益生菌粉中活菌穩(wěn)定性及其耐受模擬胃腸液的研究

張林奇,王曉蕊,史暢,彭禹熙,杜麗平

(天津科技大學 生物工程學院,工業(yè)微生物教育部重點實驗室,天津市工業(yè)微生物重點實驗室,天津,300457)

益生菌(probiotics)是指能定植于人體腸道的活性微生物,當其達到一定數量時有益于宿主健康[1]。同時,益生菌具有改善腸道菌群結構、增強免疫系統(tǒng)、降低膽固醇和血壓、降低氧化應激和餐后血糖等多種功效[2-3]。市場上存在許多種類的益生菌產品,其中益生菌粉(固體飲料類)是其主要產品形式之一[4],這些產品中所含微生物數量和種類都不同。蔣卉[5]認為進入腸道的益生活菌數達到1×107～1×1010CFU/g(mL)可確保益生菌對原有腸道微生態(tài)系統(tǒng)產生影響,《益生菌類保健食品申報與評定(征求意見稿)》及GB 7101—2015《食品安全標準 飲料》規(guī)定標識活菌型的產品乳酸菌數應≥1×106CFU/mL(g)。CURTO等[6]以水和牛奶作為食品載體,評估了3種商業(yè)乳桿菌不同生長期在模擬胃腸道中的存活率,結果表明,乳桿菌在穩(wěn)定期存活率較高。常柳依等[7]通過采用海洋寡糖、藻酸鹽-山羊奶-菊粉基質對雙歧桿菌進行包裹,提高益生菌在模擬胃腸道環(huán)境下的存活率。RODRIGUES等[8]比較了乳制品和膳食補充劑中嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌在模擬胃腸消化過程中的影響,乳制品基質比膳食補充劑更能有效地維持益生菌的生存能力。BORICHA等[9]對不同來源的益生菌菌株進行益生特性評估,篩選出在模擬胃腸道條件下具有抵抗力或生存能力的菌株。MICHELUTTI等[10]建立了利用流式細胞技術(flow cytometry,FCM)對食品補充劑中的益生菌分析方法。而GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物檢驗 乳酸菌檢驗》規(guī)定采用平板計數法來分析食品中益生菌的存活狀況。

目前,食品或藥物的體外模擬消化在國內外的應用已經相當普遍[11-13],但關于益生菌粉中益生菌的菌體活性及其在胃腸消化液中的耐受能力的研究相對較少。本研究以6個不同品牌的益生菌粉產品為研究對象,并比較了6個產品在模擬胃腸道中的耐受性,旨在了解當前益生菌產品的品質水平,為益生菌產品品質分析提供參考,并為進一步制定相關標準提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料為6個不同品牌的益生菌粉,所有產品均于網上購買,具體信息見表1。

表1 產品信息

胃蛋白酶、胰蛋白酶、豬膽鹽,上海源葉生物科技有限公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基,北京路橋技術有限責任公司；2.5 L圓底立式厭氧培養(yǎng)袋、2.5 L厭氧產氣包,青島海博生物技術有限公司；Funga-LightTMYeast CFDA,AM/Propidium Iodide Vitality Kit,美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2004電子天平,上海精密科學儀器有限公司；LDZM型立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司；pHS-3C精密pH計,梅特勒-托利多儀器有限公司；ZHJH-C1115B型超凈工作臺、2XJD-A1270型電熱恒溫培養(yǎng)箱,鄭州南北儀器設備有限公司；BD Accuri C6 流式細胞儀,美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 活菌計數

活菌計數依據 GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》中乳桿菌和嗜熱鏈球菌計數方法,略作修改。稱取待檢樣1.0 g,置于裝有9.0 mL無菌生理鹽水的試管內,充分振搖,然后做10倍系列稀釋,選取2～3個適宜稀釋梯度,吸取100 μL于無菌平板內,每個稀釋度做3個平皿,將冷卻至48 ℃的MRS培養(yǎng)基或MC培養(yǎng)基傾注入平皿約15 mL,轉動平皿使混合均勻。待平板凝固后,倒置于厭氧袋內,(36±1)℃厭氧培養(yǎng)(72±2)h后,進行第1次活菌計數實驗。之后將產品放置于20 ℃的溫度下進行儲藏實驗,3個月后取樣進行第2次活菌計數實驗。

