草魚養殖模式對氣單胞菌屬細菌群落影響分析

徐先棟，付輝云，歐陽敏，萬國湲，饒 毅，黃江峰，周智勇，劉禮輝

( 1.農業農村部漁用藥物創制重點實驗室，廣東省水產動物免疫技術重點實驗室，廣東 廣州 510380； 2.江西省水產科學研究所，江西 南昌 330039； 3.江西省養蜂研究所，江西 南昌 330052 )

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國淡水水產養殖主養品種，養殖產量多年來約占據全國淡水水產養殖總產量的1/5[1]，為我國水產品市場提供了價格實惠、質量優良的蛋白質來源。經過多年的養殖技術發展，目前草魚養殖形成了以池塘精養為主，山塘養殖、魚菜共生養殖等為補充的多種養殖模式。池塘精養和魚菜共生模式全程投喂配合飼料，山塘養殖主要投喂草料，或少量搭配配合飼料。研究者對不同養殖模式下草魚品質和生理功能等方面開展了研究，如張愛芳等[2]研究了此3種模式下草魚的營養成分和氨基酸的組成，雷曉中等[3]研究了3種模式下草魚肝胰臟結構與功能的變化。此類研究以草魚本身為對象，研究不同養殖模式對草魚自身指標的影響，為草魚健康養殖提供了部分理論依據。不過，鮮見有不同養殖模式對草魚養殖環境(水體和底泥)系統，特別是對細菌群落影響的對比研究，常見單個養殖模式對水體或底泥細菌群落的研究，如馬富平[4]研究了草魚精養模式池塘微生物群落結構，程瑩寅等[5]研究了草魚精養池塘底泥微生物群落多樣性，何濤[6]研究了草魚精養池塘水體的細菌群落結構。目前僅見其中2個模式的菌群差異的研究，如Qin等[7]研究了草魚精養和草飼池塘細菌多態性。細菌是養殖生態系統中的重要組成部分，充當著分解者角色，關系到整個養殖環境中的物質循環和能量流動。研究草魚養殖系統環境中的細菌群落，特別是病原菌的分布及其多樣性，對于養殖病害的防治具有重要的理論和現實意義。為此筆者研究草魚不同養殖模式下氣單胞菌屬細菌菌群結構與分布，為豐富草魚健康養殖理論提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 草魚養殖模式

草魚3種養殖模式分別為：草魚池塘精養模式，產量約15 000 kg/hm2，投喂配合飼料；草魚山塘養殖，產量約4500 kg/hm2，投喂黑麥草等草料；草魚魚菜共生養殖，產量約15 000 kg/hm2，投喂配合飼料，種植10%水空心菜(Ipomoeaaquatica)。采集池塘水樣和底泥，采樣時間為2017年5—7月(養殖投喂旺盛期)，每種養殖模式選取2口池塘，在池塘兩端和中部各設置1個采樣點。

1.2 池塘水體細菌采集

用采水器在池塘兩端和中部采集表層15 cm處水樣，現場混勻后，裝入滅菌塑料瓶中，低溫保存，4 h內送實驗室檢測。采用RS培養基平板涂布法，分別取0.1 mL水樣和經10倍和100倍稀釋的樣品涂布，28 ℃培養24 h后，取菌落數為30～100個的平板，根據菌落形態特征，挑取不同形態單菌落純化培養，每種形態菌落至少挑取2～3個，經鑒定為同一種菌則記錄為1株菌。純化后的菌株以營養肉湯培養基培養18～24 h，加終體積分數為15%無菌甘油，-80 ℃保存備用。

1.3 底泥細菌采集

在池塘兩端和中部用采泥器采集表層底泥，現場各無菌稱取5 g底泥，置于裝有135 mL的無菌生理鹽水的塑料瓶中，振蕩混勻，放置采樣箱低溫保存，4 h內帶回實驗室進行細菌分離。底泥混懸液靜置后，吸取上清液0.1 mL涂布于RS培養基平板上。28 ℃培養24 h后進行細菌分離。細菌分離方法同1.2。

