海洋貝類Toll樣受體及其接頭蛋白MyD88的分子進化研究*

王 璐 產久林 李 倩 張琳琳①

海洋貝類Toll樣受體及其接頭蛋白MyD88的分子進化研究*

王 璐1, 2, 3, 4產久林1, 2, 3李 倩1, 2, 3, 4張琳琳1, 2, 3①

(1. 中國科學院海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室 青島 266071; 2. 中國科學院海洋大科學研究中心 青島 266071; 3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生物學與生物技術功能實驗室 青島 266237; 4. 中國科學院大學 北京 100049)

海洋貝類在長期的進化過程中具備了復雜和獨特的免疫體系, 為免疫防御系統的適應性進化研究提供了典型實例。目前海洋貝類天然免疫系統經典分子在后生動物演化歷程中的特點尚不明確。為探究模式識別受體Toll樣受體(TLR)及其接頭分子髓樣分化因子(MyD88)基因家族在后生動物中的進化歷程, 研究了32個后生動物演化代表性物種中TLR及MyD88基因家族的系統發育關系, 以長牡蠣為代表物種探討了長牡蠣和在病原感染、環境脅迫、早期發育和組織分化條件下的基因表達模式。結果表明, 海洋貝類中普遍存在TLR和MyD88基因家族的擴張, 在腹足類和雙殼類中檢測到兩個基因家族譜系特異性的基因擴張, 46個長牡蠣特異性擴張的基因能夠被病原誘導表達, 且在不同類型的病原感染下, 其表達模式具有特異性。和病原誘導表達的相比, 參與牡蠣早期發育的起源相對古老。研究結果表明, 海洋貝類天然免疫模式識別受體TLR及其接頭分子MyD88通過基因復制和表達分化形成了復雜特異的信號傳導通路, 這有助于深入了解海洋貝類的天然免疫防御系統的特點, 豐富后生動物天然免疫進化的脈絡。

分子進化; TLR信號通路; 天然免疫; 功能分化; 軟體動物; 長牡蠣

地球上的生物面臨復雜的選擇壓力, 比如溫度、鹽度、含氧量等環境因素, 以及病毒、細菌和寄生蟲等病原因素, 這些壓力也成為宿主適應環境并進化的主要驅動力(Howard, 1991)。其中, 免疫系統是生物在長期進化過程中形成的, 生物體內一系列的生物學結構和過程組成的病原防御系統, 可以分為天然免疫和適應性免疫。天然免疫普遍存在于各種生物體內, 是一種快速、廣泛的免疫反應, 通過模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識別微生物, 而適應性免疫是一種復雜、專一的免疫反應, 可以通過形成記憶細胞產生持久的免疫應答。大多數無脊椎動物缺乏基于經典抗體和記憶細胞的適應性免疫(Litman, 2005), 僅依靠天然免疫進行機體防御。隨著研究的深入, 研究者們發現無脊椎動物基因組中存在豐富的功能性免疫分子, 它們可能以不同于脊椎動物的機制賦予無脊椎動物免疫“特異性” (章躍陵等, 2005)。

免疫識別是宿主識別異己成分、啟動免疫反應的第一步, 在無脊椎動物先天免疫應答過程中起著至關重要的作用。PRRs識別并結合目標病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)后, 免疫反應被啟動。Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)是經典的天然免疫模式識別受體, 是天然免疫系統中一類重要的蛋白, 最早在果蠅胚胎發育的相關研究中被發現, 隨后被證實在抗感染免疫方面發揮重要的作用, 從而為一系列天然免疫識別分子的發現打下基礎(Lemaitre, 1997)。TLR屬于Ⅰ型跨膜蛋白, 胞外具LRR結構域能夠識別多種病原, 胞內則以TIR結構域招募不同的受體分子并與之作用激活下游信號通路。TLR信號通路通過一系列分子作用將免疫信號向下傳遞最終誘導發生細胞免疫反應, 釋放各種細胞因子和干擾素來消除病原微生物。MyD88分子是TLR一類重要的接頭蛋白(Akira, 2001), 該蛋白含有TIR結構域, 能夠與TLR的TIR結構域相互作用, 在TLR介導的天然免疫信號通路中起著至關重要的作用。當TLR接收到外界刺激時, 通過信號級聯放大激活NF-κB等下游信號分子參與天然免疫過程(Medzhitov, 1998)。

