魚類重要免疫器官抗菌機制的研究進展

羅智文，董志祥，林連兵，張棋麟

( 昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南省高校飼用抗生素替代技術工程研究中心，云南 昆明 650500 )

魚類是重要的水產養殖動物，因其分布范圍廣，涉及區域多，極易遭受外源壓力的影響，故病原菌對魚類的危害最大。魚類病原菌多樣，致病原因復雜，廣泛存在于環境中并易于傳播，嚴重地威脅魚類養殖業的健康發展[1]。近年來，隨著集約化養殖規模的擴大，病原菌感染導致魚類大量死亡，限制了產業的發展[2-3]。因此，一些研究者聚焦于魚類抗菌的免疫機制探索[4-6]。免疫系統的響應機制是魚類抵抗寄生蟲、細菌和病毒威脅的防線[7]，其中，重要免疫器官的抗菌機制探討是魚類免疫學研究的核心。筆者總結了魚類免疫系統的組成及作用機制，重點綜述了魚類免疫器官對病原菌的免疫響應機制，為今后魚類抗菌機制的研究與應用提供重要的參考信息。

1 免疫器官是魚類免疫系統的重要組成部分

根據免疫響應的特異性程度，免疫分為先天免疫和適應性免疫。免疫系統具有分層防御機制，增加特異性以對抗感染。簡單來說，物理屏障可防止細菌和病毒等病原進入生物體[8]，如果病原體突破了這些屏障，成功地躲避了先天免疫系統，脊椎動物的適應性免疫系統便發揮作用，保護機體免受侵害[9]。魚類的先天免疫和適應性免疫系統彼此交聯[10-11]，不僅可識別和排除外來物質(不同污染源和各類病原菌)[12-13]，還可在機體監視、自穩方面發揮重要作用[14]。免疫系統主要包括免疫組織及器官、免疫細胞和免疫因子3類[15]。免疫組織為免疫細胞分化、成熟、定居及產生免疫應答提供場所[15]。魚類的免疫器官包括中樞免疫器官和外周免疫器官[16]。免疫細胞參與機體的免疫應答，主要分布在機體淋巴器官及血液中。免疫因子包括抗菌肽[17]、補體[18-19]、細胞因子[20]等，共同構成了機體免疫的基礎。其中，鰓、腎臟、肝臟和脾臟是魚類最主要的免疫器官，具有不可替代的作用[21-24]。

鰓與水直接接觸進行物質交換，對外來生物素高度敏感，是許多毒物的靶器官[25]，在機體對抗外源物入侵時發揮著重要的免疫作用[26]。此外，鰓還涉及呼吸、滲透壓調節、酸堿平衡、含氮廢物排泄、熱交換和黏液生成等功能[27]。硬骨魚類的腎臟分為頭腎、中腎和后腎，是最重要的淋巴組織[28-29]。成年硬骨魚的頭腎主要有造血和內分泌兩種功能，這主要得益于頭腎內部豐富的血管網、造血組織、淋巴細胞叢以及噬黑色素細胞和淋巴細胞結構[30-31]；后腎為排泄器官，也具有造血和免疫功能[28]。當頭腎和中腎受到病原刺激時，組織內細胞便大量增殖以響應免疫[32]。脾臟是淋巴系統中最后一個發生器官，主要由紅髓和白髓組成，為紅細胞、中性血細胞及各種粒細胞產生、儲存和成熟的場所，是名副其實的造血系統和免疫器官[33]。脾臟主要依賴淋巴小泡、巨噬細胞和噬黑色素細胞產生作用，當受抗原刺激后，脾臟內部免疫細胞將大量增殖并作用在整個器官上。

肝臟是魚體內最大的腺體，由于具有消化、代謝、排泄、解毒及免疫等多種功能，肝臟也是動物體內最大的代謝器官[34]。魚類代謝產生的有害廢物、外來的有毒物質、藥物的代謝和分解產物均由肝臟清除。肝臟還是機體內最大的網狀內皮細胞吞噬系統，能吞噬、隔離、消除入侵和內生的各種病原體[24]。值得注意的是，幾乎所有的凝血因子均由肝臟產生，所以肝臟在機體的凝血和抗凝血兩個系統的動態平衡中起著重要的調節作用[35]。魚皮膚作為身體的最外層器官[36]，不但是外部和內部環境之間的一個保護屏障，還是免疫系統的第一道防線[37]。由于直接暴露在多種外部壓力源下，魚皮膚可以通過系統產生的防御信號[38]，主要依靠分泌的黏液(其中含有大量的抗體、溶菌酶、抗菌肽及免疫球蛋白等免疫成分)和表皮細胞共同作用來保護機體[39]。

