熱滅活鼠李糖乳桿菌HN001對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎保護(hù)作用

王東旭,尹成男,葉華,郭元新*

1(江蘇科技大學(xué) 糧食學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江,212100)2(合肥極世茗香生物科技有限公司,安徽 合肥,230088)

炎癥性腸病是一種多因素的腸道炎癥性疾病,其發(fā)病因素主要包括遺傳、環(huán)境因素、腸黏膜屏障完整性和功能異常、免疫調(diào)節(jié)以及腸道微生態(tài)異常等[1]。為了研究炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制和評價其治療效果,葡聚糖硫酸鈉鹽(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型被廣泛應(yīng)用[2]。益生菌是一類可用于緩解人體各種慢性疾病,如慢性先天性炎癥、高脂血癥、糖尿病、肥胖,結(jié)腸炎等[3-4]的微生物。有證據(jù)表明,口服活性益生菌可作為預(yù)防和緩解結(jié)腸炎的有效途徑,其主要機(jī)制為抑制炎癥、改善腸屏障功能障礙、提高免疫調(diào)節(jié)活性及調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等[5-6]。動物模型研究表明補(bǔ)充活性鼠李糖乳桿菌可以改善DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎[7]。但值得注意的是在某些群體中使用活菌出現(xiàn)感染的安全問題,例如新生兒[8-9]和易受感染的患者[10]。因此,尋找解決這一問題的有效途徑引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。

最近,有研究報道熱滅活的益生菌也能對宿主產(chǎn)生有益的影響,例如熱滅活的發(fā)酵乳桿菌CECT5716和短乳桿菌SBC8803對小鼠結(jié)腸炎均具有改善作用[11-12]。此外,多項(xiàng)體外和體內(nèi)研究表明熱滅活的鼠李糖乳桿菌GG也具有改善結(jié)腸炎的功能作用[13-15]。與活性益生菌相比,熱滅活益生菌更利于工業(yè)生產(chǎn)和消費(fèi)者使用；同時具有產(chǎn)品保質(zhì)期延長和便于儲存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn),因此熱滅活益生菌具有良好的應(yīng)用前景。鼠李糖乳桿菌HN001(LactobacillusrhamnosusHN001)是1株存在于人體腸道中的不產(chǎn)生芽孢的厭氧性革蘭氏陽性菌,它是全球研究最多的第3代益生菌之一。然而,熱滅活的鼠李糖乳桿菌HN001(HK-HN001)對炎癥性腸病的作用影響尚不清楚。本研究以DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎為研究模型,探討HK-HN001對結(jié)腸炎的保護(hù)作用,為研發(fā)活性益生菌代替產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

活性鼠李糖乳桿菌HN001凍干粉,美國杜邦公司；DSS,大連美倫生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)測試盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)測試盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測試盒、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)測試盒,南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)測試盒、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)測試盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)測試盒,美國BD Biosciences公司；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)測試盒,美國BioVision公司；RNAiso Plus總RNA提取試劑盒、PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex熒光定量試劑盒,日本TaKaRa公司；多聚甲醛固定液、蘇木精和伊紅染料、石蠟及切片等,武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司；DEPC水,北京索萊寶科技有限公司；氯仿、異丙醇、乙醇、二甲苯,國藥集團(tuán)；本文所使用的基因引物,上海Generay公司。

1.2 儀器及設(shè)備

SpectraMax M4多功能酶標(biāo)儀,美國Molcular Devices公司；EG1150自動石蠟包埋切片機(jī),德國Leica公司；ND2000核酸定量儀、Forma900超低溫冰箱,美國Thermo-Fisher 公司；S1000型PCR儀、CFX96實(shí)時熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司；3-18KS高速冷凍離心機(jī),美國Simga公司；Scientz-48高通量組織勻漿儀,寧波新芝公司；多量程單道可調(diào)移液器,法國Gilson公司；MH-2800a多功能恒溫器,天津奧特賽恩斯公司；雙人單面凈化工作臺,蘇州凈化公司；MLS-3780高壓滅菌鍋,日本SANYO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

雄性C57BL/6小鼠(8周齡),體質(zhì)量(20±2)g,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。所有小鼠飼養(yǎng)在(22±2)℃和相對濕度60%～80%的SPF級環(huán)境。所有動物實(shí)驗(yàn)均按照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部《實(shí)驗(yàn)室動物飼養(yǎng)與使用規(guī)范》進(jìn)行,該研究遵循的程序符合江蘇科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會所制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),批準(zhǔn)文號20200302。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 滅活菌粉的制備

