植物蛋白-益生菌復合制劑對小鼠鉛毒性的緩解作用

馬申嫣,王晶,朱家民,曹江,翟齊嘯,張灝,趙建新,田豐偉,陳衛

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

鉛是一種有蓄積性毒性的非必需金屬,在土壤、空氣和水中均能穩定存在。鉛通過消化道進入機體后,一部分可通過尿液和糞便排泄排出體外,剩余部分則被腸道吸收后隨血液循環作用于各個靶器官。鉛在體內能與酶官能團及高親和力金屬結合蛋白(如鉛結合蛋白和金屬硫蛋白)相互作用,進而介導鉛與酶的相互作用[1]。同時,鉛還能和人體多種必需微量元素競爭腸道吸收位點、酶作用靶點等誘導機體產生大量活性氧,破壞蛋白質、核酸和脂質,導致細胞死亡[2],從而引起相關疾病發生。

目前公認的鉛中毒螯合劑主要有依地酸二鈉鈣和二巰基琥珀酸,但伴有中性粒細胞減少、腸胃不適、必需礦物質排泄以及腎功能障礙等副作用[3-4],故不適合長期高劑量服用。植物乳桿菌CCFM8661是江南大學食品生物技術中心研發團隊從泡菜中篩選到的一株益生菌,并通過生理特性、動物體內實驗以及細胞實驗三方面對其進行了緩解鉛毒性功能評價及其機制解析,發現CCFM8661對鉛的吸附具有高效性和穩定性,同時,其對鉛的耐受能力較強,可通過保護腸道屏障和緩解脂質過氧化反應減少鉛對機體的損傷[5-6]。

植物蛋白主要包括從豆類和水稻中提取的大豆蛋白及大米蛋白,由于其氨基酸組成、營養素組成以及其他活性物質,不僅營養充足,同時還具有多種功效,可以調節糖尿病、心臟病、慢性腎病以及重金屬損傷等多種急性和慢性疾病[7-9]。同時,重金屬可以與大米蛋白上的巰基結合,從而降低重金屬的生物利用率[10]。研究表明,植物乳桿菌發酵植物類食品,可以提高植物乳桿菌的活力和食物的抗氧化能力[11],植物蛋白和植物乳桿菌共培養可能會提高菌體活性,進而提升其功能特性。通過不同植物蛋白與CCFM8661進行復配,探究不同復配方式對其鉛毒性緩解能力的影響。同時,市面上缺乏具有排鉛功能的復合膳食補充劑產品,本研究在發現植物乳桿菌CCFM8661具有緩解鉛毒性的基礎上,開發提高其鉛毒性緩解功效的新膳食配方,以期為市場應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 動物實驗設計

將78只3周齡的雄性C57BL/6 J小鼠隨機分為8組,如表1所示。空白組實驗動物正常飲食飲水,每天灌胃0.2 mL脫脂乳溶液；染鉛組、CCFM8661組、CCFM8661+大豆蛋白、CCFM8661+大米蛋白、大豆蛋白組、大米蛋白組和DMSA高劑量組飲用醋酸鉛溶液(鉛離子質量濃度為1 g/L),持續8周,第9周換成普通飲水[12]。前8周飲用鉛水同時,染鉛組、二巰丁二酸(dimercaptosuccinic acid,DMSA)組每天灌胃0.2 mL脫脂乳,CCFM8661組每天灌胃0.2 mL活菌數為1×109CFU的菌懸液；CCFM8661+大豆蛋白組每天灌胃0.2 mL活菌數為1×109CFU的菌懸液,大豆蛋白灌胃劑量為8 g/kg；大豆蛋白組每天灌胃0.2 mL,其大豆蛋白灌胃劑量為8 g/kg；CCFM8661+大米蛋白組每天灌胃0.2 mL活菌數為1×109CFU的菌懸液,大米蛋白灌胃劑量為8 g/kg；大米蛋白組每天灌胃0.2 mL,其大米蛋白灌胃劑量為8 g/kg。第9周普通飲水同時,DMSA組每天灌胃0.2 mL,質量濃度為10 mg/mL的DMSA溶液,其他組均灌胃等體積的PBS溶液。本實驗中,CCFM8661、大豆蛋白、大米蛋白的給藥劑量在前人研究的基礎上,結合相關預實驗結果進行了調整[13-15]。在實驗的前期、中期、后期分別單獨收集每只小鼠的糞便,實驗結束前進行行為學實驗,實驗結束后,犧牲小鼠并采集血液和組織樣品,置于-80 ℃儲存。

