長牡蠣(Crassostrea gigas)不同組織中蛋白酶的分布及冷藏過程中酶活力與鮮度變化*

章 騫 陳 宏 闕華勇 李鈺金 孫樂常 翁 凌 張凌晶 劉光明 曹敏杰

長牡蠣()不同組織中蛋白酶的分布及冷藏過程中酶活力與鮮度變化*

章 騫1, 2陳 宏1闕華勇2, 3李鈺金4孫樂常1, 2翁 凌1, 2張凌晶1, 2劉光明1, 2曹敏杰1, 2①

(1. 集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院 廈門 361021; 2. 水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 廈門 361021; 3. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廈門 361021; 4. 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 青島 266003)

以長牡蠣()為研究對(duì)象, 采用酶活力測定和Western blotting鑒定牡蠣不同組織中氨肽酶、胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶、組織蛋白酶等幾種主要蛋白酶的分布, 探討牡蠣肉在4 °C冷藏過程中酶活力和鮮度指標(biāo)的變化規(guī)律。結(jié)果顯示: 在牡蠣的外套膜、鰓、閉殼肌和性腺-內(nèi)臟團(tuán)四種組織中, 亮氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶、精氨酸氨肽酶均有較高酶活力; 胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶主要分布于性腺-內(nèi)臟團(tuán), 在另外三種組織中活性較低; 組織蛋白酶B和B+L絕大部分在性腺-內(nèi)臟團(tuán)中表達(dá)。在4 °C冷藏過程中, 酶活力發(fā)生明顯變化, 經(jīng)7 d冷藏后, 性腺-內(nèi)臟團(tuán)中亮氨酸氨肽酶的酶活力為初始值的25.15%, 丙氨酸氨肽酶的酶活力為初始值的31.65%, 精氨酸氨肽酶的酶活力為初始值的23.19%; 組織蛋白酶B和B+L的酶活力分別是初始值的2.59和4.23倍; 胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶酶活力上升44%。隨著冷藏時(shí)間的延長, 牡蠣的鮮度指標(biāo)發(fā)生變化: 牡蠣pH值呈現(xiàn)先降低, 9 d后上升的趨勢; 氨基酸態(tài)氮含量由初始的(0.26±0.05) g/100g增加至第7 d的(0.31±0.03) g/100g; 揮發(fā)性鹽基氮含量從(5.60±0.64) mg/100g上升至第7 d的(17.50±0.37) mg/100g; SDS-PAGE分析顯示, 牡蠣冷藏過程中四種組織的蛋白質(zhì)均發(fā)生了不同程度的降解。本研究揭示了牡蠣在短期冷藏過程中幾種主要蛋白酶和鮮度指標(biāo)的變化規(guī)律, 為牡蠣的冷藏保鮮提供了參考。

長牡蠣; 酶; 冷藏; 鮮度; 蛋白質(zhì)降解

牡蠣又名蠔, 其肉質(zhì)鮮嫩, 營養(yǎng)豐富, 在我國沿海地區(qū)均有養(yǎng)殖。2019年我國牡蠣產(chǎn)量達(dá)523萬t, 已成為海水養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的主養(yǎng)品類, 也是為數(shù)不多的保持量效齊增的主養(yǎng)水產(chǎn)品種(張國范等, 2020)。牡蠣加工產(chǎn)品主要有生鮮品、凍品、干制品、罐制品、調(diào)味品、休閑即食產(chǎn)品以及活性肽(何定芬等, 2020)、活性多糖(Cheong, 2017)等功能食品。

