作用，對于提高加工產品多酚的生物利用率，以及含多酚食品的加工顯得尤為重要。文獻[13]研究了微波場對蛋白質品質、結構以及功能等方面的影響，但微波對于加工產品中PPO活性的影響以及微波對酚酸類化合物和PPO混合體系的影響尚無文獻報道。

本文以微波輻射作為抑制和鈍化PPO的技術手段，分析不同沒食子酸濃度、pH和溫度對PPO體系中PPO活性的影響，同時研究沒食子酸對PPO酶學性質的影響，并且進一步研究不同微波功率對沒食子酸和PPO體系特性的影響。本研究可為進一步探究微波輻射對PPO抑制機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

多酚氧化酶(>600 U/mg)購于安徽酷爾生物有限責任公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和鄰苯二酚為分析純，購于天津市德恩化學試劑有限公司；沒食子酸購于天津市大茂化學試劑廠。

XH-MC-1型實驗室微波合成儀，北京祥鵠科技發展有限公司；Agilent Cary Eclips型熒光分光光度計，安捷倫科技有限公司；L5S型紫外分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；STARTER 3100型pH計，上海奧豪斯儀器有限公司；HH-SA型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 儲備液的配制

用濃度為50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH6.8)將PPO溶解，配成濃度為0.007 8 mmol/L的PPO溶液。稱取不同質量的沒食子酸分別溶解于50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH6.8)中，配制成濃度分別為0.078 mmol/L、0.118 mmol/L、0.234 mmol/L、0.312 mmol/L和0.390 mmol/L的沒食子酸溶液，備用。

1.2.2 PPO活性的測定

PPO活性的測定參照文獻[14]的方法，并略有修改。將0.2 mL、2 mmol/L的鄰苯二酚溶液和2.7 mL、50 mmol/L、pH6.8的磷酸緩沖溶液混合作為反應底物，提前將底物溶液置于37 ℃恒溫水浴15 min。將反應底物分別與0.1 mL沒食子酸和PPO溶液快速混合，立即在420 nm測定吸光度，5 min后再次測定其吸光度。酶活力的定義：單位時間內，每毫升酶液吸光度變化0.001定義為1個酶活力單位。

1.2.3 不同濃度沒食子酸對PPO活性的影響

室溫下，對沒食子酸與PPO的濃度比分別為0、10、15、30、40和50的溶液分別進行PPO活性測定，測定方法同1.2.2。混合后，PPO終濃度為0.003 9 mmol/L，沒食子酸終濃度分別為0.039 mmol/L、0.059 mmol/L、0.117 mmol/L、0.156 mmol/L和0.195 mmol/L。

1.2.4 不同pH對沒食子酸與PPO體系酶活性的影響

室溫下，選取沒食子酸與PPO濃度比為50的體系，分別配制pH為5.7、6.0、6.5、6.8、7.2和7.4的磷酸緩沖液(50 mmol/L)，按1.2.2方法測定活性，空白對照為對應pH的磷酸緩沖液。

1.2.5 不同溫度對沒食子酸與PPO體系酶活性的影響

室溫下，選取沒食子酸與PPO濃度比為50、pH6.8的體系，分別在溫度20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃，水浴20 min，按1.2.2方法測定活性。

1.2.6 沒食子酸與PPO體系中淬滅類型、結合常數、結合位點和熱力學參數的計算

取不同濃度沒食子酸與PPO混合溶液體系的儲備液，分別在25 ℃和35 ℃下靜置反應2 h。然后檢測各混合溶液體系的熒光光譜。熒光光譜的儀器參數：激發波長λex為280 nm，激發與發射狹縫寬度均為10 nm，電壓為600 V，發射波長λem為290～450 nm。PPO的熒光淬滅過程使用Stern-Volmer方程[15]分析。對于靜態淬滅，當生物小分子與大分子相結合時，結合常數Ka與結合位點數n通過Lineweaver-Burk雙對數方程進行計算[16]。

生物大分子和小分子之間的相互作用力包括4種，分別為疏水作用力、靜電作用、氫鍵和范德華力。如果焓變在測定溫度范圍內變化不大，則沒食子酸與PPO相互作用過程中的焓變(△H)、熵變(△S)和吉布斯自由能(△G)，可使用Van’t-Hoff方程計算[17]。

1.2.7 熒光光譜分析

取不同濃度沒食子酸與PPO混合溶液體系的儲備液，分別在25 ℃和35 ℃下反應2 h，分別測定混合物體系的熒光光譜。微波處理條件：取沒食子酸與PPO濃度比為50的混合溶液，分別在微波功率100 W、300 W、500 W、700 W和900 W(50 ℃，8 min)下測定微波處理后混合液的熒光光譜。測定熒光光譜設定的儀器參數：激發波長λex為280 nm，激發和發射狹縫寬度均為10 nm，發射波長λem為290～450 nm；同步熒光激發波長掃描范圍為260～310 nm；三維熒光掃描模式為3-D Scan，激發波長λex為250～450 nm，發射波長λem為250～450 nm，激發和發射狹縫均為10 nm，掃描速率為120 nm/min。