1.4 細菌鑒定

采用16S rDNA序列測序方法鑒定細菌。序列經16S rDNA通用引物27F/1492R PCR擴增，產物由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。序列上傳至GenBank網站比對，進行細菌鑒定。對氣單胞菌屬細菌，進一步結合可變區特征序列鑒定到種[8]，如維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)的16S rDNA第1可變區特征性的序列TACTGGAAACGGTA，第2可變區特征性的序列TGGTAGCTAATAACTGCCAG。數據分析采用Excel 2007軟件進行。

2 結 果

2.1 細菌分離

試驗共分離54株細菌。其中精養池塘分離13株，底泥分離細菌少，且菌落形態單一，經隨機挑取3個菌落，鑒定同為維氏氣單胞菌，記錄為1株菌，水體12株；山塘養殖池塘分離20株，底泥9株，水體11株；魚菜共生池塘分離21株，底泥8株，水體13株(表1)。

表1 養殖水體和底泥分離細菌信息

細菌經16S rDNA測序鑒定分析，共分為10屬22種，其中氣單胞菌屬細菌占優勢，為23株，其后為假單胞菌屬細菌8株、檸檬酸桿菌屬6株、腸桿菌屬7株、泛菌屬及沙雷氏菌屬各3株，其他果膠桿菌屬、沙門氏菌屬、克呂沃爾菌屬、勒克菌屬各1株(圖1)。按種類分，維氏氣單胞菌最多，為12株，嗜水氣單胞菌次之，為10株。煙粉腸桿菌6株，弗氏檸檬酸桿菌5株，其他菌1～2株不等(表1，圖1)。

圖1 分離細菌種屬分布Fig.1 The genera of isolated bacteria

2.2 細菌種類分析

按養殖模式來源分：魚菜共生養殖池塘分離細菌種類最多，為13種21株菌，分離的嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌占比較少，分別為3株和4株；假單胞菌屬細菌4株；山塘養殖環境中共分離到12種20株菌，其中嗜水氣單胞菌占多數，為7株，維氏氣單胞菌3株次之；精養池塘中分離細菌種類最少，只分離到5種菌，13株，其中維氏氣單胞菌和檸檬酸桿菌屬占優勢，各為5株(圖2)。

按細菌環境來源分：底泥中共分離15株菌，分屬5種，以氣單胞菌屬和檸檬酸桿菌屬細菌為主，其中嗜水氣單胞菌占絕大多數，為9株，其他細菌如弗氏檸檬酸菌為4株，豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌以及煙粉腸桿菌各1株。水體中共分離39株菌，分屬21種，優勢種屬為氣單胞菌屬、假單胞菌屬及腸桿菌屬細菌，分別為12株和5株，其中維氏氣單胞菌分布最多，為11株，其他種屬細菌，如泛菌屬、果膠桿菌屬細菌等1～2株不等(圖3)。

圖2 不同養殖模式分離細菌統計Fig.2 The statistics of bacteria isolated from different culture modes

圖3 底泥和水體分離細菌種類分布Fig.3 The bacterial distribution in sediment and water

3 討 論

3.1 RS培養基平板分離細菌分析

RS培養基是20世紀70年代初期研制的最早是用于嗜水氣單胞菌的選擇性培養基，根據嗜水氣單胞菌發酵麥芽糖產生黃色菌落而鑒別[9]。氣單胞菌屬細菌是淡水養殖主要病原菌，本試驗主要是研究草魚不同養殖模式環境中的氣單胞菌屬細菌分布情況，為草魚在不同養殖模式下健康養殖提供理論參考，故采用RS培養基進行細菌的分離。在RS培養基上，根據細菌的不同生化特性，還會產生3種不同菌落形態，如黃色菌落中心現黑點，該類細菌具有發酵麥芽糖并產生H2S，包括變形桿菌屬(Proteus)、檸檬酸桿菌屬細菌等；黃綠色菌落，顯示賴氨酸或(和)鳥氨酸脫羧，包括沙門氏菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬細菌等；綠色菌落中心現黑色表示的是賴氨酸或(和)鳥氨酸脫羧，并且產生H2S，該類細菌有檸檬酸桿菌屬、沙門氏菌屬、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)等。20世紀70年代初期，氣單胞菌屬中許多細菌還未有分離報道，現在隨著細菌分離和鑒定技術的發展，發現許多氣單胞菌屬細菌表現不同的生理生化特性，如維氏氣單胞菌、溫和氣單胞菌(A.sobria)具有賴氨酸脫羧特征，殺鮭氣單胞菌(A.salmonida)產生H2S等[10]，從而使RS培養基在鑒定氣單胞菌屬細菌顯示了多種形態。為研究細菌分布多態性，將可以在RS培養基上生長的細菌進一步分離純化鑒定，從而使鑒定的種類出現了假單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬細菌等。