海洋貝類暴露在復雜多變的海水環境中, 強大的免疫防御系統對其適應環境具有重要的生態學意義。近年來, 大量的研究表明TLR信號通路在生物免疫防御中具有重要的作用(Akira, 2001; Coscia, 2011)。已有研究發現, 海洋貝類中基因存在明顯的擴張現象(Goodson, 2005; Zheng, 2005; Zhang, 2014), 但目前研究多聚焦于單個基因的分子免疫或單個物種的基因家族特點研究, 而對于整個海洋貝類類群中天然免疫信號通路的分子演化研究較少。本文聚焦于海洋貝類中TLR通路的關鍵組分、模式識別受體TLR及其接頭分子MyD88, 欲探討這兩個基因家族的分子進化歷程和在不同病原誘導下的基因表達模式, 這有助于擴展我們對TLR信號通路的認識, 為深入了解海洋無脊椎動物天然免疫多樣性和特異性提供基礎。

1 材料與方法

1.1 基因組下載與TLR基因鑒定

基于NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫獲得32個物種基因組數據, 這32個物種是物種演化過程中的代表性物種, 包括櫛水母()、堡礁海綿()、新星海葵()、水螅()、三帶黑豹蠕蟲()、海豆芽()、水蛭()、小頭蟲()、石鱉()、中國真蛸()、加州海兔()、福壽螺()、紅鮑螺()、貓頭鷹帽貝()、魁蚶()、歐洲扇貝()、紫扇貝()、櫛孔扇貝()、蝦夷扇貝()、沼蛤()、馬氏珠母貝()、美洲牡蠣()、長牡蠣()、悉尼巖牡蠣()、秀麗隱桿線蟲()、黑腹果蠅()、西方蜜蜂()、海星()、紫色球海膽()、斑馬魚()、小鼠(Mus musculus)和人(), 并分別在每個物種的基因組中進行TLR信號通路基因的鑒定。從Pfam蛋白質數據庫(http://pfam.xfam.org/)分別下載TIR結構域(PF01582)、LRR結構域(PF13855)、Death結構域(PF00531)、SAM結構域(PF00536)、Arm結構域(PF00514)、TPR結構域(PF13176)、EGF結構域(PF00008)、IG結構域(PF13895), 然后通過基于隱馬爾可夫模型的hmmsearch對各物種基因組中可能的、、、、、、基因進行檢索, 獲得TLR信號通路基因序列。利用已獲得的基因序列作為種子序列, 利用Tblastn的方法在全基因組范圍內進一步尋找未鑒定出的基因。由LRR和TIR結構域組成,由Death結構域和TIR結構域組成,由SAM結構域和TIR結構域組成,由Arm結構域和TIR結構域組成,由IG結構域和TIR結構域組成,由TPR結構域和TIR結構域組成,由EGF結構域和TIR結構域組成。通過SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)和InterProScan (https://www.ebi.ac.uk/interpro/search-/sequence/ )對已鑒定的TLR通路基因的蛋白結構域進行分析和確認, 結構域對比結果evalue>1e-5時認為具有可信度。正確的TLR通路蛋白應該由完整結構域組成, 且具有較高的序列保守度。對于編碼結構域不完整的和基因, 我們首先利用GeneWise (Ewan, 2004)在基因組層面對基因進行矯正, 如果矯正不到完整的基因結構則不計入本文的研究范疇。