1.3.2 FCM分析

利用多功能細胞儀通過FCM測定產品中微生物的代謝活性[14]。稱取待檢樣0.5 g,于無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,pH 7.4)中稀釋1 000倍,將微生物密度調節(jié)至107CFU/mL左右,6 000 r/min條件下離心2 min,去除上清液,用PBS緩沖液將微生物洗滌2次,10 000 r/min條件下離心1 min,取沉淀于200 μL結合緩沖液中,加入5 μL 5-羧基熒光素二乙酸酯(5-carboxyfluorescein diacetate,CFDA)和5 μL的碘化丙啶(propidium iodide,PI)染料,混勻,避光室溫反應15 min,再加入結合緩沖液500 μL。未染色的產品為陰性對照,每個產品分別進行CFDA與PI單染做單陽性對照,流式細胞儀上樣進行分析[8]。檢測器波長為530 nm,收集羧基熒光素的綠色熒光(FL1通道),波長為670 nm收集碘化丙啶的紅色熒光(FL3通道)。通過FlowJo V10軟件分析細胞數據。

1.3.3 體外模擬消化

1.3.3.1 消化液的配制

體外模擬胃液：將0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液的pH值分別調為0.9、1.5、2.5、3.5、4.5,滅菌后再加入胃蛋白酶(10 g/L),混合使其充分溶解,得到模擬胃液。使用前進行37 ℃預熱。

體外模擬腸液：將磷酸鉀緩沖液pH調至6.8后滅菌,加入胰蛋白酶(10 g/L),豬膽鹽(3 g/L),混合使其充分溶解,得到模擬腸液。使用前進行37 ℃預熱。

1.3.3.2 模擬胃消化

分別稱取1.0 g產品至20.0 mL模擬胃液中,37 ℃、90 r/min厭氧條件下模擬胃消化過程,于0、0.5、1.0、2.0、3.0 h時取樣,采用平板計數法測定活菌數,并計算存活率[17],如公式(1)所示：

(1)

式中：Ni,消化ih后的活菌數；N0,初始活菌數。

1.3.3.3 模擬腸消化

分別稱取1.0 g產品至80.0 mL模擬腸液中,37 ℃、120 r/min厭氧條件下模擬腸消化過程,于0、1、2、3 h時取樣,進行活菌平板計數,并按公式(1)計算存活率。

1.3.3.4 模擬胃腸消化

分別稱取1.0 g產品于20.0 mL模擬胃液(pH 3.5)中,放入37 ℃ 90 r/min水浴鍋振蕩消化2 h,然后加入80.0 mL模擬腸液,在37 ℃ 120 r/min水浴鍋中繼續(xù)振蕩消化2 h,在厭氧條件下模擬胃腸消化過程。采用平板計數法測定活菌數,同時做平行實驗,并按公式(1)計算存活率。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 活菌數變化

如表2所示,不同益生菌粉的活菌數差異較大,產品E的活菌數最多,為10.19 lg CFU/g,而產品A、B的活菌數相對較低,僅有6.91、6.47 lg CFU/g。所有產品含活菌數都達到1×106CFU/g以上,均可達到國標要求的活菌數量,但與標識數存在差異。產品C、E活菌數量均高于標識活菌數,產品F、D活菌數略低于標識活菌數。然而,產品A、B實際活菌數卻遠低于標識中活菌數且與標識活菌數相差3個數量級,這可能與益生菌粉儲藏過程活菌數變化有關[18]。存放3個月后發(fā)現產品F下降明顯,其他產品中活菌數無明顯變化,較好地維持著產品的穩(wěn)定性。

表2 產品中的活菌數

2.2 FCM分析

MICHELUTTI等[10]認為只有微生物活細胞種群才能在平板上增殖和產生菌落,受損傷的菌體可能仍具有某些代謝活性,但可能不再可培養(yǎng)。故采用CFDA/PI雙標記結合FCM進一步證實了產品中微生物的存活情況,不同益生菌粉的FCM分析結果如圖1所示。

圖1 流式細胞分析圖

正常活菌、早期受損菌體、晚期受損菌體和壞死菌體分別分布在流式細胞分析圖的Q4、Q3、Q2、Q1[19],6個產品均存在不同程度的衰亡。如圖2所示,各產品活菌比例有明顯的差異,活菌比例由高到低：E>C>D>F>B>A。產品B、C中的損傷細胞較多,雖然在平板計數中產品A、B的活菌數均較低,但由FCM分析結果可以看出A產品死亡菌體數較多,B產品中損傷細胞較多。

圖2 產品中益生菌細胞的存活狀況

WILKINSON等[20]報道,采用平板計數與FCM計數對細胞數在104～107CFU/g的益生菌進行比較,發(fā)現兩者具有較高的相關性。流式細胞技術在微生物生物活性分析方面具有操作方便,適合大量樣品的篩選,在基礎研究方面具有較大的優(yōu)勢,平板計數操作簡單和經濟實惠,更有利于工業(yè)化生產需求。