準(zhǔn)確稱取10 g活性鼠李糖乳桿菌HN001凍干粉裝入10 mL無菌離心管中,利用高壓滅菌鍋于121 ℃、0.12 MPa下熱殺菌處理10 min,并用平板菌落計數(shù)法檢測滅活效果,獲得HK-HN001粉末。隨后利用純水配制質(zhì)量濃度2 g/L的HK-HN001水溶液,分裝低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動物處理

將24只小鼠隨機(jī)分為3組(每組8只),分別為對照組、模型組和HK-HN001保護(hù)組。其中對照組小鼠正常飲水；模型組小鼠飲用20 g/L的DSS水溶液構(gòu)建結(jié)腸炎模型；HK-HN001保護(hù)組小鼠飲用20 g/L的DSS水溶液的同時通過移液器飼喂100 μL(相當(dāng)于200 mg/kg 體質(zhì)量)上述HK-HN001水溶液每日1次；各組處理均連續(xù)進(jìn)行3周,實(shí)驗(yàn)過程中每日記錄動物體質(zhì)量1次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后首先利用水合氯醛溶液麻醉小鼠,通過眼球取血法收集血清樣本,隨后利用CO2麻醉法處死小鼠。解剖采集小鼠結(jié)腸組織,測量結(jié)腸長度后分別低溫保存用于后續(xù)分析。

1.4.3 疾病活動指數(shù)分析

通過每日監(jiān)測實(shí)驗(yàn)動物體質(zhì)量、直腸出血情況和糞便形態(tài)進(jìn)行疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)評分,具體分值如表1所示。

表1 疾病活動指數(shù)(DAI)評分表

1.4.4 結(jié)腸組織氧化逆境程度分析

結(jié)腸勻漿的制備：按照每0.1 g結(jié)腸組織與1 mL冰冷的組織勻漿液(150 mmol/L PBS,pH 7.2,1 mmol/L EDTA·Na2)的比例利用高通量組織勻漿儀對結(jié)腸組織充分勻漿,4 ℃、15 000 g/min離心15 min以除去細(xì)胞碎片和細(xì)胞核。取上清液并保存于-80 ℃待用。根據(jù)相關(guān)試劑盒操作說明書,檢測上清液中T-SOD和MPO的活力,以及使用相應(yīng)試劑盒測定GSH和MDA的含量,其中以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn),用Bradford法測定蛋白水平。

1.4.5 結(jié)腸組織切片制作及病理觀察

生物樣本經(jīng)組織固定液固定72 h后進(jìn)行常規(guī)梯度脫水,隨后將結(jié)腸組織利用自動石蠟包埋機(jī)進(jìn)行浸蠟和包埋,隨后修整蠟塊后利用切片機(jī)將石蠟塊切成4 μm厚的切片,然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行蘇木精和伊紅染色,最后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行結(jié)腸病理觀察并拍照分析(20×)。

1.4.6 結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá)分析

使用ELISA試劑盒按照試劑盒說明書分別檢測結(jié)腸勻漿液中IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度。利用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長處讀取標(biāo)準(zhǔn)品及各檢測樣本的吸光度,測得的數(shù)據(jù)運(yùn)用ELISACalc軟件進(jìn)行計算處理,單位為pg/g組織蛋白。

1.4.7 結(jié)腸組織腸道通透性分析

利用實(shí)驗(yàn)動物血漿中LPS濃度和DAO的活力作為指標(biāo)評價腸道通透性。利用適量的血清樣本,嚴(yán)格按照相關(guān)的試劑盒說明書操作,利用多功能酶標(biāo)儀讀取吸光度從而測定血清中LPS和DAO的含量,單位分別為ng/mL和U/mL。

1.4.8 結(jié)腸組織總RNA的提取與實(shí)時定量PCR檢測

稱取50 mg的結(jié)腸組織加入1.0 mL RNAiso Plus提取液,使用高通量勻漿儀將樣品充分研磨后,將得到的樣品組織勻漿4 ℃、15 000 r/min離心15 min,收集上清液并加入500 μL氯仿進(jìn)行提取。將提取液4 ℃、12 000 r/min離心15 min,再次收集上清液,并用等體積的異丙醇于-20 ℃條件下助沉30 min；隨后在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心10 min,棄去上清液；隨后利用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇對沉淀進(jìn)行清洗,再于4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min,使用200 μL的DEPC水溶解沉淀獲得總RNA提取。利用核酸定量儀檢測總RNA濃度,使用DEPC水將原液稀釋至50 ng/μL后,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在超凈臺中于冰水浴條件下配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,然后在PCR儀內(nèi)按逆轉(zhuǎn)錄程序,即37 ℃、15 min和85 ℃、5 s進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,以獲得cDNA樣品。隨后按照實(shí)時定量試劑盒說明書在超凈臺中于冰浴條件下配制反應(yīng)液,然后在實(shí)時定量PCR儀中按優(yōu)化的擴(kuò)增條件進(jìn)行實(shí)時定量檢測。使用的引物序列如下：ZO-1(正向：5′-ACCACCAACCCGAGAAG-3′,反向：5′-CAGGAGTCATGGACGCAC-3′)；Occludin(正向：5′-TTGAAAGTCCACCTCCTT-3′,反向：5′-CCGGATAAAAA-GAGTACG-3′)；Claudin-1(正向：5′-GGCCTGATAGC-GAGCAC-3′,反向：5′-GTGACGCACTCCATCCAGA-3′)；E-cadherin(正向：5′-CAGGTCTCCTCATGGCTT-3′,反向：5′-CTTCCGAAAAGA-AGGCTG-3′)；β-actin(正向：5′-GCTGAGAGGGAA-ATCGTGCGTt-3′,反向：5′-ACCGCTCGTTGCCAATAG-TGA-3′)。