1.2 系統發育分析

獲取各物種TLR蛋白全長中保守的TIR結構域, 通過ClustalW (Thompson, 1994)對TIR蛋白序列進行對比分析, 并利用trimAl (Capella- Gutiérrez, 2009)進行對比分析結果的優化, 最后基于兩種不同算法對TIR進行建樹, 并從中選擇支持率最高的分子進化樹模型。第一種方法是利用IQ-TREE (Nguyen, 2015)基于最大似然法(Maximum Likelihood Method, ML)對基因進行系統發育分析, IQ-TREE可以自動測試和選擇最佳替代模型; 第二種方法是利用MEGA7 (Kumar, 2016)基于鄰接法(Neighbor Joining Method, NJ)對基因進行系統發育分析, 嘗試各種模型后, 根據樹形的可靠程度選擇最適模型進行建樹, 本文中使用的模型為p-distance。構建的進化樹都使用自展法(Bootstrap)檢測置信度, 重復數為1 000。系統發育樹用ITOL (https://itol.embl.de/index. shtml) (Letunic, 2016)進行可視化。

1.3 基因表達分析

利用長牡蠣在不同條件下的轉錄組表達數據來研究海洋貝類的分子進化。第一套轉錄組數據是長牡蠣在不同發育階段、不同成體器官組織和不同脅迫處理條件下的轉錄組表達數據(NCBI登錄號: GSE31012), 這些轉錄組數據主要來自8個器官(外套膜、鰓、閉殼肌、消化腺、血細胞、唇瓣、雌性和雄性性腺)、38個發育階段和各種非生物脅迫, 包括5、10、15、25、30、35 °C的梯度溫度脅迫, 5、10、15、20、25、40的梯度鹽度脅迫, 饑餓、缺氧的干露脅迫和鋅、鎘、銅、汞、鉛的重金屬脅迫; 第二套轉錄組數據是長牡蠣在不同致病弧菌(鰻弧菌、塔氏弧菌、河口弧菌、溶藻弧菌、滕黃微球菌)和四種弧菌等量混合物(鰻弧菌、塔氏弧菌、河口弧菌、溶藻弧菌)、LPS( Lipopolysaccharide)、牡蠣皰疹病毒(Ostreid Herpevirus-1, OsHV-1)脅迫下的樣品表達數據(NCBI登錄號: SRP019967)。

RPKM計算。獲得RNA-seq的原始數據后, 用Topha將所有測序讀段通過序列映像定位到參考基因組上, 這是后續處理和分析的基礎(Trapnell, 2009)。RPKM (reads per kilo bases per million reads)是每百萬讀段中來自于某基因每千堿基長度的讀段數。

RPKM=基因區讀段計數×109/(基因長度×比對上的參考序列的讀段總數). (1)

差異基因篩選。差異表達基因的識別參考Chen等(2010)的文章進行。FDR值( False discovery rate)作為值的檢測指標評價某基因在兩個轉錄組中是否有表達差異, 本研究中, FDR閾值設定為0.01。篩選在牡蠣病毒OsHV-1、LPS、鰻弧菌、塔氏弧菌、河口弧菌、溶藻弧菌、滕黃微球菌、四種弧菌混合物、非生物因素(溫度、鹽度、干露、重金屬)脅迫下的差異表達基因。差異基因的選取主要包含兩個要求: (1) 要求差異基因在一半以上處理組中有相同的上調或下調表達趨勢(和對照組比較)并且FDR均小于0.01; (2) 有些基因雖然有差異表達, 但其在不同條件下的表達量都很低(對照組和處理組RPKM均<1), 這種基因不算作差異表達基因。

