基于網絡藥理學探討澳洲茄堿抗腫瘤機制

高聚偉 徐 凱 冉 冉

惡性腫瘤嚴重危害人類健康，據統計全球每年新發惡性腫瘤1808 萬例，死亡956 萬例，而中國分別占新發的23.7%和死亡的30%[1]。中醫辨治腫瘤經驗豐富，是我國腫瘤治療重要組成部分。中藥通過多靶點、多途徑、多效應抗腫瘤，在腫瘤防治中應用廣泛。澳洲茄堿（solasonine，SS）是傳統抗癌中藥龍葵（Solanum nigrum L.）的主要抗癌成分，研究表明，澳洲茄堿通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、阻斷細胞周期等機制，在膀胱癌、肝癌、胃癌等多種癌腫中發揮抗腫瘤效應[2-5]。澳洲茄堿抗腫瘤作用靶點及機制目前未完全明確。因此，本研究利用網絡藥理學方法，對澳洲茄堿抗腫瘤作用靶點及機制進行研究，為澳洲茄堿進一步實驗研究和臨床使用提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 澳洲茄堿藥物靶點篩選 使用TCMSP 數據庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）獲得澳洲茄堿mol2 結構，導入Pharm Mapper 數據庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），取Norm Fit 預測得分大于0，經uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org/）對靶點名稱矯正統一，篩選出澳洲茄堿潛在靶點。

1.2 腫瘤疾病靶點篩選 以“cancer”為關鍵詞，使用OMIM（https://omim.org/）、Genecards 數據庫（https://www.genecards.org/）檢索，獲得疾病作用靶點。

1.3 澳洲茄堿-腫瘤共同靶點篩選及“疾病-靶點-成分”網絡構建 在Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）上輸入澳洲茄堿潛在靶點及腫瘤疾病靶點，繪制韋恩圖，兩者交集即為澳洲茄堿-腫瘤共同靶點。將澳洲茄堿潛在靶點和澳洲茄堿-腫瘤共同靶點輸入Cytoscape3.7.2軟件中，繪制“疾病-靶點-成分”相互作用網絡圖。

1.4 澳洲茄堿-腫瘤蛋白相互作用網絡構建及基于聚類分析的核心靶點篩選 將澳洲茄堿-腫瘤共同靶點輸入STRING 數據庫（https://string-db.org/）中檢索，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，將獲取的靶點相互作用網絡關系數據導入Cytoscape3.7.2 軟件，繪制蛋白相互作用網絡圖（PPI 網絡）。將PPI 網絡導入Cystoscap3.7.2，使用MCODE 模塊進行基因簇的分析以及核心靶點的篩選。

1.5 澳洲茄堿-腫瘤基因功能及通路富集分析 基于R3.6.0 軟件用Bioconductor 生物信息軟件包，以P<0.05、Q<0.05 進行關鍵靶基因GO 功能與KEGG通路富集分析，對澳洲茄堿-腫瘤共同靶點進行生物學功能及主要信號通路分析，將結果以條形圖或氣泡圖形式輸出。

2 結果

2.1 澳洲茄堿潛在抗腫瘤作用靶點信息 共獲得289 個澳洲茄堿潛在靶點，1186 個腫瘤靶點，韋恩圖中兩者取交集后獲得79 個澳洲茄堿-腫瘤共同靶點（見圖1）。將此79 個共同靶點和澳洲茄堿潛在靶點輸入Cytoscape3.7.2 軟件中，繪制出“疾病-靶點-成分”相互作用網絡圖，圖中紅色代表疾病，紫色代表澳洲茄堿，藍色代表79 個共同靶點（見圖2）。

圖1 澳茄堿洲-腫瘤靶點基因匹配情況

圖2 澳洲茄堿與腫瘤作用靶點網絡

2.2 PPI 分析結果及澳洲茄堿抗腫瘤核心靶點信息PPI 網絡見圖3，共有79 個節點（靶基因）通過968條邊發揮作用。節點的大小、顏色及其深淺變化代表Degree 值的大小。實驗結果表明，澳洲茄堿抗腫瘤的各個靶點之間聯系緊密。進一步聚類分析篩選得到3個基因簇和3 個核心基因：IGF1R、MAP2K1、CHEK1，見圖4。