除上述免疫器官，腸道的免疫功能也不可忽視。腸道是一個重要的環境—生物界面，具有完整的免疫屏障結構，此外，魚腸道中后部還分布著大量的淋巴細胞，是主要的抗原攝取和免疫應答部位[40]。

2 病原菌對魚類免疫器官的影響

病原菌的危害是限制水產養殖業發展的主要因素之一。通常來說，魚類感染病原菌的死亡率較高，并且由于病原菌種類繁多、致病原因復雜，對水產養殖業有所沖擊。

弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)是一種威脅魚類生存的常見病原菌[41]，魚類感染后會出現再生障礙性貧血、蛋白質丟失、白細胞數量減少及肝臟變性、腎臟造血組織數量減少、皮膚出血、嚴重腸炎等不良反應，最終導致魚類死亡[42-44]。無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)是威脅尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)健康的主要病原菌。該菌為革蘭氏陽性菌，呈灰白色，表面光滑，有乳光，單菌落隆起呈圓形，感染無乳鏈球菌的斑馬魚(Daniorerio)表現為眼球突出，鰓和鰭充血，腹部腫脹，且伴有嚴重出血癥狀(圖1)。無乳鏈球菌廣泛存在于淡水、河口和海洋中，可引起不同魚類的敗血癥和腦膜炎，嚴重限制了水產養殖業的發展[45-48]。此外，嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)也是危害魚類健康的病原菌。感染嗜水氣單胞菌的魚類出現肝臟壞死、腎小管降解、腸上皮區域擴大等病理變化，給水產養殖業帶來了巨大的經濟損失[49]。近年報道多、危害嚴重的魚類病原菌見表1。

圖1 無乳鏈球菌菌落形態、細胞顯微形態和感病斑馬魚癥狀Fig.1 Colony morphology, cell morphology and symptoms of zebrafish infected by S. agalactiaea.無乳鏈球菌菌落形態; b.無乳鏈球菌顯微形態; c、d.無乳鏈球菌感染致死的斑馬魚.a.colony morphology of S. agalactiae; b.micro-morphology of S. agalactiae；c and d.dead zebrafish caused by S. agalactia infection.

表1 病原菌及其對魚類免疫器官的危害

3 魚類重要免疫器官的抗菌機制

3.1 鰓

鰓作為魚類與外部環境進行物質交流的媒介和重要的生物屏障[91]，導致其極易受到各種環境和致病微生物的威脅。隨著與魚鰓相關的疾病越來越多[92]，其重要的免疫作用也受到關注[93]。當鰓受到病原菌侵染時，往往表現出較明顯的病征。例如，細菌感染引起的爛鰓病會導致鰓蓋內表面充血，嚴重時還會出現糜爛、鰓絲腫脹、末端黏液分泌增多、鰓絲缺失而導致鰓絲軟骨外露等癥狀。朱潛等[94]在患爛鰓病的鯽魚中分離出維氏氣單胞菌(A.veronii)和陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，這2種菌是爛鰓病的致病菌。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為革蘭氏陽性菌，菌落厚、有光澤、圓形凸起，對魚鰓威脅巨大。Zhang等[95]探索斑馬魚感染金黃色葡萄球菌后鰓的miRNA表達水平的改變，共鑒定出30個差異表達的miRNA，如miR-153a-3p、miR-133b-3p、miR-134-3p、miR-10a-5p和miR-93等。將這些DEMs進行功能富集分析后，發現其主要參與先天免疫過程、凋亡、防御反應和抗菌反應，不僅為斑馬魚鰓在金黃色葡萄球菌誘導的免疫應答過程中miRNA的調控機制提供了新的視角，還為硬骨魚類對革蘭氏陽性細菌感染的先天免疫應答提供了基礎認識。Hu等[96]發現，魚鰓在蛋白質組水平上參與了對嗜水氣單胞菌感染的免疫應答，通過同位素標記相對和絕對定量分析技術，鑒定出82個相對豐度差異蛋白，其中有57個蛋白豐度在病原菌侵染后上升，如補體成分5、組蛋白H4、甘油醛3-磷酸脫氫酶等，25個蛋白豐度下降，進一步揭示了鰓蛋白質組對嗜水氣單胞菌感染的響應機制。Liu等[97]對致病菌和宿主之間蛋白質的相互作用研究表明，石斑魚感染遲鈍愛德華氏菌后，從鰓內鑒定到8種相互作用的細菌蛋白(ETAE-2675、ompA、fliC、pnP等)，以及12種相互作用的魚類蛋白(dldH、nme2b、anxa4、canX等)，為揭示鰓的抗菌機制提供了參考。