3.2 不同養殖模式下細菌分布情況分析

從不同養殖模式細菌種類上可以看出，魚菜共生養殖環境中細菌分離種類最多，暗示細菌多態性可能也最高，細菌多態性高的池塘，水質更好，最不易發病[11-12]。如孫蘇燕等[13]研究了健康和患病三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)養殖池塘表層底泥細菌群落的變化，結果表明，病害塘中變形菌門細菌無論是多樣性還是豐度均有所降低。山塘養殖池塘分離細菌種類也較多，不過因其產量低，效益不高，所以代表性不強。與已有的研究結果[14]相似，本試驗中精養池塘細菌種類較少，潛在致病菌如維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等含量多。分析原因可能是[14]：一方面沉積在底層的殘餌、糞便等有機物超出了環境自凈能力，阻礙了營養物質向微生物輸入，未被充分氧化分解的殘餌、糞便產生有害物質，也阻礙了微生物生長；另一方面，隨著配合飼料等的持續性加入，對菌群進行了定向性馴化，從而導致了菌群種類的降低。因而，精養池塘養殖魚類更易發生病害，魚肉品質也稍有下降[2]。相比而言，魚菜共生系統，綜合了水產養殖和水栽培技術，在凈化水質和促進物質轉移方面具有顯著作用，可產出優質水產品和新鮮蔬菜，獲得雙重效益，值得大力推廣。

3.3 水體和底泥細菌分布特征

試驗分離的氣單胞菌屬細菌，如維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌分布具有明顯的環境差異。水體中以維氏氣單胞菌為主，12株維氏氣單胞菌中11株分離自水體，占比為91.6%；底泥中以嗜水氣單胞菌為主，本試驗10株嗜水氣單胞菌中有9株分離自底泥，占總數的90%。結果與已有的研究相似，如楊五名[15]研究淡水池塘中氣單胞菌的生態學與流行病學，結果也顯示，嗜水氣單胞菌在淡水養殖水體中的分布并不廣泛，豐度也不高。維氏氣單胞菌是在水體中分布最廣泛、豐度也較高的氣單胞菌種類。諸多研究均表明，維氏氣單胞菌是近年來淡水養殖主要病原菌[16-18]。維氏氣單胞菌是條件致病菌，在水體中分布廣泛，與魚體直接接觸，當魚體因捕撈生產操作受傷，或環境變化，引起的免疫力低下等因素，易患維氏氣單胞菌病，可能正是近年來該病流行的原因。已有研究表明，底泥是魚類細菌病的病原庫[5]，本試驗中分離的嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌屬細菌[19]等致病菌大都存在于精養池塘的底泥中，也證明了這一點。致病菌和環境中其他微生物處于一種動態平衡之中，彼此競爭，如果養殖環境惡化時，微生物群落結構也會發生變化，許多條件致病菌就會大量繁殖，養殖動物就很容易患病。研究結果提示，要做好維氏氣單胞菌的防控工作，同時要維護好整個養殖系統環境穩定，使嗜水氣單胞菌不能在底泥中釋放，以降低草魚疾病發生風險。

4 結 論

草魚池塘精養殖、山塘草飼養殖和魚菜共生養殖3種養殖模式中底泥和水體的氣單胞菌屬細菌分布研究表明：魚菜共生養殖模式，水體和底泥中細菌種類多，潛在致病菌數量少，與前兩種模式相比，草魚魚菜共生養殖模式在降低疾病暴發風險和提高養殖綜合效益上具有優勢。