1株拉薩裸裂尻魚源致病性中間氣單胞菌的分離鑒定

曾本和，楊成年，邱玉林，王金林，王萬良，王 建，朱成科

( 1.西藏自治區農牧科學院 水產科學研究所，西藏 拉薩 850002； 2.西南大學 動物科學學院，淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，水產科學重慶市市級重點實驗室，重慶 402460 )

拉薩裸裂尻魚(Schizopygopsisyounghusbandi)主要分布于雅魯藏布江大拐彎以上的干支流及羊八井溫泉出水小河中，為一種底棲刮食性魚類，是西藏地區主要的經濟魚類之一[1]。其肉質細嫩，肉味鮮美，且富含脂肪，特別是體內富含n-3型多不飽和脂肪酸，在抗心血管疾病和調節血脂方面發揮重要作用[2]。近年來，由于受水利工程建設和人類活動加劇等因素影響，使得該魚的野生資源量急劇減少[3-4]，因此增強種質資源顯得尤為重要。

目前，拉薩裸裂尻魚的研究主要集中在生長規律[3]、食性[5]、胚胎發育[6]等方面，對拉薩裸裂尻魚病害方面的報道甚少，目前僅有拉薩裸裂尻魚體表出血病病原分離的研究報道[7]。2019年2月，在西藏自治區農牧科學院水產科學研究所養殖基地出現拉薩裸裂尻魚患病死亡現象，臨床癥狀主要表現為鰓蓋、下頜、腹部及側線有明顯的出血點，腹鰭和臀鰭充血發紅且肛門紅腫，解剖發現體內有少許腹水。該病發病率高達20%～40%，死亡率達10%～20%，給該養殖基地帶來較大的經濟損失。

筆者首次從拉薩裸裂尻魚肝臟內分離到1株病原菌，經人工回歸感染試驗確定為致病菌，經形態學觀察和生理生化特性研究，基于16S rRNA、gyrB基因確定分類地位，綜合鑒定該菌為中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)，同時進行病原菌的耐藥性試驗，以期為該病的治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病魚取自西藏自治區農牧科學院水產科學研究所養殖基地，體質量9.99～14.45 g，用于人工感染試驗的150尾健康拉薩裸裂尻魚取自拉薩市曲水縣西藏土著魚類增殖育種場，體質量12.25～15.65 g。

主要試劑和儀器：普通營養肉湯培養基(Oxoid公司)、藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)、細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、革蘭氏染色試劑盒(青島海博生物)、API 20E試劑盒(法國Biomerieux公司)、瓊脂糖(Takara公司)；恒溫搖床(美國Bio-Rad公司)、PCR 擴增儀(美國Bio-Rad公司)、電泳儀(美國Bio-Rad公司)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離及形態學觀察

在無菌條件下進行病原菌的分離。用75%酒精擦拭魚體，再用無菌接種針蘸取肝臟、脾臟及腹水進行平板劃線，28 ℃恒溫培養箱中培養24 h；選取優勢單菌落在相同條件下進行二次純化培養24 h，觀察菌落形態學特性，同時挑取單個菌落進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察細菌的顯微結構。最后將純化分離菌株于4 ℃保存待用。

1.2.2 人工感染試驗

挑取單菌落接種于液體培養基，28 ℃培養7～8 h，3500 r/min離心10 min收集菌體，然后用無菌生理鹽水依次調整至1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105cfu/mL不同密度的菌懸液。試驗魚胸鰭基部注射0.2 mL對應密度的菌懸液，對照組注射等量生理鹽水，30尾/組。每日觀察拉薩裸裂尻魚發病癥狀，連續觀察7 d。對感染死亡的拉薩裸裂尻魚進行致病菌的分離鑒定試驗。

1.2.3 生理生化鑒定

在超凈工作臺內，挑取純化的單菌落于普通營養瓊脂固體培養基表面，在恒溫培養箱培養24 h后，根據API 20E試劑盒相關操作進行細菌的生理生化鑒定試驗，結果參照《伯杰細菌鑒定手冊》[8]的標準進行判定。