3.2 腎臟

腎臟是成魚最重要的淋巴組織。作為中樞免疫器官，它能分化成紅細胞、淋巴細胞及多種粒細胞，但不同的種類所分化的免疫細胞類型各異。在魚類中，宿主感染病原菌后，腎臟通常會出現腎小管降解，腎竇腔擴大[98]，腎小球的毛細血管擴張、充血和水腫[99]等一系列組織病理學反應。蔣自立等[100]研究發現，嗜水氣單胞菌感染后，魚類腎臟會發生間質比例增大，腎小球數量減少，管腔界限不清等現象。Kumar等[101]研究了虹鱒感染魯氏耶爾森菌對淋巴器官的影響，發現虹鱒感染該菌后脾臟腫大變黑，可見多灶性壞死，腎小管變性，黑色素巨噬細胞明顯增多；蛋白質組學分析發現，頭腎中多種蛋白豐度改變，包括溶酶體、抗氧化劑、金屬蛋白酶、四聚體蛋白、組織蛋白酶、B和C型凝集素受體蛋白等。魚類乳球菌病是由格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)引起的出血性敗血癥。虹鱒感染該病菌后腎臟出現劇烈炎癥反應，致使脾臟中炎癥分子、巨噬細胞和中性粒細胞、頭腎中NK細胞、細胞毒性細胞以及T細胞明顯上調[102]。Byadgi等[103]對感染了格氏乳球菌的鯔魚(Mugilcephalus)頭腎轉錄組測序發現，頭腎中有7192個差異表達基因，其中上調基因4211個，下調基因2981個，涉及的主要免疫相關途徑包括補體和凝血級聯、Toll樣受體(Toll-like receptors)信號通路(圖2)、抗原加工和表達等。鯉魚感染嗜水氣單胞菌后，腎臟免疫基因表達受到了影響，如HSP70基因的表達水平降低，IL-1β和TNF-α表達水平升高，表明病原菌感染顯著影響鯉魚的免疫原表達[104]。這些研究結果為了解魚類腎臟抗菌機制提供了信息。

3.3 脾臟

魚類脾臟是釋放免疫因子和防御病原微生物的主要器官，也是淋巴結缺失時主要的繼發性淋巴器官[106]。魚類脾臟除產生含抗體的細胞及免疫球蛋白外，還參與B細胞的發育、抗原處理以及MHCⅡ類過程[107]，這些都是產生有效適應性免疫反應的重要過程。C3作為補體系統的重要成分，在草魚對抗嗜水氣單胞菌感染中發揮重要作用。感染病原菌后，草魚脾臟中C3補體基因的表達水平顯著上調，說明較高的C3基因表達不僅可幫助草魚更好地抵抗細菌入侵，還能積極修復損傷組織[108]。感染魯氏耶爾森氏菌干擾了施氏鱘(A.schrenckii)脾臟內的免疫相關基因的表達水平。代謝通路分析表明，差異表達的基因主要涉及抗原處理與表達、補體與凝血級聯、T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路、類節點受體信號通路和趨化因子信號通路等[87]功能。Long等[109]對虹鱒感染殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)前后的脾臟進行比較轉錄組學和比較蛋白質組學分析，共篩選出17個差異表達基因和蛋白，包括CD209、IL-13Rα1、VDAC2、GIMAP7、PSMA1和ANXA11s等，表明免疫蛋白在魚免疫反應過程中具有重要的保護功能。Jiang等[110]對感染嗜水氣單胞菌前后的鯉魚脾臟進行轉錄組測序及比較，發現了2900個差異表達基因，如IL1B、FRIH、MX2和IL8等顯著上調，MX1、CO7、APJA和XCR1等顯著下調，所獲得的差異表達基因主要參與病原體識別、細胞表面受體信號轉導和免疫防御等途徑。Qin等[111]研究發現，感染嗜水氣單胞菌的瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachellii)脾臟共有27 803個差異表達基因，其中13 934個上調，13 869個下調。這些差異表達基因主要涉及免疫信號通路，包括Toll樣受體信號通路、B細胞受體信號通路和Fcγ受體介導吞噬作用的信號通路等。