表1 動物實驗方案

1.2 小鼠行為學指標的測定

1.2.1 小鼠避暗實驗

參照FERLEMI等[16]與LU等[17]的方法,測定小鼠的避暗潛伏期(小鼠第1次完全進入暗室的時間)與進入暗室的次數(錯誤次數)。

1.2.2 小鼠水迷宮實驗

參照RIBES等[18]的報道進行測定,記錄小鼠1 min內的游泳軌跡,以用于考察小鼠對原平臺的記憶。

1.3 小鼠糞便、血液及組織中鉛含量的測定

按照ZHAI等[19]的方法稱取適量糞便、血液、組織樣品置于微波消解罐,加入適量濃硝酸,使用微波消解系統進行消化后,再使用石墨爐或火焰原子吸收分光光度計測定樣品中鉛含量。

1.4 小鼠組織氧化應激指標測定

按試劑盒說明書要求,對小鼠肝臟、腎臟中SOD活性和MDA含量進行檢測。

1.5 小鼠組織細胞因子及免疫球蛋白含量測定

取小鼠空腸及結腸,研磨離心后取上清液,按照試劑盒說明書測定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和sIgA的含量。

1.6 小鼠腸道菌群結構組成分析

參考MAO等[20]的研究,在實驗結束前,每只小鼠分別收集500 mg糞便,并對其糞便菌群提取測定。參照毛丙永[21]的方法,對下機數據進行處理。在Qiime平臺計算樣品的α多樣性和β多樣性。

2 結果與討論

2.1 CCFM8661+植物蛋白膳食補充劑對小鼠的學習和記憶能力的影響

如圖1所示,染鉛組進入暗室的時間與空白組有顯著差異,說明鉛暴露可損傷機體的神經系統。大豆蛋白及CCFM8661+大豆蛋白有提高避暗潛伏期的趨勢,但并不具備顯著性,說明這2種膳食干預方法不能顯著緩解鉛暴露對小鼠學習及記憶能力的干擾。而膳食干預組中CCFM8661(99.04 s)及CCFM8661+大米蛋白(176.16 s)可提高避暗潛伏期,有效緩解鉛暴露對小鼠智力的損害,其中CCFM8661+大米蛋白效果最優,甚至顯著高于DMSA藥物治療組。說明相比于單菌或單一膳食成分,大米蛋白與植物乳桿菌CCFM8661復配具有更強的緩解鉛的神經毒性作用的效果。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組

水迷宮實驗結果表明DMSA藥物治療組、CCFM8661組、大豆蛋白組、大米蛋白組、CCFM8661+大豆蛋白及CCFM8661+大米蛋白都可以有效縮短逃逸潛伏期,提高穿越平臺的次數以及在目的象限的停留時間(圖2)。其中,CCFM8661+大豆蛋白及CCFM8661+大米蛋白緩解神經毒性效果最佳。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-第6天的逃逸潛伏期；b-第6天穿越平臺次數；c-第6天目的象限與其他象限的時間比