1.2.8 紫外吸收光譜分析

使用沒食子酸與PPO的濃度比為0、10、15、30、40和50的混合溶液，室溫下靜置反應2 h；取沒食子酸與PPO濃度比為50的混合溶液體系，分別在微波功率100 W、300 W、500 W、700 W和900 W(50 ℃，8 min)下進行處理，在波長265～315 nm掃描各混合物紫外吸收光譜。

1.2.9 不同微波功率對沒食子酸與PPO體系中酶活性的影響

取沒食子酸與PPO濃度比為50的混合溶液，分別在微波功率100 W、300 W、500 W、700 W和900 W(50 ℃，8 min)下進行處理。按1.2.2方法測定酶活性。

1.2.10 不同微波功率對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除的影響

參照文獻[18]的方法，并略有變動。取沒食子酸與PPO濃度比為50的混合溶液，分別在微波功率100 W、300 W、500 W、700 W和900 W(50 ℃，8 min)下進行處理，然后分別取微波處理后的混合溶液1 mL，加入0.004% DPPH溶液3 mL，充分混勻，避光靜置30 min后，以甲醇為空白對照，于517 nm波長處測吸光度。

1.2.11 數據分析及處理

每個試驗均重復3次，使用SPSS軟件分析。采用Orign 2017軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸與PPO體系酶學性質

2.1.1 不同濃度沒食子酸對PPO活性的影響

沒食子酸對PPO活性的影響如圖1a所示，隨著沒食子酸濃度的增加，PPO的活性不斷下降。當沒食子酸與PPO濃度比為10時，PPO活性降低為原酶活性的84.8%；而當沒食子酸與PPO濃度比為50時，PPO活性降低為原酶活性的58.5%。沒食子酸與PPO濃度比為50時，沒食子酸的濃度是0.195 mmol/L，溶于pH6.8磷酸緩沖液溶液中，此時磷酸緩沖液溶液的pH值為6.5，對溶液體系的pH影響不大，可以忽略不計。因此，造成PPO活性變化的原因，可能是由于沒食子酸對PPO活性中心的螯合作用引起的。文獻[14]也報道了不同濃度檸檬酸對PPO活性具有較強的抑制作用。

2.1.2 不同pH對沒食子酸和PPO體系酶活性的影響

pH值是影響酶催化的重要因素，過高和過低的pH值會影響酶的構象，致使酶變性失活。由圖1b可知：PPO活性對pH值較為敏感，在pH5.7～7.4時，PPO的活性呈現先上升后下降的趨勢，且pH值在6.8時，PPO活性最大。pH值過高或者過低，活性反應速率下降，說明可以通過調節富含PPO的溶液pH來抑制PPO的活性，從而達到控制體系中由于PPO的存在而引起的酶促褐變。PPO催化沒食子酸發生酶促反應，最適宜pH為6.8。文獻[19]報道蘑菇中PPO最適pH值為7.0，這與本試驗結果基本一致。

2.1.3 不同溫度對沒食子酸和PPO體系酶活性的影響

為了研究沒食子酸和PPO體系中溫度對PPO活性的影響，選取溫度為20～70 ℃，測定沒食子酸和PPO體系中PPO活性。如圖1c所示，PPO活性隨著溫度的升高，呈現先上升后下降的趨勢，溫度較低時，PPO活性較小，可見低溫有利于抑制PPO活性；當溫度升高到50 ℃時，PPO的活性達到最大；當溫度>50 ℃時，活性逐漸降低，而70 ℃時活性幾乎完全喪失，這可能是因為過高的溫度導致PPO變性，從而嚴重影響PPO的活性。這與文獻[20]的研究結果基本一致，即在70 ℃時酶活性幾乎完全喪失。因此，低溫和較高的溫度可以抑制PPO活性。