生鮮牡蠣肉保留了牡蠣原有的口感和營養(yǎng), 頗受消費(fèi)者喜愛。牡蠣采收后, 在開殼取肉、貯運(yùn)、銷售等環(huán)節(jié), 應(yīng)在低溫(0—4 °C)下進(jìn)行, 而且冷藏保鮮時(shí)間不宜超過7 d才能保持其良好的品質(zhì)。得益于我國低溫貯藏和冷鏈技術(shù)的發(fā)展, 牡蠣肉的保鮮期得到延長, 消費(fèi)地域也不斷擴(kuò)大。在低溫冷藏過程中, 影響牡蠣肉品質(zhì)的主要因素有內(nèi)源酶和微生物作用引起的糖原酵解、ATP降解、蛋白質(zhì)降解以及脂肪氧化導(dǎo)致的風(fēng)味下降等。內(nèi)源性蛋白酶以及微生物繁殖產(chǎn)生的胞外酶的作用會(huì)分解牡蠣肌肉蛋白質(zhì), 導(dǎo)致肌肉組織破壞, 而蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物——肽、氨基酸和低分子含氮化合物濃度的上升, 為微生物的進(jìn)一步生長繁殖提供了有利條件(章超樺等, 2014)。關(guān)于牡蠣的冷藏保鮮, 已有較多研究報(bào)道。基于微生物分析, 研究了殼聚糖在牡蠣冷藏期間的抗菌作用(Cao, 2009), 冰藏過程中牡蠣不同組織中ATP相關(guān)產(chǎn)物的變化情況也有報(bào)道(Yokoyama, 1992), 采用頂空固相微萃取和主成分分析法鑒定出貯藏過程中新鮮和劣化牡蠣的揮發(fā)性成分及其分布特征(Zhang, 2009), 不同冷凍方式和保鮮劑處理對(duì)牡蠣品質(zhì)的影響也被作了比較研究(Songsaeng, 2010)。

水產(chǎn)動(dòng)物肌肉中含有多種蛋白酶類, 如魚類死亡后由僵直進(jìn)入軟化自溶過程中, 對(duì)肌肉蛋白降解和游離氨基酸積累起重要作用的酶類主要有組織蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、氨肽酶等(章超樺等, 2018)。我國牡蠣產(chǎn)量逐年增加, 消費(fèi)區(qū)域不斷擴(kuò)大, 但是, 牡蠣在冷藏過程中蛋白質(zhì)的變化及與其密切相關(guān)的蛋白酶活力變化尚未有相關(guān)報(bào)道。

本研究以長牡蠣為實(shí)驗(yàn)材料, 比較牡蠣四種不同組織(外套膜、鰓、閉殼肌和性腺-內(nèi)臟團(tuán))中主要蛋白酶類的分布情況, 探明牡蠣肉在4 °C冷藏過程中酶活力和鮮度指標(biāo)變化規(guī)律, 旨在從內(nèi)源性蛋白酶的角度揭示牡蠣肉在短期(7 d)低溫冷藏過程中鮮度變化的機(jī)理, 為牡蠣的保鮮貯藏提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2019年3月, 從福建省廈門市夏商國際水產(chǎn)交易中心采購鮮活長牡蠣() [長(10.55±0.82) cm, 寬(5.34±0.38) cm, 帶殼重(98.73±8.42) g], 低溫運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。

兔抗真鯛亮氨酸氨肽酶多克隆抗體(Wu, 2008)、兔抗鮑組織蛋白酶L多克隆抗體(Shen, 2015)由本實(shí)驗(yàn)室制備; 標(biāo)準(zhǔn)蛋白、二硫蘇糖醇(DTT) (采購自美國Bio-Rad公司); 乙二胺四乙酸(EDTA) (采購自美國Sigma公司); 氨肽酶熒光底物(Leu-MCA, Ala-MCA, Arg-MCA)、胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶熒光底物(Boc-Phe-Ser-Arg-MCA)、組織蛋白酶熒光底物(Z-Phe-Arg-MCA, Z-Arg-Arg-MCA) (采購自日本Peptide Institute公司); 其他試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司, 均為分析純級(jí)別。