2.2 CCFM8661+植物蛋白膳食補充劑對小鼠機體鉛含量的影響

如圖3所示,相比于鉛造模組,大豆蛋白、大米蛋白、植物乳桿菌 CCFM8661以及CCFM8661+大米蛋白組均可以顯著增加糞便中鉛含量,表明其可促進機體鉛排泄。同時,除大米蛋白組的血鉛含量、大豆蛋白組和大米蛋白組的肝臟鉛含量有下降趨勢但不明顯外,其余膳食干預組小鼠血液及組織中的鉛含量均顯著下降,其中CCFM8661+大豆蛋白和CCFM8661+大米蛋白緩解鉛毒性的效果最顯著。CCFM8661+大豆蛋白在降低血鉛、肝鉛、腦鉛含量方面與DMSA藥物治療組效果相當,CCFM8661+大米蛋白在緩解血液鉛含量方面與DMSA給藥組達到相同水平,同時2種復合膳食補充劑緩解腎臟鉛毒性的能力顯著高于DMSA給藥組。表明大豆蛋白和大米蛋白與CCFM8661進行復配可以顯著降低鉛在體內的蓄積。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-血液中的鉛含量；b-肝臟中的鉛含量；c-腦中的鉛含量；d-腎臟中的鉛含量；e-糞便中的鉛含量

研究表明,植物乳桿菌發酵豆乳可有效增強益生菌的活力,提高發酵豆乳中的礦物質和異黃酮的生物利用度,改善機體異常氧化應激及腸道菌群組成[22]。益生菌發酵后的大豆蛋白在微生物酶的作用下,被降解成許多具有新功能的多肽和生物活性物質,從而降低大豆蛋白的免疫反應性[23],提高營養利用率[24]。本研究中的植物乳桿菌CCFM8661和植物性膳食成分大豆蛋白、大米蛋白復配可能也能通過相似機制產生相互作用,從而提高CCFM8661緩解鉛毒性的效果。

2.3 CCFM8661+植物蛋白膳食補充劑對小鼠組織氧化應激水平的影響

由圖4可知,鉛中毒導致小鼠肝臟及腎臟中MDA含量升高、SOD活性下降。藥物治療及膳食成分干預均能顯著降低肝臟及腎臟中的MDA含量,其中CCFM8661+大米蛋白效果最明顯；此外,補充DMSA及所有膳食成分均能夠使小鼠肝臟中SOD活性顯著提高,其中大米蛋白復配CCFM8661效果最顯著,而腎臟中SOD活性在DMSA藥物治療組、CCFM8661+大豆蛋白組及CCFM8661+大米蛋白組均表現出顯著提升,其中大豆蛋白與大米蛋白和CCFM8661的復配效果最顯著。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-肝臟MDA含量；b-肝臟SOD活性；c-腎臟MDA含量；d-腎臟SOD活性

綜合以上研究結果,CCFM8661+大米蛋白對恢復鉛中毒引起的異常的氧化應激反應效果最明顯。這可能因為大米蛋白及其衍生的水解產物和特定的多肽組分具有強大的抗氧化等生物活性功能[25-26],而且植物乳桿菌CCFM8661在鉛誘導的氧化應激中發揮了顯著的保護作用[13],故與單一組分相比,大米蛋白與植物乳桿菌CCFM8661復配能夠更顯著的緩解鉛中毒引起的脂質過氧化并提高SOD活性。

2.4 CCFM8661+植物蛋白膳食補充劑對小鼠腸道免疫功能的影響

鉛暴露可以通過加劇炎癥反應破壞免疫屏障,進而損傷機體腸道物理屏障,加速重金屬鉛進入機體。CCFM8661+植物蛋白對小鼠腸道免疫指標的影響見圖5和圖6。結果表明鉛暴露會增加小鼠腸道IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量,同時降低sIgA含量；除空腸中大豆蛋白組和大米蛋白組的TNF-α含量,以及結腸中的大米蛋白組和CCFM8661+大米蛋白組的IL-1β含量無顯著變化外,所有膳食干預組均顯著降低了炎癥因子含量并增加了sIgA含量。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-IL-1β含量；、b-IL-6含量；c-IL-8含量；d-TNF-α含量；e-sIgA的含量

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-IL-1β含量；、b-IL-6含量；c-IL-8含量；d-TNF-α含量；e-sIgA的含量

