4種重金屬離子對菲律賓蛤仔的急性毒性及安全評價

陳 志，魏成陳，胡豐曉，黃 健，李偉鵬，連晨陽

( 1.福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)，福建 福州 350002； 3.福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建 福州 350002 )

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)，屬軟體動物門、瓣鰓綱、簾蛤目、簾蛤科、蛤仔屬，俗稱花蛤、蛤仔、蛤蜊、沙蜆子等，為廣溫廣鹽性貝類，廣泛分布于我國沿海地區(qū)。因其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，加工方法多樣，一直深受廣大消費(fèi)者的喜愛[1]。加之其具有生長迅速、移動性差、適應(yīng)力強(qiáng)、養(yǎng)殖方法簡單、生產(chǎn)周期短、投資少、收益大等特點(diǎn)，成為我國灘涂貝類養(yǎng)殖的重要對象，與縊蟶(Sinonovaculaconstricta)、牡蠣和泥蚶(Tegillarcagranosa)一起被稱為我國傳統(tǒng)的“四大養(yǎng)殖貝類”[2]。

近年來，隨著我國沿海城市經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，沿海工業(yè)、農(nóng)業(yè)以及各種人類活動所產(chǎn)生的污染物排放入海，導(dǎo)致沿海海域環(huán)境污染程度日益加劇，尤其以海洋重金屬污染問題尤為嚴(yán)重。重金屬污染物具有分布范圍廣、殘留時間久、存在多形態(tài)間轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，并可以通過食物鏈的逐級放大，在生物體內(nèi)成千倍地富集，通過食物鏈的傳遞最終危及人類健康乃至生命安全[3-6]。

目前，有關(guān)重金屬對菲律賓蛤仔的富集作用[7-8]和菲律賓蛤仔養(yǎng)殖水體中重金屬安全限量[9-10]等方面的研究較多，但有關(guān)重金屬對菲律賓蛤仔的急性毒性研究較少。因此，筆者主要使用Cd2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+對菲律賓蛤仔進(jìn)行急性毒性試驗，探究菲律賓蛤仔對上述4種金屬離子脅迫的敏感性，以期正確評價4種重金屬對菲律賓蛤仔的毒性效應(yīng)，為菲律賓蛤仔的安全生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用菲律賓蛤仔選購自福清市三山鎮(zhèn)養(yǎng)殖海區(qū)，平均殼長(3.13±0.22) cm，平均殼寬(2.09±0.15) cm，平均濕質(zhì)量(6.32±1.07) g，試驗容器選用34 cm×22 cm×21 cm的半透明塑料箱。試驗前，先將菲律賓蛤仔暫養(yǎng)于塑料桶內(nèi)，測得暫養(yǎng)期間水溫24～25 ℃，鹽度26.5～27.0，持續(xù)充氣并投喂適量叉鞭金藻(Dicrateriainornate)，6 h后開始試驗。試驗開始前停食，直至試驗結(jié)束。

1.2 試驗試劑

試驗選用的4種試劑均為分析純：硫酸鎘(CdSO4·8/3H2O≥99.0%，西隴化工股份有限公司)、一水合硫酸錳(MnSO4·H2O≥99.0%，西隴科學(xué)股份有限公司)、七水合硫酸鋅(ZnSO4·7H2O≥99.5%，西隴科學(xué)股份有限公司)、硫酸銅(CuSO4·5H2O≥99.0%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，試劑在使用前均先配制成一定質(zhì)量濃度的母液，所配Cd2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+的母液質(zhì)量濃度分別為1000、5000、1000、100 mg/L，使用前用脫脂棉過濾的海水按比例稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 試驗方法