1.2 儀器與設(shè)備

本研究用到主要儀器包括: PT-2100組織搗碎機(jī)(瑞士Kinematica公司); WB-14恒溫水浴鍋(德國Memmert公司); Bio Photometer紫外分光光度計(jì)(美國Perkin Elmer公司); Avanti JA-26.5高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司); Agilent高效液相色譜儀(美國Agilent Technologies公司); pH計(jì)(德國Sartorius公司); FP-8200熒光分光光度計(jì)(日本Jasco公司); Mini-PIII電泳儀(美國Bio-Rad公司); G-BOX凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理 新鮮長牡蠣人工開殼取肉后用預(yù)冷海水清洗, 瀝干, 隨機(jī)分成21組, 每組5只, 并用密封袋包裝, 置于(4.0±0.5) °C冷庫冷藏。

1.3.2 蛋白酶活力的測定 取4 °C冷藏0、1、2、3、5、7 d牡蠣的四種不同組織(外套膜、鰓、閉殼肌和性腺-內(nèi)臟團(tuán)), 分別加入4倍的冰冷蒸餾水, 組織搗碎, 離心(10 000′, 15 min, 4 °C)取上清液, 分別進(jìn)行酶活力測定, 分析牡蠣不同組織中蛋白酶的分布。

氨肽酶(Aminopeptidase, AP)酶活力測定參照Zhang等(2013)的方法, 并作適當(dāng)修改。取50 μL上清液與900 μL 25 mmol/L PBS (pH 7.0, 含1mmol/L DTT)混合, 置于37 °C恒溫水浴鍋中, 加入50 μL 10 μmol/L的熒光底物(Leu-MCA, Ala-MCA, Arg-MCA)混勻。胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶(Serine Proteinase, SP)活力測定參照Cao等(1999)的方法。取50 μL上清液與900 μL 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)混合搖勻, 置于37 °C恒溫水浴鍋中, 加入50 μL 10 μmol/L的熒光底物(Boc-Phe-Ser-Arg-MCA)混勻。組織蛋白酶(Cathepsin)活力測定參照Barrett等(1981)的方法。取50 μL上清液與900 μL 25 mmol/L PBS (pH 6.0, 含1 mmol/L DTT, 1 mmol/L EDTA)混合, 置于37 °C恒溫水浴鍋中, 加入50 μL 10 μmol/L的熒光底物(組織蛋白酶B+L的熒光底物為Z-Phe-Arg-MCA, 組織蛋白酶B的熒光底物為Z-Arg-Arg-MCA)。以上各體系均在對(duì)應(yīng)的溫度和pH下反應(yīng)30 min后, 立即加入1.5 mL終止液(甲醇︰異丙醇︰水=35︰30︰35, 體積分?jǐn)?shù))終止反應(yīng)。用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長380 nm和發(fā)射波長450 nm下測定反應(yīng)釋放的7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarin, AMC)的熒光強(qiáng)度, 空白組用緩沖液代替熒光底物。

一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘釋放1 nmol AMC所需要的酶量。

1.3.3 SDS-PAGE分析 分別取在4 °C冷藏0、1、2、3、5、7 d牡蠣的四種不同組織樣品, 加入4倍含有0.5 mol/L NaCl的PBS (pH 7.0), 組織搗碎, 離心(10 000′, 15 min)取上清, 樣品與上樣緩沖液(200 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 含400 mmol/L DTT, 8% SDS, 0.4%溴酚藍(lán), 40%甘油)按照1︰3 (體積分?jǐn)?shù))混合, 95 °C加熱10 min后–20 °C凍藏待用。收集7 d的樣品后一并進(jìn)行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE參考Laemmli(1970)的方法, 濃縮膠濃度為5%, 分離膠濃度為12%, 電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色, 經(jīng)脫色液脫色至蛋白條帶清晰, 再用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.4 免疫印跡法分析(Western blotting) 參照Towbin等(1979)的文獻(xiàn)報(bào)道, 將第0 d下4種不同組織上樣于SDS-PAGE, 蛋白通過半干式電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將膜以5%脫脂奶封閉1.5 h, TBST清洗3次, 每次5 min, 接著用兔抗真鯛亮氨酸氨肽酶抗體或兔抗鮑組織蛋白酶L抗體孵育1.5 h, TBST清洗5次, 每次5 min。再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育1.5 h, TBST清洗7次, 每次7 min, 加入ECL底物孵育2 min, 經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯色, 記錄結(jié)果。