1.4.9 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)的差異分析使用One-way ANOVA。根據(jù)Bartlett’s檢驗(yàn)差異是否具有顯著性而選擇Dunnett’s或Tukey’s進(jìn)行各組間的多重比較檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)表示方法為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean ± SEM),當(dāng)P<0.05時,組間存在顯著差異。所有數(shù)據(jù)處理及分析軟件使用GraphPad(Prism,USA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HK-HN001對結(jié)腸炎小鼠病理的影響

DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型其主要病理特征為小鼠出現(xiàn)明顯體質(zhì)量減輕、腹瀉或糞便疏松和可見的血便以及結(jié)腸長度縮短及損傷。由圖1-a所示,模型組的DAI評分逐漸增加,在試驗(yàn)觀察期結(jié)束時達(dá)到最大值,而HK-HN001保護(hù)組與模型組相比較,DAI評分從第10天開始顯著降低直到實(shí)驗(yàn)觀察期結(jié)束。這一結(jié)果說明補(bǔ)充HK-HN001顯著改善了由DSS誘導(dǎo)引起的小鼠的體質(zhì)量減輕、腹瀉和血便。通過解剖測量各組小鼠結(jié)腸長度發(fā)現(xiàn),模型組小鼠結(jié)腸長度顯著降低(P<0.001),而HK-HN001保護(hù)組顯著改善了DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸縮短(P<0.01)(圖1-b)。此外,病理分析結(jié)果顯示,DSS處理后的小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)黏膜腸腺消失、炎性細(xì)胞浸潤、上皮細(xì)胞腫脹和細(xì)胞質(zhì)疏松以及黏膜下層結(jié)締組織增生等情況。而HK-HN001補(bǔ)充顯著改善這些病理特征(圖1-c)。

a-DAI評分；b-結(jié)腸長度；c-結(jié)腸病理切片

2.2 HK-HN001對結(jié)腸炎小鼠氧化逆境的影響

結(jié)腸組織的氧化逆境是DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中的特征性分子變化,其中MPO是炎癥、組織損傷和中性粒細(xì)胞浸潤的重要生物標(biāo)志物,主要反映炎癥和氧化應(yīng)激水平。有研究表明急性結(jié)腸炎往往伴隨著氧化應(yīng)激的增加,而降低結(jié)腸組織中的氧化應(yīng)激是減輕結(jié)腸炎的潛在干預(yù)措施之一[16]。如圖2所示,DSS顯著誘導(dǎo)了小鼠結(jié)腸組織的氧化逆境,具體表現(xiàn)為結(jié)腸組織中T-SOD的活力降低、GSH含量顯著降低,同時伴隨著MPO活力和MDA含量的顯著升高。然而,與模型組相比,HK-HN001保護(hù)組結(jié)腸組織中的T-SOD活力(P<0.05)和GSH含量(P<0.01)顯著增加,而MPO活力(P<0.01)和MDA含量(P<0.01)顯著減低。這些研究結(jié)果表明,HK-HN001的補(bǔ)充可以改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸氧化應(yīng)激。

a-T-SOD(U/mg組織蛋白)、GSH(nmol/mg組織蛋白)；b-MPO(U/mg組織蛋白)、MDA(nmol/mg組織蛋白)

2.3 HK-HN001對結(jié)腸炎小鼠炎癥反應(yīng)的影響

氧化應(yīng)激可以刺激多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,最終導(dǎo)致結(jié)腸炎癥。IL-1β、IL-6和TNF-α是結(jié)腸組織釋放的主要促炎細(xì)胞因子,可能在結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,因此本文通過ELISA測量結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平來判斷HK-HN001對結(jié)腸炎小鼠炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果表明,DSS處理后結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平均顯著增加(P<0.001),然而補(bǔ)充HK-HN001的實(shí)驗(yàn)組顯著降低了小鼠結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子IL-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.01)和TNF-α(P<0.001)的水平(圖3)。這些結(jié)果提示,降低結(jié)腸的氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)結(jié)腸組織的促炎細(xì)胞因子表達(dá)和黏膜免疫可能是HK-HN001改善DSS小鼠結(jié)腸炎的潛在機(jī)制之一。