通過以上方法我們得到在不同脅迫下差異表達以及在特定時期、器官特異性表達的和基因。將系統進化分析與基因表達分析相結合, 探究海洋貝類TLR和其接頭蛋白的分子進化。

2 結果與分析

2.1 海洋貝類TLR信號通路關鍵分子的擴張

為了在物種演化的背景下探討TLR信號通路的進化模式, 我們基于NCBI公共數據庫獲得29個無脊椎動物以及其他3個脊椎動物(斑馬魚、小鼠、人)的基因組, 并從中鑒定TLR信號通路成員(圖1)。通過分析, 我們發現在不同的物種中,基因及其下游接頭分子(、、、、、)的數量存在著較大的差異。在較原始的櫛水母和多孔動物中沒有鑒定到含有經典結構域的基因, 只鑒定出了基因; 刺胞動物新星?？需b定出基因和下游的基因, 但數量較少; 在兩側對稱的扁形動物中只鑒定到、兩個接頭分子而沒有發現經典結構域的基因。然而, 在冠輪動物中TLR通路基因存在明顯的擴增現象, 包括基因及其下游的接頭分子。在美洲牡蠣、長牡蠣、馬氏珠母貝中分別發現130、96、83個基因, 在蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、長牡蠣中分別發現23、13、10個基因, 說明TLR信號通路的擴張現象普遍存在于海洋貝類中。無脊椎動物中另一個較明顯的TLR擴張現象發生在海膽中, 紫海膽()中存在222個基因, 但TLR信號通路下游的接頭分子并不存在擴張現象。

圖1 物種樹及對應TLR通路基因數目

注: Mle: 櫛水母; Aqu: 堡礁海綿; Nve: 新星?？? Hvu: 水螅; Hmi: 三帶黑豹蠕蟲; Lin: 海豆芽; Hro: 水蛭; Cte: 小頭蟲; Aca: 石鱉; Osi: 中國真蛸; Apl: 加州海兔; Pom: 福壽螺; Hru: 紅鮑螺; Lot: 貓頭鷹帽貝; Sbr: 魁蚶; Pma: 歐洲扇貝; Apu: 紫扇貝; Cfa: 櫛孔扇貝; Mye: 蝦夷扇貝; Lfo: 沼蛤; Pfu: 馬氏珠母貝; Cvi: 美洲牡蠣; Cgi: 長牡蠣; Sgl: 悉尼巖牡蠣; Cel: 秀麗隱桿線蟲; Dme: 黑腹果蠅; Ame: 西方蜜蜂; Ap: 棘冠海星; Spu: 紫色球海膽; Dre: 斑馬魚; Mmu: 小鼠; Hsa: 人

2.2 軟體動物TLR的系統演化

軟體動物基因可以根據結構域類型分為五類: V (Vertebrate-type TLR, 脊椎動物類), P (Protostome-like TLR, 原口動物型, 具有LRRCT和LRRNT胞外結構域), sP (不含LRRCT-LRRNT胞外結構域的短原口動物類)、sPP (含LRRCT-LRRNT胞外結構域的短原口動物類)和Ls (具LRRCT特異性胞外結構域) (Zhang, 2015)。為了更好地了解軟體動物TLR基因家族的整體結構和系統演化, 將9種軟體動物(多板綱: 顆粒棘石鱉; 頭足綱: 中國真蛸; 腹足綱: 海蝸牛、福壽螺、貓頭鷹帽貝; 雙殼類: 櫛孔扇貝、馬氏珠母貝、美洲牡蠣、長牡蠣)和2種外群動物(腕足動物海豆芽、環節動物小頭蟲)中鑒定得到的基因基于TIR結構域序列構建最大似然樹(圖2)。從圖2可以看到, 軟體動物中雙殼類和腹足類發生明顯的擴張現象, 雙殼類的擴張可以大體分為五支, 且大多是譜系特異性擴張, 與腹足類呈現相對獨立的關系。根據腹足綱和雙殼類的結構域注釋我們發現這兩類軟體動物的擴張大多為sP類型, 在504條中76.2%為sP-這種sP型主導且相對獨立發生的擴張證實了牡蠣基因的特異性擴張, 可能在宿主防御中發揮重要功能。

圖2 軟體動物TLR基因的系統發育樹(基于最大似然法)

注: 基因ID不同底色代表相應物種, 色帶與分支顏色代表軟體動物結構域分類

注: Lin: 海豆芽; Cte: 小頭蟲; Aca: 石鱉; Osi: 中國真蛸; Apl: 加州海兔; Pom: 福壽螺; Lot: 貓頭鷹帽貝; Cfa: 櫛孔扇貝; Pfu: 馬氏珠母貝; Cvi: 美洲牡蠣; Cgi: 長牡蠣