1.3.5 pH值的測定 取冷藏第0、1、2、3、5、7、9、11、13 d的牡蠣肉樣品, 分別進(jìn)行組織搗碎, 得到肉糜樣品備用。稱取5.00 g肉糜, 加新煮沸后冷卻的蒸餾水至50 mL, 搖勻, 浸漬30 min后過濾, 取25 mL濾液于50 mL燒杯中。按照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》的方法進(jìn)行pH值的測定。

1.3.6 氨基酸態(tài)氮的測定 稱量上述第0、1、2、3、5、7 d的肉糜樣品1.00 g用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中, 加水稀釋至刻度, 混勻。按照GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定第二法》的方法進(jìn)行氨基酸態(tài)氮含量的測定。

1.3.7 揮發(fā)性鹽基氮的測定 稱取上述第0、1、2、3、5、7 d的肉糜樣品10.00 g于蒸餾管內(nèi), 加入75 mL水, 振搖, 使試樣在樣液中分散均勻, 浸漬30 min。按照GB 5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定第二法》的方法進(jìn)行揮發(fā)性鹽基氮含量的測定。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣不同組織中蛋白酶的分布

新鮮牡蠣不同組織中幾種酶的相對(duì)活力如圖1所示。四種組織中, 不同種類的酶, 最高酶活力均出現(xiàn)在性腺-內(nèi)臟團(tuán), 其次為鰓, 外套膜和閉殼肌的酶活力相當(dāng)。丙氨酸氨肽酶和精氨酸氨肽酶在鰓中的酶活力約為性腺-內(nèi)臟團(tuán)的80%—90%, 外套膜和閉殼肌中的酶活力約為性腺-內(nèi)臟團(tuán)的40%—60%。亮氨酸氨肽酶在鰓中的活力為性腺-內(nèi)臟團(tuán)的50%, 外套膜和閉殼肌中的酶活力約為性腺-內(nèi)臟團(tuán)的35%。胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶在外套膜、鰓、閉殼肌中的酶活力相當(dāng), 僅約為性腺-內(nèi)臟團(tuán)的25%。為了進(jìn)一步確認(rèn)酶在不同組織中的蛋白水平差異, 利用兔抗真鯛亮氨酸氨肽酶多克隆抗體和兔抗鮑魚組織蛋白酶L多克隆抗體進(jìn)行Western blotting分析。如圖2所示, 牡蠣四種組織樣品均能與兔抗真鯛亮氨酸氨肽酶抗血清產(chǎn)生免疫反應(yīng), 表明該酶在這四種組織中均有表達(dá)。亮氨酸氨肽酶在性腺-內(nèi)臟團(tuán)中的表達(dá)量最高, 其次為鰓, 在外套膜和閉殼肌中的表達(dá)量相當(dāng)。而組織蛋白酶L只在性腺-內(nèi)臟團(tuán)中有表達(dá), 與酶活力分析結(jié)果相同。

圖1 牡蠣4種不同組織中的相對(duì)酶活力(n=5)

圖2 牡蠣4種不同組織中酶分布的Western blotting鑒定

注: 1. 外套膜, 2. 鰓, 3. 閉殼肌, 4. 性腺-內(nèi)臟團(tuán)