試驗用海水經(jīng)過充分曝氣，每個試驗容器注入5 L試驗海水，試驗期間水溫24～26 ℃，鹽度27.0～27.5，溶解氧5.00～5.62 mg/L，pH 7.66～7.75；采用靜水試驗法，首先進(jìn)行預(yù)試驗，以初步確定4種金屬離子對菲律賓蛤仔的最小致死質(zhì)量濃度和不引起死亡的最大安全質(zhì)量濃度，根據(jù)等比數(shù)列和等對數(shù)間距法設(shè)置5個質(zhì)量濃度組、1個對照組。經(jīng)預(yù)試驗，Cd2+試驗質(zhì)量濃度設(shè)為0.91、2.14、5.00、11.70、27.39 mg/L；Mn2+試驗質(zhì)量濃度設(shè)為50.00、88.91、158.11、281.17、500.00 mg/L；Zn2+試驗質(zhì)量濃度設(shè)為4.79、9.72、20.00、40.90、83.64 mg/L；Cu2+試驗質(zhì)量濃度設(shè)為0.10、0.38、1.41、5.31、20.00 mg/L。正式試驗每個質(zhì)量濃度設(shè)置3組平行和1個空白對照組，每個試驗組隨機(jī)放入10個菲律賓蛤仔。

正式試驗期間不充氣、不投餌，以保持試驗容器內(nèi)重金屬離子相對穩(wěn)定的質(zhì)量濃度與分布狀態(tài)。試驗開始后，連續(xù)12 h觀察并記錄試驗菲律賓蛤仔的健康狀況，及時清除死亡個體并計算死亡率。之后每隔24 h觀察并記錄菲律賓蛤仔的活動情況和死亡數(shù)量，試驗持續(xù)96 h。判定菲律賓蛤仔死亡的依據(jù)為：菲律賓蛤仔殼口大開，內(nèi)臟團(tuán)全部暴露于水中，或者貝殼微張，少數(shù)將水管末端或部分斧足伸出殼外，斧足僵硬，用玻璃棒多次刺激其軟體部及貝殼皆無收縮反應(yīng)和閉殼現(xiàn)象時，即判定為死亡。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2010軟件進(jìn)行處理，利用SPSS 19.0軟件的Probit模塊計算4種重金屬離子對菲律賓蛤仔的半致死質(zhì)量濃度(LC50)和95%置信區(qū)間。安全質(zhì)量濃度(SC)的計算公式如下[11]：

SC=96 h LC50×0.01

2 結(jié) 果

2.1 菲律賓蛤仔中毒癥狀

24 h內(nèi)，4種重金屬低質(zhì)量濃度組絕大多數(shù)外殼張開，水管和斧足均伸出，水管過濾水體正常，受到外來刺激時反應(yīng)迅速，水管和斧足均能迅速縮回殼內(nèi)，并快速閉殼，與空白對照組活動無明顯差異；高質(zhì)量濃度組菲律賓蛤仔大部分雙殼緊閉，極個別個體雙殼微微張開，但水管和斧足均不露出。48 h內(nèi)，各試驗組菲律賓蛤仔多數(shù)表現(xiàn)為雙殼緊閉，僅少數(shù)個體水管和斧足微微露出，外界刺激個體反應(yīng)遲鈍，水管和斧足無法立即縮回殼內(nèi)，而對照組各受試菲律賓蛤仔水管與斧足均能伸出，活力良好。72～96 h，各質(zhì)量濃度組菲律賓蛤仔的外殼逐漸張開，少數(shù)將部分斧足暴露于殼外，肉質(zhì)僵硬，受外界刺激時無反應(yīng)，失去生命特征。4種重金屬離子對菲律賓蛤仔均呈現(xiàn)出不同程度的毒害作用，雖然中毒癥狀出現(xiàn)的時間有差異，但菲律賓蛤仔的中毒癥狀基本相似，且均表現(xiàn)為重金屬質(zhì)量濃度越高，受試時間越長，對菲律賓蛤仔的毒性越強(qiáng)，死亡率越高，表現(xiàn)出明顯的時間—效應(yīng)關(guān)系。

2.2 Cd2+對菲律賓蛤仔急性毒性的影響

24 h內(nèi)，各質(zhì)量濃度試驗組的死亡率均不超過20%(圖1)；48 h內(nèi)，各質(zhì)量濃度試驗組均出現(xiàn)死亡個體，最高質(zhì)量濃度組(27.39 mg/L)死亡率達(dá)40%，48 h內(nèi)菲律賓蛤仔對Cd2+表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性；隨著受試時間的增加，菲律賓蛤仔的死亡率隨Cd2+質(zhì)量濃度的升高呈線性上升趨勢。72 h后死亡率大幅增加；96 h最高質(zhì)量濃度組(27.39 mg/L)死亡率達(dá)到100%。Cd2+對菲律賓蛤仔24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為38.62、29.83、8.11、2.67 mg/L，96 h安全質(zhì)量濃度為0.03 mg/L(表1)。