(a) 沒食子酸 (b) pH (c) 溫度

2.1.4 內源熒光光譜和淬滅類型確定

PPO分子中含有色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等一系列可以發射內源熒光的氨基酸殘基，因此，可以通過內源熒光的變化來反映沒食子酸與PPO之間的相互作用以及沒食子酸所引起PPO的構象變化。圖2為沒食子酸處理PPO的熒光光譜和Stern-Volmer圖。圖2a中，A→F線表示曲線所對應的沒食子酸與PPO濃度比分別為0、10、15、30、40、50的變化方向。由圖2a可知：隨著沒食子酸濃度的增加，熒光發射強度逐漸降低，表明沒食子酸的加入使PPO發生酶促氧化，并且使PPO發生熒光淬滅。圖2b為沒食子酸與PPO相互作用的內源熒光光譜與Stern-Volmer方程擬合圖。圖2b中，F0為未加入沒食子酸時PPO的熒光強度；F為加入不同濃度沒食子酸時PPO的熒光強度；Q為沒食子酸的濃度，mmol/L。不同處理條件對PPO活性的影響見表1。從表1可以看出：在沒食子酸與PPO的相互作用過程中，擬合后的R2均為0.98，表明F0/F與Q之間呈現良好線性關系且斜率為正值，故沒食子酸與PPO是靜態淬滅機制；并且隨著處理溫度的升高，淬滅常數KSV值卻隨之下降，25 ℃和35 ℃時PPO淬滅速率常數Kq分別為8.7×1011和4.6×1011，淬滅常數隨著溫度的升高而下降[21]，且均遠高于2×1010，進一步表明沒食子酸對PPO的淬滅機制為靜態淬滅。

(a) 內源熒光發射光譜 (b) Stern-Volmer方程擬合圖

表1 沒食子酸與PPO相互作用的Stern-Volmer常數

2.1.5 沒食子酸與PPO相互作用的結合常數和結合位點數

沒食子酸和PPO相互作用的結合常數(Ka)及結合位點數(n)見表2。沒食子酸和PPO之間存在較強的結合力，并且隨著溫度的升高，Ka隨之增大。結合位點數n分別為1.398和1.714，結合位點數n接近2，說明沒食子酸與PPO大約有2個結合位點數，n伴隨溫度的升高有一定的改變，說明溫度的升高對結合位點數有一定影響。沒食子酸與PPO作用的結合常數Ka均遠大于104數量級，表明沒食子酸和PPO具有較強的相互作用。

表2 沒食子酸和PPO相互作用的結合常數

2.1.6 沒食子酸和PPO相互作用的熱力學參數和作用力類型的分析

小分子化合物與蛋白質的相互作用模式和作用力類型，可以用熱力學參數(如△H、△S和△G)來指示。當△H>0且△S>0時，主要作用力為疏水作用力；當△H<0且△S>0時，靜電引力起主要作用；當△H<0且△S<0時，氫鍵和范德華力起主要作用；反應過程中，當△G<0，則表明反應是自發進行[17]。沒食子酸與PPO相互作用的熱力學參數見表3。由表3可知：沒食子酸和PPO相互作用后，△H>0，△S>0且△G<0，說明沒食子酸和PPO反應是自發進行的，并且主要作用力為疏水作用力。

表3 沒食子酸與PPO相互作用的熱力學參數

2.2 微波對沒食子酸和PPO相互作用的紫外吸收光譜

沒食子酸和PPO相互作用的紫外吸收光譜如圖3a所示，A→F線表示沒食子酸濃度變化的方向，隨著沒食子酸的加入，PPO的吸收峰強度增高。在不添加沒食子酸的情況下，285 nm是PPO的特征吸收峰。隨著沒食子酸溶液濃度的升高，PPO的吸光度逐漸增加，但是特征吸收峰的位置未改變。由此可見，沒食子酸的加入會與PPO發生酶促氧化，并且使PPO內部暴露了疏水性的酪氨酸與色氨酸殘基，致使吸光度增強。

圖3b為經過不同微波功率處理后PPO和沒食子酸的相互作用紫外光譜。在100～700 W時，沒食子酸和PPO體系的紫外吸光度逐步增加，這可能是由于微波處理后，部分色氨酸和酪氨酸殘基在親水環境暴露導致；而在用900 W處理后紫外吸收強度降低，這可能是由于部分去折疊化的PPO分子在較高的微波功率下又發生了團聚，結果使部分暴露于較為親水環境的色氨酸和酪氨酸殘基又被包埋入疏水環境中。文獻[22]研究也發現蛋白質的紫外光譜和分子折疊結構相關，去折疊可以引起紫外吸收強度的降低。紫外吸收光譜表明，不同微波功率處理PPO和沒食子酸體系通過影響PPO結構，進而影響PPO和沒食子酸體系中酶促氧化。