2.2 冷藏過程中牡蠣不同組織酶活力變化

在冷藏過程中, 酶的作用直接影響牡蠣的品質(zhì)。如圖3所示, 三種氨肽酶中亮氨酸氨肽酶的活力最高, 其次為精氨酸氨肽酶, 酶活力最低的是丙氨酸氨肽酶。三種氨肽酶在性腺-內(nèi)臟團(tuán)中的初始酶活力分別為(159.03±18.47)、(107.82±12.32)和(3.16±0.07) U/g。氨肽酶的酶活力隨冷藏時(shí)間的延長逐漸降低, 經(jīng)7 d冷藏后, 性腺-內(nèi)臟團(tuán)中亮氨酸氨肽酶的酶活力為初始值的25.15%, 丙氨酸氨肽酶的酶活力為初始值的31.65%, 精氨酸氨肽酶的酶活力為初始值的23.19%。胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶主要分布于性腺-內(nèi)臟團(tuán)中, 酶活力在冷藏過程中緩慢上升, 經(jīng)7 d冷藏后, 性腺-內(nèi)臟團(tuán)中絲氨酸蛋白酶的酶活力上升44%, 這是酶原被激活的結(jié)果。組織蛋白酶B和組織蛋白酶B+L隨著貯藏時(shí)間的延長, 酶活力均上升, 組織蛋白酶B+L的酶活力上升較組織蛋白酶B快, 說明在短期冷藏后期組織蛋白酶L對(duì)牡蠣品質(zhì)的影響逐漸加強(qiáng)。組織蛋白酶B和組織蛋白酶B+L的酶活力至第7 d達(dá)到最高值, 分別為(30.61±2.75)和(40.44±8.72) U/g, 是初始酶活力的2.59和4.23倍, 同樣, 這是酶原被激活的結(jié)果。

圖3 冷藏過程中牡蠣4種不同組織中酶活力的變化(n=5)

注: a. 亮氨酸氨肽酶, b. 丙氨酸氨肽酶, c. 精氨酸氨肽酶, d. 絲氨酸蛋白酶, e. 組織蛋白酶B, f. 組織蛋白酶B+L

2.3 冷藏過程中牡蠣不同組織的蛋白質(zhì)降解

牡蠣不同組織蛋白質(zhì)降解情況如圖4所示, 在冷藏過程中, 四種組織中的蛋白質(zhì)均受到不同程度的降解。外套膜(圖4a)中分子量為40 kDa的蛋白條帶在冷藏的第7 d發(fā)生較為明顯的降解。鰓(圖4b)中分子量為41、37和30 kDa的蛋白條帶在冷藏第2 d就發(fā)生降解, 并出現(xiàn)低分子量(15 kDa)的蛋白降解條帶。冷藏第3 d, 閉殼肌(圖4c)中分子量為25—30 kDa的蛋白降解條帶產(chǎn)生。性腺-內(nèi)臟團(tuán)(圖4d)中分子量為40—50 kDa和25—30 kDa的蛋白條帶在冷藏第2 d發(fā)生降解?？傮w上, 牡蠣組織中鰓和性腺-內(nèi)臟團(tuán)中的蛋白發(fā)生更為明顯的降解現(xiàn)象, 這與這兩個(gè)組織中內(nèi)源性蛋白酶的高活力是密切相關(guān)的。

圖4 冷藏過程中牡蠣4種不同組織蛋白降解

注: M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 0: 0 d; 1: 1 d; 2: 2 d; 3: 3 d; 5: 5 d; 7: 7 d

2.4 冷藏過程中牡蠣肉pH值的變化

由圖5可知, 牡蠣肉在4 °C冷藏條件下, pH值隨著貯藏時(shí)間的延長先降低后上升, pH值從初始的6.65±0.07到第9 d達(dá)最低值5.80±0.05, 隨后由于蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生堿性的胺類物質(zhì)而緩慢上升。但是, 與魚類相比, 牡蠣肉因含有更多可生成乳酸的糖原, 使得牡蠣在冷藏過程中都處于較低的pH值。即便冷藏13 d, 已有濃重腐臭味, 牡蠣的pH值仍低于6.0。