2.3 MyD88在軟體動物的系統演化

通過分析, 我們也在軟體動物的接頭分子MyD88中檢測到顯著的擴張現象。MyD88整個結構由3個功能結構域組成, 包括C端的TIR結構域、中間域及N端的Death結構域, 是軟體動物TLR受體信號向下游傳導的核心分子。為了豐富對TLR信號通路的了解, 本文將選取的9種軟體動物及2種外群動物鑒定得到的基因通過TIR結構域序列構建最大似然樹(圖3)。圖3的結果表明, 腹足綱與雙殼類的擴張是相對獨立的, 其中腹足綱擴張的可以分為三支, 腹足類-1與腹足類-3兩支譜系特異性擴張, 腹足類-2這一支與海豆芽、雙殼貝類聚在一起, 可能是協同演化的結果。而雙殼類擴張的可以主要分為兩支, 這兩支都屬于譜系特異性擴張。在軟體動物雙殼類、腹足綱中的譜系特異性擴張現象也進一步證明了軟體動物TLR信號通路的特異性。

圖3 軟體動物MyD88基因的系統發育樹(基于最大似然法)

注: Lin: 海豆芽; Cte: 小頭蟲; Aca: 石鱉; Osi: 中國真蛸; Apl: 加州海兔; Pom: 福壽螺; Lot: 貓頭鷹帽貝; Cfa: 櫛孔扇貝; Pfu: 馬氏珠母貝; Cvi: 美洲牡蠣; Cgi: 長牡蠣

2.4 長牡蠣TLRs在脅迫環境以及早期發育時期的基因表達模式

潮間帶地區的溫度、鹽度和含氧量等在每日間的變化極大, 而雙殼類長牡蠣營潮間帶生活, 受到眾多的環境選擇壓力, 是研究無脊椎動物TLR信號通路的絕佳對象, 我們通過NJ法構建長牡蠣TLRs系統發育樹, 并利用各種長牡蠣轉錄組數據探究TLRs的演化與功能(圖 4)。結果顯示, 長牡蠣基因組中存在83個基因, 其中包含5個V型、2個P型、63個sP型、2個sPP型和8個Ls型, 其中sP類型的根據進化樹可以分為兩大支, 且擴張最廣。

對不同脅迫處理下長牡蠣的轉錄組數據進行篩選和差異表達分析, 我們獲得大量的差異表達基因-。共有21個在生物和非生物脅迫下顯著下調表達, 46個在生物和非生物脅迫下顯著上調表達。我們重點關注在脅迫條件下上調表達的基因, 如圖4所示, 在牡蠣病毒OsHV-1、LPS、弧菌、革蘭氏陽性菌(藤黃微球桿菌)的脅迫刺激下, 分別有4、6、33、4個顯著上調表達; 在非生物因素(溫度、鹽度和干露)脅迫下, 5個顯著上調表達。通過分析發現, 有41個只在生物脅迫下特異性高表達, 2個只在非生物脅迫下特異性高表達, 不同的在響應外界脅迫時具有一定的特異性。除此之外有4個在特定的發育時期表達, 27個存在組織特異性表達, 尤其傾向于在唇瓣、鰓、血液高表達。

圖4 長牡蠣TLRs的鄰接進化樹及其在生物、非生物脅迫環境和發育過程中的表達分化

注: 不同顏色符號分別代表在不同條件下的顯著上調基因, 綠色-生物脅迫, 紅色-非生物脅迫, 藍色-特定時期高表達, 橘色-特定組織高表達

2.5 長牡蠣MyD88s在脅迫環境以及早期發育時期的基因表達模式

對長牡蠣進行系統發育與表達分析(圖5), 長牡蠣中共鑒定出10個, 其中6個具有典型的Death-TIR結構域組合, 4個僅具有TIR結構域。7個串聯重復的分布在三個scaffold, 在系統發育樹上分別聚類。