圖1 Cd2+質(zhì)量濃度對菲律賓蛤仔急性中毒死亡率的影響Fig.1 Effect of Cd2+ on mortality of Manila clam R. philippinarum in acute toxicity test

2.3 Mn2+對菲律賓蛤仔的急性毒性影響

在24 h內(nèi)，各質(zhì)量濃度試驗組的死亡率不超過20%(圖2)；在48 h之內(nèi)，各質(zhì)量濃度試驗組死亡率均有所升高，最高質(zhì)量濃度組(500.00 mg/L)死亡率達(dá)60%；菲律賓蛤仔的死亡率隨Mn2+質(zhì)量濃度的升高呈線性上升趨勢，72 h后死亡率大幅上升；96 h各質(zhì)量濃度組死亡率進(jìn)一步升高，最高質(zhì)量濃度組(500.00 mg/L)死亡率接近100%，但死亡率增長幅度相較于72 h有所放緩，增長幅度不大，表明菲律賓蛤仔在經(jīng)過一段時間的適應(yīng)之后，對Mn2+表現(xiàn)出一定強(qiáng)度的適應(yīng)性。Mn2+對菲律賓蛤仔24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為712.58、421.57、188.74、61.27 mg/L，96 h安全質(zhì)量濃度為0.61 mg/L(表2)。

表1 Cd2+對菲律賓蛤仔不同暴露時間的半致死質(zhì)量濃度

圖2 Mn2+質(zhì)量濃度對菲律賓蛤仔急性中毒死亡率的影響Fig.2 Effect of Mn 2+ on mortality of Manila clam R. philippinarum in acute toxicity test

表2 Mn2+對菲律賓蛤仔不同暴露時間的半致死質(zhì)量濃度

2.4 Zn2+對菲律賓蛤仔的急性毒性影響

在24 h之內(nèi)，各質(zhì)量濃度試驗組的死亡率均不超過10%(圖3)；在48 h之內(nèi)，各質(zhì)量濃度試驗組均出現(xiàn)了死亡個體，最高質(zhì)量濃度組(83.64 mg/L)死亡率接近60%；隨著受試時間的推移菲律賓蛤仔的死亡率隨著Zn2+質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)逐級升高的趨勢。72 h后死亡率雖大幅增加，但高質(zhì)量濃度試驗組死亡率的漲幅明顯高于低質(zhì)量濃度試驗組，表明菲律賓蛤仔對低質(zhì)量濃度的Zn2+有一定的耐受性；96 h最高質(zhì)量濃度組(83.64 mg/L)死亡率達(dá)到100%。由表3可知，Zn2+對菲律賓蛤仔24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為141.27、72.20、34.91、21.57 mg/L，96 h安全質(zhì)量濃度為0.22 mg/L。

圖3 Zn2+質(zhì)量濃度對菲律賓蛤仔急性中毒死亡率的影響Fig.3 Effect of Zn 2+ on mortality of Manila clam R. philippinarum in acute toxicity test

表3 Zn2+對菲律賓蛤仔不同暴露時間的半致死質(zhì)量濃度

2.5 Cu2+對菲律賓蛤仔的急性毒性影響

在24 h內(nèi)，各質(zhì)量濃度試驗組的死亡率均不超過20%(圖4)；在48 h之內(nèi)，各質(zhì)量濃度試驗組的死亡率急劇升高，最高質(zhì)量濃度組(20 mg/L)死亡率達(dá)到70%，表明菲律賓蛤仔對Cu2+的敏感性較強(qiáng)，耐受性較弱；隨著受試時間的推移菲律賓蛤仔的死亡率隨著Cu2+質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)出逐級遞增的趨勢，72 h后死亡率仍大幅上升；96 h最高質(zhì)量濃度組(20 mg/L)死亡率達(dá)到100%。由表4可知，Cu2+對菲律賓蛤仔24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為29.88、12.06、3.62、0.79 mg/L，96 h安全質(zhì)量濃度為0.01 mg/L。