2.3 模擬消化環(huán)境中的耐受性

2.3.1 益生菌對模擬胃液的耐受性

益生菌在消化道中定植,首先要耐受胃液中的低pH環(huán)境,還需經受胃液中的胃蛋白酶等的考驗。人體胃液pH值會隨飲食波動,胃液空腹或食用酸性食品時pH值可達1.5,飯后pH值為3.0左右,食用堿性食物pH值可達5.0,同時食物過胃的時間一般為1～2 h[21]。由圖3可知,6個產品在pH為4.5、3.5、2.5的模擬胃液中菌體存活較為穩(wěn)定,產品A、B、C、D、E、F產品活菌數分別為6.10～6.47、5.87～6.02、7.85～9.00、9.57～10.69、9.60～10.01、8.31～9.41 lg CFU/g。

圖3 產品中益生菌對模擬胃液的耐受性

6個產品對pH為1.5模擬胃液環(huán)境的耐受能力較差,產品C不耐受此條件,產品F活菌數大幅度下降,2 h后無活菌存在。產品A、B、D、E隨著消化時間的延長活菌數逐漸降低,3 h后活菌數分別降至4.55、3.64、4.64、7.01 lg CFU/g。在pH為0.9的模擬胃液中活菌數明顯減少,3 h后產品A、B、C、F無活菌存在。產品E的活菌數保留最多,0.5 h后活菌數為6.51 lg CFU/g,消化3 h后活菌數仍有3.60 lg CFU/g,益生菌對胃液的耐受性差異較大。

6種產品在不同pH的胃液中消化2 h后的存活率如圖4所示。模擬胃液pH為4.5時產品存活率在89.98%～99.03%,pH 3.5時為91.08%～108.83%,pH 2.5時為82.80%～99.15%,所有產品的存活率均高于80%,均保持在較高水平。pH為3.5時產品D中的益生菌能夠良好存活甚至緩慢生長,可能由某些菌的耐酸能力、益生元的添加以及菌株之間的協同效應等原因造成的[22]。pH為1.5時產品E存活率最高,為78.72%,而產品C、F存活率均為0%。在消化過程中大部分微生物的存活率會有所降低,這是建議持續(xù)食用益生菌來促進健康的原因之一[23]。

圖4 益生菌在不同pH模擬胃液中消化2 h后的存活率

2.3.2 益生菌對模擬腸液的耐受性

益生菌到達腸道后能否生存,很大程度上取決于其對膽鹽及胰蛋白酶等的耐受能力[24]。由表3可知,不同品牌產品在模擬腸液中消化1 h后,益生菌存活率均顯著下降(P<0.05)。消化2 h后6個產品的存活率無顯著性差異,這可能是產品中的益生元在消化過程中對益生菌具有保護作用,提高了其穩(wěn)定性[25]。消化3 h后,產品A、D、E對模擬腸液表現出良好的耐受能力,存活率分別為95.41%、97.42%和91.72%。產品F存活率最低,為53.18%,說明F不能很好的抵抗腸道內的高膽鹽滲透壓作用。

表3 產品中益生菌對模擬腸液的耐受性

2.3.3 益生菌對模擬胃腸液的耐受性

6個產品經過模擬胃腸道的存活情況如圖5所示。產品D存活率最高,達到98.39%,具有最佳的適應性；產品E次之,為94.82%；產品F最低,為60.93%。在酸性胃液和腸道高膽鹽滲透壓作用下,產品F中的活菌數顯著下降,從109CFU/g下降至105CFU/g,不能夠很好地抵抗消化道環(huán)境來實現腸道定殖,這會影響其發(fā)揮益生作用。產品B、C在模擬腸液中消化2 h后的存活率分別為75.54%和77.92%,通過模擬胃腸液后的存活率分別為89.60%和91.59%,通過條件更為苛刻的模擬胃腸液,兩者的存活率不降反增,說明益生菌在受到胃腸液的損傷后,在一定時間內仍能恢復其活性[26]。

圖5 產品中益生菌對模擬胃腸液的耐受性

3 結論

本研究對6個不同益生菌粉樣品中的活菌進行分析并對其在胃腸道的耐受性進行綜合評價。6個產品中的活菌數量都達到國標要求,但與標識數存在差異。6個產品中的益生菌在pH值為4.5、3.5、2.5的模擬胃液環(huán)境中耐受能力較好,在pH<1.5的模擬胃液中,存活率明顯降低。模擬腸消化道體系明顯抑制了微生物細胞的活性,益生菌的活性表現差異較大,產品A、D、E經過腸液消化后存活率高。但有一些微生物細胞在腸道中能夠適應并恢復其活性。不同品牌益生菌粉產品在消化過程中的耐受力不同,經過模擬胃腸液消化后,產品D存活率最高,達到98.39%,具有最佳的適應性；產品F的存活率最低,為60.93%。在實際情況下,人體消化系統(tǒng)更加復雜,益生菌活菌進入腸道面對的挑戰(zhàn)更高,提高益生菌在消化過程中的耐受力是益生菌粉開發(fā)的技術需求。對不同益生菌粉品質特性進行分析,可對市場上產品質量進行了解,對為進一步制定相關標準提供依據。