共有8個在生物和非生物脅迫下顯著下調表達, 7個在生物和非生物脅迫下顯著上調表達。如圖5所示, 在OsHV-1病毒、LPS、弧菌、革蘭氏陽性菌的脅迫刺激下, 分別有4、1、7、1個顯著上調表達; 而在溫度、鹽度、干露、重金屬的脅迫刺激下, 分別有4、6、5、7個顯著上調表達。大部分對生物和非生物脅迫敏感, 7個在生物因素和非生物因素刺激下都上調表達。而ID為OYG_ 10026174_10008756的只在弧菌誘導下上調表達但對非生物刺激不敏感; OYG_10007490_10008864在鰓、消化腺受到重金屬脅迫時上調表達但對生物脅迫沒有響應。此外有3個在特定的發育時期高表達, 其中2個在D時期特異高表達, 1個在T時期特異高表達; 4個存在組織特異性表達, 尤其傾向于在血液高表達。

圖5 長牡蠣MyD88s的鄰接進化樹及其在生物、非生物脅迫環境和發育過程中的表達分化

注: 不同顏色符號分別代表在不同條件下的顯著上調基因, 綠色-生物脅迫, 紅色-非生物脅迫, 藍色-特定時期高表達, 橘色-特定組織高表達

3 討論

3.1 TLR通路在海洋貝類中的顯著擴張

TLR介導的天然免疫信號通路是對外來病原體的響應機制, 主要的功能就是識別病原體, 通過一系列分子作用將免疫信號向下傳遞最終誘導發生細胞炎癥反應, 釋放各種細胞因子和干擾素來消除病原微生物。有關TLRs的研究幾乎涵蓋動物界的所有門類, 從簡單的海綿動物到復雜的哺乳動物都有TLR及其同系物的相關報道, 因此認為其是最古老的模式識別受體之一(Coscia, 2011)。雖然目前在所有海綿動物門類中都沒有發現含經典LRR結構域和TIR結構域的TLR基因, 但已經發現TIR蛋白到NF-kB的MyD88依賴下游信號存在于海綿動物中(Brennan, 2018)。前期的研究表明, 在海洋貝類基因組中天然免疫相關基因家族均存在不同程度的擴張現象(Imamura, 2002; Goodson, 2005; Zheng, 2005; Wang, 2011; Zhang, 2014), 進而增強其對病原體的天然免疫功能(Zhang, 2012; Zhang, 2015)。例如, 在長牡蠣基因組中注釋得到了83個序列, 其中19個在病毒和細菌的刺激下差異表達(Zhang, 2015)。然而, TLR信號通路在海洋貝類中的系統演化關系并沒有得到很好的梳理。因此, 本研究以海洋貝類為主要研究對象, 基于基因組和轉錄組數據, 結合生物信息學手段, 研究海洋貝類TLR和其接頭蛋白MyD88s的分子進化, 有助于擴展我們對TLR信號通路的認識, 為深入了解海洋貝類天然免疫多樣性和特異性提供基礎。

本研究基于生物演化過程中32個代表性物種的基因組序列, 對TLR信號通路中相關基因進行了篩選和鑒定。其中, 在美洲牡蠣、長牡蠣、馬氏珠母貝中分別發現130、96、83個基因, 表明TLR信號通路的擴張現象普遍存在于海洋貝類中, 并進一步證實了TLR信號通路在海洋貝類中的顯著擴張事件(圖1)。此外, 在本研究中我們還發現TLR通路其他相關基因在海洋貝類中同樣存在擴張現象(圖1)。MyD88作為TLR通路中關鍵的接頭分子, 在大多數海洋貝類中均能鑒定到其擴張現象, 其中在蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、長牡蠣中分別發現23、13、10個基因, 這揭示了MyD88依賴型TLR信號通路在海洋貝類天然免疫系統中的保守性、重要性和關鍵性, 同時提示海洋貝類基因組在進化中積累了相對較多的防御系統基因資源以適應復雜多變的環境(Zhang, 2015; Guo, 2016)。

3.2 海洋貝類TLRs和MyD88s擴張起源

在長期進化過程中, 海洋貝類已進化出獨特的免疫防御體系, 如通過免疫基因的大量擴張等策略來適應環境。前期的研究表明, 串聯復制等多種機制是基因家族擴張的主要途徑, 包括脊椎動物的和基因、海膽的基因、文昌魚的基因和淡水蝸牛的基因在內的基因家族擴張事件均已被證實與基因的串聯重復相關(Hanington, 2010)。