圖5 冷藏過程中牡蠣肉pH值的變化(n=5)

2.5 冷藏過程中牡蠣肉氨基酸態(tài)氮和揮發(fā)性鹽基氮含量的變化

氨基酸態(tài)氮是指以游離氨基酸形式存在的氮元素含量。該指標(biāo)在一定程度上可反映牡蠣肉中高分子量蛋白質(zhì)被蛋白酶降解為低分子量肽后, 進(jìn)一步被外切酶氨肽酶作用, 導(dǎo)致游離氨基酸量的增加。如圖6所示, 新鮮牡蠣肉的氨基酸態(tài)氮含量為(0.26±0.05) g/100g。4 °C冷藏第2 d, 氨基酸態(tài)氮含量為(0.28±0.01) g/100g, 第7 d為(0.31±0.03) g/100g。揮發(fā)性鹽基氮是機(jī)體在內(nèi)源酶和微生物的作用下, 蛋白質(zhì)降解而產(chǎn)生的揮發(fā)性堿性含氮物質(zhì), 其含量越高, 表明氨基酸被破壞的越多。牡蠣肉中揮發(fā)性鹽基氮的含量在冷藏前2 d保持穩(wěn)定, 隨后快速增長。第0 d揮發(fā)性鹽基氮的含量為(5.60±0.64) mg/100g, 冷藏至第7 d其含量達(dá)到(17.50±0.37) mg/100g, 增加了212.5%。

圖6 冷藏過程中牡蠣肉氨基酸態(tài)氮和揮發(fā)性鹽基氮的變化(n=5)

3 討論

水產(chǎn)動(dòng)物含有豐富的酶類, 酶類在不同組織中的分布差異與其生理功能密切相關(guān)。前期研究中我們發(fā)現(xiàn), 賴氨酸氨肽酶在牙鲆肌肉、肝臟、鰓和腎臟等組織均有分布(陳曦等, 2012)。亮氨酸氨肽酶在真鯛不同組織中都有分布, 在腦和腎臟中含量較高(Wu, 2008)。對(duì)皺紋盤鮑組織蛋白酶L研究發(fā)現(xiàn), 該酶存在于性腺和肝胰臟組織中, 而在肌肉、鰓和外套膜中均未檢測到該酶的表達(dá)(Shen, 2015)。結(jié)合本文對(duì)牡蠣的研究結(jié)果表明, 氨肽酶廣泛分布于水產(chǎn)動(dòng)物的不同組織中, 而組織蛋白酶L主要存在于性腺和肝胰臟(內(nèi)臟團(tuán))中。

牡蠣肉在4 °C冷藏過程中, pH值呈現(xiàn)先下降后上升的“V”字形變化, 并且在第9 d時(shí)pH值最低, 與牛改改等(2020)對(duì)牡蠣冷藏保鮮的研究結(jié)果一致。動(dòng)物死后, 隨著糖原酵解生成乳酸, pH值下降, 下降的程度與機(jī)體中糖原的含量有關(guān), 糖原含量越高, 乳酸的生成量越多, pH值越低。后續(xù)pH的上升主要是由于蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的氨基酸受微生物的作用進(jìn)一步分解生成呈堿性的生物胺類物質(zhì)引起的。