圖3 PPI 關系網絡

圖4 PPI 核心基因簇

2.3 GO 功能富集分析 將79 個澳洲茄堿-腫瘤共同靶點經R 語言運行后進行GO 分析，包括生物學過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和 分 子 功 能（molecular function，MF）。GO 結果顯示，共富集至1559 條生物學過程、33 條細胞組成過程和116 條分子功能過程中。根據P 值，將前10 個條目進行數據可視化處理形成條形圖（見圖5）。結果表明，澳洲茄堿可能通過參與調控多種與腫瘤發生發展關系密切的生物學過程來發揮抗腫瘤作用。

圖5 澳洲茄堿-腫瘤關鍵靶點的GO 生物學過程富集分析

2.4 KEGG 富集分析 對79 個澳洲茄堿-腫瘤共同靶點經R 語言運行后進行KEGG 通路富集分析，得到136 條KEGG 通路，包括前列腺癌、大腸癌、肝細胞癌、乳腺癌、胃癌、慢性粒細胞白血病、膀胱癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、胰腺癌等通路，涉及PI3KAkt 信號通路、MAPK 信號通路、Ras 信號通路、ErbB信號通路、VEGF 信號通路、T 細胞受體信號通路等經典信號通路。排名前20 的有蛋白聚糖、前列腺癌、內分泌抵抗、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、Ras 信號通路、乙型肝炎、雌激素信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、松弛素信號通路、FoxO 信號通路、大腸癌、催乳素信號通路、肝細胞癌、粘附連接、乳腺癌、Rap1 信號通路、胃癌、慢性粒細胞白血病、膀胱癌通路。由此推測，澳洲茄堿可能通過調節以上信號通路來發揮抗腫瘤作用。根據P 值，將排名前20 的結果形成KEGG 功能富集的氣泡圖（見圖6）。通過通路基因參與數、P 值及富集因子分析，前9 通路相關基因靶點見表1。

圖6 澳洲茄堿-腫瘤關鍵靶點的KEGG 代謝通路富集分析

表1 澳洲茄堿-腫瘤關鍵靶點的KEGG 代謝通路富集靶點

3 討論

中藥的活性化合物是藥物最佳來源之一，但人們對其作用靶點和機制了解不深[6]，采用計算方法重新定位受體中的藥物分子正成為藥物研發主流[7]。中藥龍葵對多種腫瘤均有顯著抗癌療效[8]，澳洲茄堿為主要活性成分，但其具體作用靶點及機制并未完全明確。網絡藥理學作為分析中藥作用機制的新興學科，包含網絡構建、網絡分析及實驗驗證，為闡明中藥現代藥理機制提供了新方法[9]。

本研究依據網絡藥理學，對澳洲茄堿抗腫瘤潛在作用靶點及通路進行了較系統分析。結果共篩選出79 個抗腫瘤相關靶點，其中3 個核心基因為IGF1R、MAP2K1 和CHEK1。IGF1R 調控細胞生長和分化[10]，刺激細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡，與腫瘤發生發展及轉移關系密切[11]。MAP2K1 則參與增殖、分化、轉錄調節和發育等許多細胞過程[12]。CHEK1 介導細胞周期阻滯、應對DNA 損傷，是癌癥治療潛在靶點[13]。在澳洲茄堿抗腫瘤信號通路中，PI3K-Akt、MAPK 及Ras 與腫瘤發病機制關系密切。PI3K-Akt參與調控癌細胞的增殖、存活、轉錄、翻譯和代謝等過程[14]。Ras/MAPK 是胞內傳導主要途徑，在胚胎生長、細胞分化中發揮重要調控作用。Ras 和PI3K 與細胞增殖緊密相關，通過調控下游mTOR 在調控細胞生長方面發揮關鍵作用。Ras-PI3K 及其激活的mTOR 信號通路涉及多個癌基因與抑癌基因的激活和失活，是當下腫瘤研究熱點[15]。由此可見，澳洲茄堿抗腫瘤的作用靶點及作用機制與上述3 個核心基因和PI3K-Akt、MAPK 及Ras 等信號通路關系密切。

綜上所述，澳洲茄堿參與多個生物學過程和信號通路，抗腫瘤核心靶點為IGF1R、MAP2K1 和CHEK1，核心信號通路為PI3K-Akt、MAPK 及Ras，提示澳洲茄堿具“多靶點-多通路”作用機制。