在本文中, 我們發現在海洋貝類基因組中TLR通路相關基因存在顯著的基因擴張現象, 然而其擴張的起源和機制仍不清楚。因此, 我們以海洋貝類代表種長牡蠣為研究對象, 通過對其TLRs和MyD88s的系統進化分析, 試圖闡明TLR通路相關基因在海洋貝類中的擴張起源和機制。結果顯示和的擴張均表現為譜系特異性, 并且的擴張大多來源于的串聯重復事件(圖2, 3), 揭示了這些免疫分子是通過基因串聯復制和譜系特異性擴張途徑完成適應性進化的。此外, 結合長牡蠣轉錄數據分析, 發現不同環境因子脅迫下長牡蠣差異表達的和大多為串聯重復基因并且這些差異表達基因偏向于在基因組多拷貝并呈現高度分化, 結合軟體動物系統發育分析推測其多為長牡蠣特異的新基因。這可能暗示了在海洋貝類祖先物種中, 應激調控基因(例如等免疫防御基因)受到更大的環境選擇壓力, 并發生多次復制事件, 以提供更多的基因資源幫助海洋貝類適應生存環境。

此外, 在研究中我們還發現在紫海膽中基因顯著擴張, 但下游只有3個基因, 暗示著紫海膽增加了天然免疫識別的特異性, 但在信號傳導通路上仍是保守的。另一方面, 這種演化模式與部分貝類中的與協同擴張并不一致, 也再次揭示海膽和貝類中TLR的擴張可能是獨立演化而來。

3.3 TLRs和MyD88s功能演化研究

TLR作為天然免疫受體, 能夠識別病原微生物的PAMPs, 并通過其TIR結構域招募下游信號分子或接頭蛋白, 從而激活機體的免疫防御等(Kirschning, 2001)。前期研究表明, TLR蛋白在結構功能上是比較保守的, 但是他們在所識別的PAMPs上卻存在著較大的差異(Oshiumi, 2008)。本研究中, 我們通過對不同環境因子脅迫下長牡蠣的轉錄組數據進行分析, 獲得大量的差異表達, 初步表明TLR基因家族在參與海洋貝類機體防御方面發揮重要作用。此外, TLRs被證明在識別PAMPs的進化方面相對保守, 識別的PAMPs從病毒、細菌、真菌到寄生蟲, 并且表現出較強的目標特異性(Underhill, 1999; Campos, 2001; Hoebe, 2003; Meier, 2003)。

在本文中, 基于不同環境脅迫下長牡蠣的轉錄組數據, 我們檢測到33個特異性識別生物因素脅迫, 2個特異性識別非生物脅迫, 表現為不同種類的TLRs應對不同類型的外界脅迫(圖4)。有趣的是, 我們發現具有組織表達特異性, 大部分在免疫組織中高表達, 比如唇瓣、鰓、血液等(圖4), 這與之前對櫛孔扇貝的表達研究相一致(Qiu, 2007)。結合軟體動物基因系統發育分析(圖2), 我們還發現這些免疫相關組織特異性高表達的多為長牡蠣特異的新基因。另外, 前期對蚯蚓()的研究中發現能參與調控蚯蚓的發育過程(?kanta, 2013), 而相似類型的與也被發現存在于中(圖4), 并且僅在長牡蠣特定的發育時期特異性高表達, 表明在長牡蠣中參與調節發育的基因起源相對古老。這也揭示了在長牡蠣中發生功能分化, 參與機體發育相關的起源相對古老, 而參與免疫調節相關的多屬于特異擴張的新基因。