牡蠣肉中氨基酸態(tài)氮含量在4 °C冷藏的前7 d隨冷藏時(shí)間延長而緩慢增加, 與劉壽春等(2013)報(bào)道的羅非魚片在0 °C冷藏過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化結(jié)果類似。牡蠣肉在冷藏過程中氨基酸態(tài)氮含量緩慢增加, 與牡蠣肉中胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶、組織蛋白酶和氨肽酶的共同作用有關(guān)。牡蠣肉在冷藏前2 d是保鮮處理的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn), 此時(shí)蛋白質(zhì)降解程度弱, pH值、揮發(fā)性鹽基氮、氨基酸態(tài)氮等指標(biāo)基本穩(wěn)定。冷藏2 d后, 揮發(fā)性鹽基氮含量增長較快, 這與冷藏后期胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶、組織蛋白酶的高活力以及微生物的作用密不可分。至第7 d, 揮發(fā)性鹽基氮含量達(dá)到(17.50±0.37) mg/100g, 與張觀科等(2012)研究長牡蠣0—2 °C冷藏過程中第7 d的揮發(fā)性鹽基氮含量(16 mg/100g)接近, 但已超過衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)值規(guī)定的15 mg/100g, 牡蠣也已失去其特有的氣味并有不愉快的腐敗氣味產(chǎn)生。郭曉偉(2010)的研究發(fā)現(xiàn), 長牡蠣在4 °C冷藏6 d時(shí)揮發(fā)性鹽基氮值達(dá)到19.6 mg/100g。不同研究者對(duì)牡蠣冷藏過程中揮發(fā)性鹽基氮指標(biāo)研究的結(jié)果不同, 很大可能是由于牡蠣不同產(chǎn)區(qū)水域環(huán)境及季節(jié)的影響, 從而導(dǎo)致其在冷藏過程中產(chǎn)生鮮度指標(biāo)上的差異。

牡蠣的不同組織中, 蛋白酶活力最高的性腺-內(nèi)臟團(tuán)和鰓最先開始蛋白降解, 而后外套膜和閉殼肌中的蛋白逐漸降解。胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶的最適pH為8.0左右, 在中性附近也有較高活性, 在冷藏初期, 該酶對(duì)蛋白的降解起主要作用。隨著冷藏時(shí)間的延長, 牡蠣的pH值不斷下降(圖5所示), 此時(shí)最適pH為5.5的組織蛋白酶L和B的作用更為突出。因此, 本文認(rèn)為胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶等蛋白酶的協(xié)同作用是牡蠣肉冷藏前期蛋白質(zhì)降解的主要因素, 而氨肽酶是外切酶, 其作用主要是增加游離氨基酸含量。接下來, 有必要對(duì)相關(guān)蛋白酶的性質(zhì)作更深入研究。

冷藏保鮮是世界上歷史最悠久的保鮮方法, 因其操作簡單、成本低, 至今仍是國內(nèi)最廣泛使用的牡蠣保鮮方法。冷藏保鮮的溫度一般維持在0—4 °C, 本文結(jié)果顯示牡蠣肉通過4 °C冷藏保鮮, 貨架期為6 d, 尚不能滿足運(yùn)往內(nèi)地市場更長時(shí)間貨架期的要求。而通過低溫并結(jié)合降低微生物生長繁殖速度的手段, 可以有效延長牡蠣肉的冷藏貨架期。牡蠣肉使用濃度為3.36 mg/L的臭氧水浸泡處理15 min, 4 °C冷藏的保鮮期為8 d (袁勇軍等, 2009)。氣調(diào)包裝(60% CO2/ 30% N2/ 10% O2)的長牡蠣肉樣品在[(4±1) °C]冷藏條件下, 貨架期可達(dá)到11—12 d (曹榮等, 2009)。長牡蠣肉經(jīng)350 MPa超高壓處理10 min后, 4 °C冷藏貨架期延長至14 d (劉遠(yuǎn)平等, 2016)。牡蠣肉輕度熱處理(80 °C隔袋加熱20 min)后, 4 °C冷藏的貨架期可達(dá)15 d (岳敏等, 2019)。今后, 有必要借鑒這些方法并對(duì)產(chǎn)生的效果作深入分析。

對(duì)長牡蠣中內(nèi)源性蛋白酶的分布及冷藏過程中蛋白質(zhì)降解、酶活力和鮮度指標(biāo)變化規(guī)律的研究, 對(duì)于采取更加切實(shí)有效的措施做好牡蠣冷鏈物流過程中的牡蠣品質(zhì)保持具有參考意義。