1.2.4 分子生物學鑒定

參照文獻[9]方法提取分離株細菌的總DNA，于-20 ℃條件下儲存備用。本試驗中PCR反應體系設為50 μL，以細菌DNA為PCR反應模板，在0.2 mL Eppendorff管中依次加入以下試劑：10×PCR緩沖液(含MgCl2)5 μL，10 mmoL/L dNTPs 1 μL，16S rRNA正向引物(F：5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′[10])、反向引物(R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′[10])，gyrB正向引物(F: 5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′[11])、反向引物(R: 5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′[11])各1 μL，模板DNA 2 μL，rTaq酶0.4 μL，ddH2O 39.6 μL。反應條件為：反應前94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共32個循環；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送華大基因進行序列測定。

1.2.5 藥物敏感試驗

運用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗。將菌液制成1.0×108cfu/mL密度的懸液，用無菌棉球將菌液均勻涂布在固體營養瓊脂表面，然后貼上不同的藥敏紙片，28 ℃培養24 h，用游標卡尺測量抑菌圈的大小，結果參考British Society for Antimicrobial Chemotherapy(BSAC)標準[12]進行判定。

2 結果與分析

2.1 病魚癥狀和病原菌的分離

患病拉薩裸裂尻魚主要臨床癥狀表現為鰓蓋、下頜、腹部及側線有明顯的出血點，腹鰭和臀鰭充血發紅且肛門紅腫(圖1)，解剖魚體發現體內有少許腹水。從病魚肝臟分離到1株細菌LS-01。該菌在普通營養瓊脂平板表面生長良好，在28 ℃培養24 h后形成光滑、隆起、有光澤，直徑在1.0～1.6 mm的圓形菌落，在油鏡下觀察到兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌(圖2)。

圖1 患病魚Fig.1 Sick S. younghusbandi

圖2 菌落革蘭氏染色結果Fig.2 Morphological characteristics of strain LS-01 stained by Gram

2.2 人工感染試驗

試驗組拉薩裸裂尻魚在注射0.2 mL密度為1.0×108cfu/mL的菌懸液后，3 d內的死亡率達100%，對照組拉薩裸裂尻魚未出現死亡(表1)。感染死亡的拉薩裸裂尻魚臨床癥狀表現為腹部有出血點，肛門紅腫，解剖后腹腔內有少許紅色腹水，這與自然環境下拉薩裸裂尻魚的患病癥狀極為相似，同時在病魚肝臟內再次分離到優勢菌，綜合細菌形態學、生理生化特性及分子生物學鑒定，結果與菌株LS-01特性一致，表明菌株LS-01是引起此次拉薩裸裂尻魚患病的病原菌。根據改良寇氏法[13]，計算分離株細菌LS-01的半數致死密度為3.98×106cfu/mL。

表1 人工感染試驗

2.3 生理生化鑒定

菌株LS-01能利用阿拉伯糖、D-甘露糖、麥芽糖、半乳糖、海藻糖等，苯丙氨酸脫氨酶、精氨酸雙水解酶、氧化酶陽性；鳥氨酸脫羧酶陰性(表2)。試驗結果與《伯杰細菌鑒定手冊》[8]比對分析，鑒定分離菌株LS-01為中間氣單胞菌。

表2 生理生化鑒定結果

2.4 16S rRNA、gyrB基因擴增及系統發育分析

以菌株LS-01的DNA為模板，使用16S rRNA、gyrB通用引物進行PCR反應，產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測到2條大小約為1500 bp、1200 bp的DNA片段，與預期結果大小相符(圖3)。經測序獲得16S rRNA、gyrB基因片段大小依次為1497 bp和1210 bp。

菌株LS-01的16S rRNA序列與中間氣單胞菌(GenBank登錄號：KC210759.1)的相似性高于99%；菌株LS-01的gyrB序列與中間氣單胞菌(GenBank登錄號：AY987513.1)的相似性高于99%。根據比對結果選取GenBank中已登錄的部分同屬異種的其他序列，運用Clustal X軟件及MEGA 3.0軟件采用鄰接法構建系統發育樹。結果表明，菌株LS-01與中間氣單胞菌聚為一支，進一步確定菌株LS-01為中間氣單胞菌(圖4,圖5)。

圖3 菌株LS-01 16S rRNA、gyrB基因PCR產物擴增電泳Fig.3 The electropherogram of PCR amplified product based on 16S rRNA and gyrB gene in strain LS-01M.DL2000 DNA marker； 1.16S rRNA； 2.gyrB.