圖4 Cu2+質(zhì)量濃度對菲律賓蛤仔急性中毒死亡率的影響Fig.4 Effect of Cu 2+ on mortality of Manila clam R. philippinarum in acute toxicity test

表4 Cu2+對菲律賓蛤仔不同暴露時間的半致死質(zhì)量濃度

3 討 論

3.1 4種重金屬對菲律賓蛤仔的致毒機(jī)理及毒性強(qiáng)度評價

Cd2+可與含氨基、羧基、巰基的蛋白分子結(jié)合，導(dǎo)致不同酶類的活性受到抑制，酶中的Zn2+被Cd2+置換后將失去活性，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)的分解和再吸收減少，對細(xì)胞正常的生理功能和代謝產(chǎn)生負(fù)面影響[12]，這可能是Cd2+對某些海洋生物毒性大于Zn2+的原因[13-14]。Mn是水生動物正常生長發(fā)育必不可少的微量元素，不僅參與體內(nèi)各種酶的化學(xué)組成，也是許多酶的激活劑，對水生動物的生長、免疫和抗應(yīng)激都有十分重要的影響[15]。唐婉琴等[16]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)草魚(Ctenopharyngodonidellus)暴露在一定質(zhì)量濃度范圍Mn水體中，其靜止代謝率會出現(xiàn)相應(yīng)的升高以滿足機(jī)體解毒時額外的能量需求，而高質(zhì)量濃度的Mn暴露則會損傷魚體并降低魚體的靜止代謝率。目前，關(guān)于Mn對水產(chǎn)動物生長發(fā)育影響的作用機(jī)制研究仍處于起步階段，主要是通過飼料中Mn的添加量來對魚類[17-18]和蝦類[19-20]的生理機(jī)能與免疫進(jìn)行研究，而關(guān)于Mn對于貝類的相關(guān)研究鮮有報道，還有待進(jìn)一步深入研究。Zn是生物生命過程中必需的微量元素，不僅參與細(xì)胞和酶的結(jié)構(gòu)組成，在蛋白質(zhì)和糖類的代謝過程中也發(fā)揮重要作用，但當(dāng)Zn的含量超出一定閾值時，會影響生物的正常生理代謝，抑制生物的生長發(fā)育，也會導(dǎo)致免疫與生殖系統(tǒng)損傷[21]。Cu是一種極易被海洋生物富集的金屬污染物，Cu2+可與生物蛋白質(zhì)巰基結(jié)合抑制相關(guān)酶的生物活性，阻斷生物正常的新陳代謝，破壞體內(nèi)抗氧化酶活力，加快生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用，損傷細(xì)胞甚至導(dǎo)致生物體死亡[22-23]。此外，Cu2+還能影響水生動物體內(nèi)Na+/K+-ATP酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡[24]，這或許是大多數(shù)水生動物對Cu2+比較敏感的原因。

本次試驗中，Cd2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+對菲律賓蛤仔96 h半致死質(zhì)量濃度分別為2.67、61.27、21.57、0.79 mg/L，4種重金屬離子對菲律賓蛤仔毒性大小為Cu2+>Cd2+>Zn2+>Mn2+。秦華偉等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+、Cd2+、Zn2+對菲律賓蛤仔的毒性效應(yīng)依次為Cu2+>Cd2+>Zn2+，與本研究結(jié)果較為一致。但從Cd2+、Zn2+、Cu2+對菲律賓蛤仔96 h半致死質(zhì)量濃度比較，本試驗中，Cd2+、Zn2+對菲律賓蛤仔96 h半致死質(zhì)量濃度均小于其所得出的2.843 mg/L和30.246 mg/L，這可能與本試驗中試驗溫度較高(24～26 ℃)、溶解氧水平較低(5.00～5.62 mg/L)等有關(guān)，水體溫度越高，溶解氧水平越低，對水生生物的毒性也就越大。而本試驗Cu2+對菲律賓蛤仔的96 h半致死質(zhì)量濃度是其所得結(jié)果的2.4倍，表現(xiàn)出對Cu2+的較高耐受性，這可能與受試菲律賓蛤仔的規(guī)格、棲息環(huán)境和其他試驗條件的差異有關(guān)。高淑英等[26]研究發(fā)現(xiàn)，Cd2+、Mn2+、Zn2+對長毛明對蝦(Fenneropenaeuspenicillatus)幼體的毒性效應(yīng)依次為Cd2+> Mn2+>Zn2+，而本試驗中，Zn2+對菲律賓蛤仔的毒性要強(qiáng)于Mn2+，表明貝類和甲殼類對重金屬的耐受能力有差異，也可能與受試水生動物的年齡大小和生活習(xí)性有關(guān)。