4 結(jié)論

內(nèi)源性蛋白酶對(duì)短期冷藏過程中牡蠣的品質(zhì)有重要影響。氨肽酶、胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶等三大類酶在牡蠣的性腺-內(nèi)臟團(tuán)中活力最高。氨肽酶在外套膜、鰓、閉殼肌和性腺-內(nèi)臟團(tuán)等四種組織中均有表達(dá)分布, 胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶主要存在于性腺-內(nèi)臟團(tuán), 而組織蛋白酶絕大部分在性腺-內(nèi)臟團(tuán)中表達(dá)。在7 d的4 °C冷藏過程中, 四種組織中的酶活力均發(fā)生了明顯變化, 氨肽酶的活力逐漸降低, 而組織蛋白酶和胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶的酶原被激活, 酶活力隨著時(shí)間的延長而升高。四種組織中的蛋白質(zhì)隨冷藏時(shí)間的延長而發(fā)生不同程度的降解, 氨基酸態(tài)氮和揮發(fā)性鹽基氮含量與冷藏時(shí)間呈正相關(guān)性。

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DISTRIBUTION OF PROTEASES IN DIFFERENT TISSUES OFAND CHANGES OF ENZYME ACTIVITY AND FRESHNESS DURING COLD STORAGE

ZHANG Qian1, 2, CHEN Hong1, QUE Hua-Yong2, 3, LI Yu-Jin4, SUN Le-Chang1, 2, WENG Ling1, 2, ZHANG Ling-Jing1, 2, LIU Guang-Ming1, 2, CAO Min-Jie1, 2

(1. College of Marine Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. National & Local Joint Engineering Research Center of Processing Technology for Aquatic Products, Xiamen 361021, China; 3. Fisheries College of Jimei University, Xiamen 361021, China; 4. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The distribution of several main enzymes in different tissues ofwere identified by enzyme activity assay and the Western blotting. Enzyme (including aminopeptidase, trypsin-like serine proteinase, and cathepsins) activity variation and freshness index changes during cold storage at 4 °C were investigated. The results show that the activities of aminopeptidases (leucine aminopeptidase, alanine aminopeptidase, and arginine aminopeptidase) were high in the four tissues (mantle, gill, adductor muscle, and gonad-visceral mass). Trypsin-like serine protease was identified in mainly the gonad-visceral mass, with lower activity in other three tissues, while major activities of cathepsin B and B+L were detected in the gonad-visceral mass. During cold storage at 4 °C, the protease activity changed significantly. After 7 days of cold storage, the enzyme activity of leucine aminopeptidase, alanine aminopeptidase, and arginine aminopeptidase in gonade-visceral mass was 25.15%, 31.65%, and 23.19%, respectively as compared to their initial activity. However, the activity of cathepsin B and L was 1.71 and 5.66 times that of the initial value, respectively. The activity of trypsin-like serine protease increased by 44%. During cold storage, the freshness index of oysters also changed. The pH value decreased till the 9thday and then increased. The content of amino nitrogen increased from (0.26±0.05) g/100g to (0.31±0.03) g/100g and that of volatile base nitrogen increased from (5.60±0.64) mg/100g to (17.50±0.37) mg/100g, respectively in 7 days. SDS-PAGE showed that the proteins in four different tissues all degraded to different extents during cold storage. This study revealed the variation rule of several main enzymes and freshness indexes of oysters in the short-term cold storage, providing a reference for the preservation of oysters.

; enzyme; cold storage; freshness; protein degradation

* 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃, 2018YFD0901004號(hào); 財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助。章 騫, 碩士, 實(shí)驗(yàn)師, E-mail: zhangqian@jmu.edu.cn

曹敏杰, 博士, 教授, E-mail: mjcao@jmu.edu.cn

2021-01-17,

2021-04-13

Q956; S984

10.11693/hyhz20210100016