圖4 16S rRNA基因構建的系統發育樹Fig.4 Unrooted neighbour-joining phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene

圖5 gyrB基因構建的系統發育樹Fig.5 Unrooted neighbour-joining phylogenetic tree based on the gyrB gene

2.5 藥敏試驗結果

中間氣單胞菌LS-01對33種抗生素的敏感性見表3。結果顯示，中間氣單胞菌LS-01對頭孢他啶、頭孢哌酮等12種藥物高度敏感，對新霉素、卡那霉素等2種藥物敏感，對紅霉素、麥迪霉素等19種藥物耐藥。

表3 藥敏試驗結果

3 討 論

3.1 致病菌致病性及種類鑒定

自患病拉薩裸裂尻魚肝臟內分離出的病原菌能夠在培養基表面生長出淺黃色、半透明的圓形菌落，經革蘭氏染色鏡檢觀察為短桿狀的革蘭氏陰性菌。人工感染發病死亡的病魚臨床癥狀表現出與自然狀況下相似的病癥，同時從魚體內再次分離出具有相同形態特征的病原菌，以上內容符合科赫法則判定細菌性疾病的條件，說明此次拉薩裸裂尻魚死亡是由細菌性疾病引起。人工感染試驗得到菌株LS-01的半致死密度為3.98×106cfu/mL，當給魚體注射0.2 mL密度為1.0×108cfu/mL菌懸液時，3 d內試驗魚的死亡率達100%，表明該菌具有較強的致病性。

為確定病原菌的分類地位，運用常規的分子生物學鑒定方法。本試驗選用進化速率慢，功能保守的16S rRNA基因進行鑒定[14]，但該基因由于分子較小，包含的信息量少，對于同源關系接近的種間分辨率不夠[15]。由于gyrB基因在細菌的復制和轉錄過程中均起到重要作用，常用于分辨親緣關系較近的種間關系，故選用特異性更高的gyrB基因進行鑒定[15]。本試驗通過提取分離株細菌的DNA，然后分別以16S rRNA、gyrB基因的通用引物進行PCR擴增，將擴增產物經電泳檢測后測序，測序結果經Blast比對分析，結果與中間氣單胞菌相似度高達99%，最終鑒定菌株LS-01為中間氣單胞菌。

中間氣單胞菌屬氣單胞菌目、氣單胞菌科、氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性菌，廣泛分布于土壤、水體中，是淡水養殖中一類常見的病原菌。現有研究報道，中間氣單胞菌能夠引起仿刺參(Apostichopusjaponicus)表皮潰爛病[16]、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)體表出血病[17]及斑點叉尾(Ictalunespunctatus)體表出血病[18]等。筆者首次從拉薩裸裂尻魚肝臟內分離到中間氣單胞菌，對該菌的形態學、生理生化特性及致病性方面進行了研究，但對于該細菌的致病機理還需進一步研究。

3.2 致病菌對常見抗生素的敏感性

藥敏試驗結果顯示，從拉薩裸裂尻魚體內分離出的中間氣單胞菌對頭孢他啶、頭孢哌酮、氨曲南等12種藥物高度敏感，該結果與王高學等[16-18]的研究結果存在一定的差異，這可能是由于抗生素的使用量不同、菌株來源差異和地理環境不同等所致[19]。在對該疾病的治療過程中，根據農業農村部公告第193號《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》和NY 5071—2002《無公害食品漁用藥物使用準則》相關內容并結合本試驗藥敏試驗結果，建議選擇氟苯尼考等高度敏感的抗菌藥物針對性地開展治療。同時，在實際生產中要科學地使用敏感性抗菌藥物進行治療，同時積極改善養殖水體環境，增強魚體抵抗力。

4 結 論

致病菌株LS-01為革蘭氏陰性菌，經鑒定為中間氣單胞菌，對拉薩裸裂尻魚幼魚半數致死劑量為3.98×106cfu/mL，對頭孢他啶、頭孢哌酮、左氧氟沙星、氟苯尼考等12種藥物高度敏感。