MyD88是TLR信號通路中重要的接頭蛋白, 通過信號級聯放大激活NF-κB信號通路參與天然免疫過程(Medzhitov, 1998), 并在海洋貝類TLR信號通路及天然免疫中發揮至關重要的作用。前人的研究發現, 厚殼貽貝經沙氏弧菌感染后,基因表達量在免疫相關的特異性組織中急劇上升(梁簫等,2019), 類似的結論在魁蚶中也得到驗證(黃永歡, 2016)。在本研究中, 對不同環境因子脅迫下長牡蠣轉錄組中的表達分析進一步證實其免疫功能的特異性, 如圖5所示,基因(OYG_10026174_10008756)僅在溶藻弧菌誘導下特異性上調表達, 而基因(OYG_10007490_10008864)僅在重金屬脅迫下特異性上調表達。同時, 我們還發現處在同一串聯重復簇上的可能對不同的環境脅迫表現為差異性的響應模式, 揭示了免疫功能的明顯分化。另外, 與類似,除了應對外界脅迫, 也參與調節長牡蠣的發育過程, 并且傾向于在血淋巴中高表達, 而血淋巴是長牡蠣中重要的免疫場所, 暗示了其在海洋貝類免疫反應中發揮著重要作用(Matozzo, 2007)。

4 結論

本文探究Toll樣受體及其接頭蛋白MyD88s在海洋貝類中的分子和功能演化機制, 揭示了TLR通路相關基因在海豆芽、福壽螺、長牡蠣、馬氏珠母貝等貝類中存在顯著擴張現象, 并且在腹足類和雙殼類中均是譜系特異性的擴張。此外, 結合海洋貝類代表種長牡蠣的脅迫轉錄組數據, 本文進一步探討了海洋貝類代表物種長牡蠣中及表達特異性分化的分子進化過程, 結果表明發育時期差異表達的基因起源相對古老, 而海洋雙殼貝類特異性擴張的基因能夠被病原感染激活, 且對不同的病原感染表達模式具有特異性。海洋貝類通過串聯重復和譜系特異性擴張賦予海洋貝類天然免疫系統特異性和復雜性, 這些結果不僅豐富了我們對海洋貝類TLR信號通路功能的理解, 也為后期深入探索無脊椎動物免疫系統提供理論基礎。然而, 本文主要以長牡蠣作為海洋貝類的代表進行研究, 還需更多的海洋貝類數據支持來豐富海洋貝類TLR通路的分子進化研究。

致謝 本文獲得中國科學院海洋研究所海洋大數據中心的支持, 謹致謝忱。

黃永歡, 2016. 魁蚶MyD88、CAT和GST的克隆及功能分析. 上海: 上海海洋大學碩士學位論文, 1—62

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EVOLUTIONARY HISTORY OF THE TOLL-LIKE RECEPTOR AND MYD88 IN MOLLUSCS

WANG Lu1, 2, 3, 4, CHAN Jiu-Lin1, 2, 3, LI Qian1, 2, 3, 4, ZHANG Lin-Lin1, 2, 3

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

To adapt to a wide range of pathogenic environment, marine molluscs have developed a unique innate immune system in evolution. The toll-like receptors (TLR) and their adaptor MyD88 are ancient molecular components in animals and are best known for their roles in defense against pathogenic microorganisms. To deepen understanding of mollusk TLR signaling pathway, the evolutionary history of molluscan TLR and its adaptor MyD88 in 32 species was studied, and the gene expression patterns ofandinunder different conditions were explored. Molluscs expanded genes coding for TLR and MyD88 extensively as shown in phylogeny analysis. In, 46 specifically expandedcould be activated by pathogens, and their expression patterns were specific to the types of pathogen infection. Compared with pathogen-induced, the origin ofinvolved in early development of oyster is relatively ancient in evolution. This study provided a basis for deep understanding of innate immunity of molluscs and the evolution of invertebrate innate immunity.

molecular evolution; TLR signaling pathway; innate immunity; functional divergence; molluscs;

* 中國科學院B類戰略先導科技專項, XDB42000000號; 國家自然科學基金面上項目, 41976088號; 中國科學院海洋大科學研究中心重點部署項目, COMS2019R01號; 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室引進人才支持計劃項目, YJ2019NO01號。王 璐, 碩士研究生, E-mail: wanglu@qdio.ac.cn

張琳琳, 研究員, E-mail: linlinzhang@qdio.ac.cn

2021-02-07,

2021-04-13

S917.4

10.11693/hyhz20210200041