(a) 不同沒食子酸濃度處理 (b) 不同微波功率處理

2.3 微波對沒食子酸和PPO相互作用的熒光光譜分析

蛋白質的內源熒光是由其內部色氨酸和酪氨酸殘基激發產生的，因此，可以通過內源熒光的變化來反映PPO與沒食子酸之間的酶促反應以及PPO構象的變化。沒食子酸和PPO相互作用熒光光譜分析見圖4。圖4a中，隨著沒食子酸濃度的增加，內源性熒光發射強度逐漸降低，表明隨著沒食子酸的加入，PPO發生熒光淬滅。熒光團附近的分子微環境可以用同步熒光光譜來指示。如果將激發與發射波長之間的差值Δλ設置成15 nm與60 nm，則得到的同步熒光光譜分別表示蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的光譜特征[23]，所以可以用來辨別蛋白質構象變化的情況。如圖4b和圖4c所示，當Δλ=15 nm以及Δλ=60 nm時，隨著沒食子酸濃度的增加，PPO的特征吸收峰降低，并且最大發射波長并沒有發生明顯改變，說明沒食子酸并沒有使酪氨酸殘基與色氨酸殘基周圍極性改變，但是通過內源性熒光和同步熒光的改變，證明沒食子酸使PPO構象和微環境發生變化，可能是由于沒食子酸使PPO的其他氨基酸殘基的微環境發生改變造成的。

不同微波功率處理PPO與沒食子酸體系的熒光光譜如圖4d所示，在100～700 W時，熒光強度隨微波處理功率的增加從125降低到90，這種現象可能是由于PPO結構的展開和芳香族氨基酸在微波輻照后，暴露于強極性水溶液中而又被包埋入疏水環境中所致。經微波處理后，內源性熒光光譜顯示沒食子酸與PPO混合溶液的特征吸收峰從348 nm紅移至356 nm，表明微波輻射能夠影響PPO構象，進而影響到PPO和沒食子酸體系中酶促氧化。

(a) 不同濃度沒食子酸處理PPO (b) 同步熒光光譜(Δλ=15 nm)

三維熒光光譜可以準確有效地檢驗蛋白質結構與微環境的改變。圖5a與圖5b分別為PPO和沒食子酸以及PPO體系的濃度比為30時的三維熒光光譜。這兩個體系中都含有“山脊”峰(峰A)，也就是存在特征為Δλem=Δλex的瑞利散射[24]。如圖5a所示，峰B在Δλem=348 nm處出現，這是由PPO中氨基酸的π-π*躍遷所造成的。圖5b中峰B的熒光強度顯著降低且λem發生輕微藍移，表明PPO的結構和周圍微環境發生變化，這與同步熒光光譜的結果相對應。

(a) PPO的三維熒光 (b) 沒食子酸與PPO結合的三維熒光

2.4 微波功率對沒食子酸和PPO體系中PPO活性的影響

不同微波功率對PPO活性的影響如表4所示，隨著微波功率的增加，PPO的活性逐步降低。與未經微波處理的PPO活性相比，100～300 W PPO活性升高，這可能是由于低功率微波下體系溫度起主要作用，處于最合適溫度下的PPO高于未經處理的PPO活性；隨著微波功率的升高，微波功率起主導作用，過高的微波功率影響PPO的構象，從而使PPO活性逐步降低。文獻[25]也報道了高功率微波輻射使牛蒡PPO的活性降低的現象。綜上可知，低的微波功率對沒食子酸和PPO體系中PPO活性有一定的促進作用，而高微波功率能夠鈍化沒食子酸和PPO體系中PPO的活性。

表4 微波功率對沒食子酸與PPO體系PPO活性和DPPH清除的影響

2.5 微波功率對沒食子酸和PPO體系中清除DPPH自由基的影響

DPPH自由基是一種化學性質較為穩定的自由基[18]。由表4可知：沒食子酸和PPO體系對DPPH自由基具有一定的清除能力，并且隨著微波功率的增加，清除DPPH自由基能力逐步增強。可能是由于沒食子酸和PPO體系中沒食子酸具有清除DPPH自由基能力，并且體系中PPO具有酶促氧化沒食子酸的能力。經微波處理，體系中PPO構象發生改變，活性受到影響，因此使部分沒食子酸沒有發生酶促氧化，進而具有一定的清除DPPH自由基的能力；隨著微波功率的增加，PPO的活性受到較大的影響，因此更多的沒食子酸不發生酶促氧化，故顯示出逐步增高的DPPH自由基清除能力。

3 結論

(1)沒食子酸與PPO濃度比為50時PPO活性最強，最適pH為6.8，最適溫度為50 ℃。

(2)沒食子酸與PPO通過靜態淬滅機制使PPO熒光淬滅，并且相互作用的主要方式為疏水作用，沒食子酸與PPO反應是自發進行的；沒食子酸與PPO的結合導致PPO構象、微環境發生改變。

(3)不同微波功率輻射對沒食子酸和PPO的相互作用有一定的影響，觀察到規律的構象變化，這可能是微波導致PPO活性變化的原因。高功率微波處理可能是一種潛在的鈍化PPO、防止酚類化合物的氧化褐變的條件。

(4)微波輻射技術是提高加工產品多酚類物質的生物利用性的有效途徑，并將這種技術應用于鈍化PPO，從而提高多酚類加工產品的品質，具有重要的指導意義。