3.2 4種重金屬離子的安全質(zhì)量濃度評價

本次試驗中，Cd2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+對菲律賓蛤仔的安全質(zhì)量濃度分別為0.03、0.61、0.22、0.01 mg/L。Cd2+的安全質(zhì)量濃度與喬慶林等[10]測定的養(yǎng)殖水體環(huán)境中菲律賓蛤仔Cd2+的安全限量結(jié)果非常接近。寧軍號等[27]進(jìn)行了Zn2+、Cu2+、Cd2+對偏頂蛤(Modiolusmodiolus)的急性毒性試驗，得出Cd2+、Zn2+、Cu2+對偏頂蛤的安全質(zhì)量濃度分別為0.25、0.62、0.005 mg/L。其中Cd2+與Cu2+對偏頂蛤的安全質(zhì)量濃度均低于Cd2+與Cu2+對菲律賓蛤仔的安全質(zhì)量濃度，表明菲律賓蛤仔對Cd2+與Cu2+的耐受性均高于偏頂蛤，但Zn2+對菲律賓蛤仔的安全質(zhì)量濃度低于對偏頂蛤的安全質(zhì)量濃度，菲律賓蛤仔和偏頂蛤的種屬差異可能是造成該差異的主要原因。

GB 11607—1989《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定：ρ(Cd2+)≤0.005 mg/L，ρ(Zn2+)≤0.1 mg/L，ρ(Cu2+)≤0.01 mg/L。本試驗中，除Cu2+外，Cd2+、Zn2+對菲律賓蛤仔的安全質(zhì)量濃度均高于漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，說明菲律賓蛤仔對Cd2+與Zn2+的耐受性較強(qiáng)，在重金屬超標(biāo)的環(huán)境中仍可以存活。研究證實，菲律賓蛤仔對Cu2+的耐受性在試驗的4種金屬離子中最差，敏感性最高。因此，在養(yǎng)殖過程中應(yīng)該特別注意含Cu消毒劑的使用劑量，防止使用不當(dāng)造成損失。隨著人們生活水平與健康意識的提高，人們對食物的安全評判標(biāo)準(zhǔn)也愈加規(guī)范，因此，在水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過程中，應(yīng)該參照現(xiàn)行漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格控制水體中重金屬含量，防止重金屬超標(biāo)，確保水產(chǎn)品的健康品質(zhì)。

4 結(jié) 論

本試驗采用毒理學(xué)試驗方法研究了Cd2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+對菲律賓蛤仔的急性毒性效應(yīng)，試驗結(jié)果表明，暴露于上述4種不同的重金屬溶液以及同組不同質(zhì)量濃度梯度環(huán)境中的菲律賓蛤仔，均會受到一定程度的毒害作用，且毒害作用的大小隨重金屬離子及其質(zhì)量濃度的變化而變化。本試驗結(jié)果表明，4種重金屬離子對菲律賓蛤仔的毒性強(qiáng)弱依次為Cu2+>Cd2+>Zn2+>Mn2+，Cd2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+對菲律賓蛤仔的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為2.67、61.27、21.57、0.79 mg/L，安全質(zhì)量濃度分別為0.03、0.61、0.22、0.01 mg/L。本試驗結(jié)果可為菲律賓蛤仔人工育苗和養(yǎng)殖過程中的水質(zhì)監(jiān)測提供理論依據(jù)。