圖2 TLR信號通路的負調控因子Fig.2 Negative regulators of TLR signaling pathwayTLR3信號通路為MyD88非依賴型，TLR4為Myd88依賴型信號通路的代表；→表示正調控；所有的調控因子均為TLRs信號通路中的相關蛋白(出自文獻[105]).TLR3 signaling pathway is MyD88 independent type, and TLR4 is the representative of Myd88 dependent signaling pathway; → indicates positive regulation; all regulatory factors are related proteins in the TLRs signaling pathway (from reference [105]).

3.4 肝臟

脊椎動物肝臟不僅是新陳代謝的重要場所，因其還可產生細胞因子、趨化因子、補體成分和APR蛋白以應對病原菌的攻擊[112]，所以肝臟還是一個重要的免疫器官[37]。肝臟的免疫細胞包括巨噬細胞、中性粒細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和NK細胞[113]。肝臟在免疫和新陳代謝中的雙重作用使其成為宿主防御病原體攻擊時調整代謝功能的重要候選者。劉問[114]發現，感染嗜水氣單胞菌會導致青魚肝臟出血，肝細胞邊界不分明、細胞核固縮、肝板排列紊亂等現象。除了成年青魚，該菌感染還會導致草魚幼魚肝臟結構變化，出現顏色變淺、肝細胞壞死、血管擴張充血等組織病理學現象。Causey等[115]從蛋白質組學角度探索了魚類肝臟在細菌感染防御中的作用。結果顯示，沙門氏菌(Salmonella)感染虹鱒后，肝臟中CD8和MX1基因的表達顯著上調，在鑒定出來的2433種蛋白質中，有109種蛋白的豐度在病原菌入侵后顯著變化，其中包括了補體系統和急性期反應蛋白的上調。草魚感染嗜水氣單胞菌患敗血癥，肝臟的生物學參數和免疫酶活性發生顯著變化，如肝功能指數比富爾頓條件因子更敏感，肝臟中過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性顯著升高[116]。Li等[117]在對感染魯氏耶爾森菌的鱘魚肝臟的轉錄組測序中共鑒定出1112個差異表達基因，其中63個同免疫相關，如TLR5、IL-8、NALP3、CCL19/21、C1QC、HSP70/90和MHCI等，為人們理解鱘魚肝臟抗菌免疫機制提供了遺傳學資源。

3.5 腸道

腸道是魚類重要的免疫器官[40,118]，其主要生理功能包括營養吸收、滲透壓調節，減輕病原菌和環境壓力對機體的影響[119-120]。魚類腸道免疫功能與天然免疫成分[如溶菌酶、酸性磷酸酶、補體、抗菌肽和適應性免疫復合物(如免疫球蛋白)等]密切相關[121]。作為先天免疫系統的重要發生場所，腸細胞及其免疫因子，如促炎性細胞因子、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素(IL-6)、抗炎性細胞因子、IL-10和轉化生長因子β(TGF-β)等，能維護或保持腸道免疫穩態，抵抗病原菌入侵[122]。腸上皮之所以能夠識別和對抗病原體，是因其細胞之間彼此連接，形成了對抗病原體和有毒物質的選擇性物理屏障。此外，覆蓋在腸細胞的黏液層也具有該功能。腸黏膜可激活免疫系統，使機體形成免疫屏障，從而有效清除外源物質及病原菌感染。腸上皮細胞模式識別受體(PRRs)通過病原相關分子模式識別病原體。近年來，對魚類模式識別受體的研究大多集中在Toll樣受體上，它對激活先天免疫系統至關重要[123]。Song等[124]比較分析草魚感染嗜水氣單胞菌前后的腸道轉錄組，發現315個基因在感染細菌后上調(如CCR4、IL8、RRM2等)，234個基因下調(如ELA2、RASA1、SERCA等)；進一步對差異表達基因的功能富集結果顯示，這些基因主要參與了炎癥反應、趨化因子和免疫細胞分化等功能。Li等[125]對感染愛德華氏菌(E.ictaluri)的斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)后腸進行轉錄組分析，發現后肌動蛋白細胞骨架聚合、重塑和連接調節和炎癥反應等相關基因發生了表達響應，顯示了腸道在魚類抗菌免疫中的重要角色。