圖3 HK-HN001對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠炎癥反應(yīng)的影響

2.4 HK-HN001對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸通透性的影響

結(jié)腸細(xì)胞可以表達(dá)緊密連接蛋白,主要包括ZO-1、Occludin、Claudin-1和E-cadherin等,它們形成天然的腸屏障,通過固有層阻止毒素和微生物抗原的外泄。研究表明,緊密連接蛋白表達(dá)的降低可以加速實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展[17]。血清LPS水平和DAO活力已被廣泛用于評價腸道機(jī)械屏障的完整性和受損傷程度,腸屏障功能受損時血液中LPS水平顯著增加。如圖4所示,與對照組相比,模型組小鼠血清中LPS含量顯著增加(P<0.01),同時DAO的活力顯著降低(P<0.01),而HK-HN001保護(hù)組小鼠血清中LPS含量顯著低于模型組(P<0.01),且血清中DAO的活力相對于模型組顯著升高(P<0.05)。此外,利用實(shí)時定量PCR進(jìn)一步分析了各組小鼠結(jié)腸組織中關(guān)鍵緊密連接蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1(P<0.01)、Occludin(P<0.01)、Claudin-1(P<0.01)和E-cadherin(P<0.05)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平均顯著被抑制。而在HK-HN001保護(hù)組中,HK-HN001補(bǔ)充顯著增強(qiáng)小鼠結(jié)腸組織中ZO-1(P<0.05)、Claudin-1(P<0.05)和E-cadherin(P<0.05)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平(圖4-c)。這些結(jié)果表明HK-HN001補(bǔ)充可改善結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸通透性、降低血液中LPS水平,同時通過調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白基因的表達(dá)促進(jìn)腸屏障功能。

a-血清LPS水平；b-血清DAO含量；c-結(jié)腸緊密連接蛋白基因表達(dá)水平

3 討論與結(jié)論

最近研究指出熱滅活益生菌對宿主產(chǎn)生有益影響,這很可能是由于腸道細(xì)胞能夠識別特定的細(xì)菌成分由黏液相關(guān)淋巴組織介導(dǎo)免疫反應(yīng),這些成分包括具有免疫刺激活性的DNA、細(xì)胞壁成分(如肽聚糖或脂磷壁酸)以及胞內(nèi)和胞外多糖產(chǎn)物[18]。同時越來越多的證據(jù)表明,活性的和熱滅活的益生菌均可保護(hù)結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)動物的上皮屏障[19-20]。例如,熱滅活鼠李糖乳桿菌OLL2838已經(jīng)被證明可以保護(hù)結(jié)腸炎小鼠的黏膜屏障通透性缺陷[7]。利用大腸桿菌C1845感染的Caco-2/TC7細(xì)胞單層模型,熱滅活的嗜酸乳桿菌LB及其培養(yǎng)基抵消了大腸桿菌C1845誘導(dǎo)的細(xì)胞間隙通透性的增加[21]。腸細(xì)胞可以表達(dá)緊密連接蛋白,包括ZO-1、Claudins和Occladin,它們形成天然的腸道屏障,通過固有層阻止毒素和微生物抗原[17]。研究表明實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的發(fā)生伴隨著緊密連接蛋白表達(dá)的降低[22]。在本研究中DSS增加通透性(血清LPS)同時下調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá),而HK-HN001顯著減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸屏障功能異常,這些結(jié)果說明,HK-HN001可以通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)促進(jìn)腸屏障功能的改善。本研究未做等量的活菌功效對比研究,但熱滅活菌有其特殊的應(yīng)用范圍,例如可加入熱飲或加熱便當(dāng)中食用,因此雖有不足但本研究仍具有積極的意義和應(yīng)用價值。總之,HK-HN001對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型具有保護(hù)作用,能恢復(fù)結(jié)腸炎導(dǎo)致的結(jié)腸長度的減少并緩解結(jié)腸炎相關(guān)癥狀,同時減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠組織的病理學(xué)改變。此外,HK-HN001對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸氧化損傷具有保護(hù)作用,同時能夠降低結(jié)腸炎小鼠炎癥細(xì)胞因子的含量；HK-HN001還能夠改善結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸的通透性并修復(fù)結(jié)腸屏障功能紊亂。綜上所述,HK-HN001對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有保護(hù)作用,研究結(jié)果為熱滅活益生菌食品開發(fā)及營養(yǎng)應(yīng)用提供了理論支持。