3.6 皮膚

魚類皮膚是抗菌免疫的第一道防線，在維持內環境穩態和防止細菌入侵方面起著重要的作用[126]。Wang等[127]對嗜水氣單胞菌感染的鯽魚皮膚進行了轉錄組分析，共鑒定出118 111個差異表達基因，對這些基因進行代謝通路富集后發現，其主要參與了TLR、MAPK、JAK-STAT等關鍵先天免疫代謝途徑。Wu等[128]對斑馬魚的皮膚進行了無乳鏈球菌感染試驗，發現PI3K-Akt、IL-17、MAPK、TNF、補體和凝血級聯信號途徑等重要免疫相關基因的快速表達響應。Caipang等[129]對大西洋鱈(Gudasmorhua)皮膚進行了轉錄組分析，發現皮膚中涉及抗菌、抗病毒和細胞因子的產生等相關免疫反應的基因均具有較高的表達量。Guardiola[130]等對歐洲舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)、金頭鯛(Sparusaurata)、石鼓魚(Umbrinacirrosa)和暗石斑魚(E.marginatus)的皮膚黏液進行了分析，發現被檢測的魚皮膚黏液中均含有IgM抗體和溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、蛋白酶等與免疫相關的酶，其相互作用，共同抵御病原體的入侵。這些研究表明，魚類皮膚在抵御病原菌感染方面發揮了重要的作用，一系列與病原菌免疫相關的基因是皮膚抗菌免疫的基礎。

4 展 望

近年來，針對魚類抗菌機制的研究也從單基因或少數基因的“假設基因”途徑轉向到基于基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等多組學聯合研究的“候選基因”途徑，更為高效、全面及準確地對魚類不同免疫器官的抗菌機制開展了研究。這些快速涌現的研究成果不但為相關研究人員打開了更為廣闊的視野，也有助于更系統和深入地了解魚類抗菌免疫防御過程。此外，魚類抗菌免疫學的深入研究也可為保護魚類免受或減輕來自病原菌的侵害提供新的思路和手段。如魚類各個器官抗菌免疫學機制的成果為今后設計有效的疫苗和抗菌、抗病毒藥物提供了理論依據和有效靶標。然而，當前魚類重要器官免疫學抗菌機制研究還存在一些不足，如研究魚類種類單一，對抗菌機制的起源和演化沒有足夠的認識，以及對重要免疫基因開展功能基因組學的研究較少。因此，建議未來重點開展以下3個方面的研究：(1)通過結合不同種類和分類單元下魚類重要免疫器官的抗菌機制，比較分析獲得魚類種間甚至種內獨特和共有的抗菌特征；(2)從細胞和基因層面，在軟骨魚類甚至更原始的無頜類動物[如七鰓鰻(Lampetrajaponicum)等]中追溯重要魚類免疫細胞(如肥大細胞、淋巴樣細胞和巨噬細胞等)、先天免疫和獲得性免疫重要基因(白細胞分化抗原分子、趨化因子和抗原呈遞蛋白編碼基因等)的起源和演化規律，加深對魚類抗菌機制的系統認識；(3)對大量研究中挖掘出的候選基因進行群體水平上和功能基因組學(如利用斑馬魚等模式魚類開展目標基因的正反向遺傳學研究)驗證，進一步明確重要抗菌免疫基因的功能。