在結腸中,大豆蛋白復配CCFM8661相比于單一CCFM8661及大豆蛋白對IL-1β、IL-6和TNF-α的恢復效果更顯著,并與DMSA藥物治療恢復至相同水平；同時,相比于單獨灌胃CCFM8661和大米蛋白,灌胃CCFM8661+大米蛋白可以顯著降低IL-6的含量,并在恢復IL-6、IL-8、sIgA和TNF-α含量方面的效果與DMSA一致或更強。而在空腸中,與灌胃單一組分的膳食成分相比,CCFM8661+大豆蛋白和大米蛋白膳食補充劑顯著降低了促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的含量,與DMSA給藥組相同,恢復至空白組水平。以上結果說明CCFM8661+大豆蛋白和CCFM8661+大米蛋白可顯著緩解鉛暴露引起的炎癥反應,保護腸道免疫屏障。

研究表明,富含異黃酮的大豆蛋白可以使血漿和肝臟中的TNF-α、IL-1β降低,緩解脂肪肝小鼠的肝臟炎癥[27]。大米蛋白水解物可通過抑制TNF-α的釋放顯示出顯著的抗炎和免疫特性,且補充大米蛋白水解物與TNF-α、IL-6和IL-1β的降低呈劑量依賴關系[28]。此外,益生菌已經被證實能夠調節腸道炎癥,本研究表明相比于單一組分,益生菌分別與大豆蛋白和大米蛋白復配的膳食補充劑能夠更加有效緩解鉛中毒引起的腸道炎癥反應。

2.5 CCFM8661+植物蛋白膳食補充劑對小鼠腸道菌群的影響

由圖7可知,經分析有變化的特定門水平發現,染鉛組可顯著降低了小鼠Actinobacteria和Bacteroidetes的相對豐度,提高了Proteobacteria的豐度,這與ZHAI等[29]的研究結果一致。DMSA給藥組可以恢復鉛暴露引起的菌群紊亂至正常水平,抑制鉛中毒現象。補充CCFM8661+大豆蛋白和CCFM8661+大米蛋白可以使Bacteroidetes和Proteobacteria的含量恢復至空白組水平,與DMSA給藥組呈現相同的趨勢,說明2種復合膳食補充劑可能通過改善菌群結構保護腸道健康。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-Actinobacteria的相對豐度；b-Bacteroidetes的相對豐度；c-Proteobacteria的相對豐度

針對小鼠的腸道菌群在屬水平上的組成進行進一步分析發現(圖8),鉛暴露能顯著降低了Allobaculum和Bacteroides的相對豐度。MENG等[30]研究報道銅暴露小鼠中Allobaculum、Bacteroides的相對豐度減少,表明腸道免疫反應異常,這與本研究研究結果一致。作為腸道菌膜屏障的組成部分,鉛暴露后,參與哺乳動物結腸中黏膜相關代謝的Bacteroides和Allobaculum等在腸道中的含量下降,為腸球菌、腸桿菌等致病菌的侵襲和定殖提供了機會,致病菌產生過量內毒素,導致腸道生態失調,形成惡性循環[31]。與鉛造模組相比,補充CCFM8661+大豆蛋白和CCFM8661+大米蛋白可有效恢復上述種屬變化,使其接近空白組水平,同時還可顯著上調Akkermansia和Pseudomonas的相對豐度。其中Akkermansia具有潛在的免疫調節和抗炎作用[32],也可增強腸黏膜傷口的修復,并誘導緊密連接蛋白的表達[33-34],降低腸道通透性,從而保護腸道屏障。雖然2種復合膳食補充劑的排鉛功能與種屬的特定變化有一定關聯,但具體的關聯機制還需進一步研究分析。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-Akkermansia的相對豐度；b-Pseudomonas的相對豐度；c-Allobaculum的相對豐度；d-Bacteroides的相對豐度

3 結論

綜上所述,CCFM8661與植物蛋白復配能夠顯著增強其鉛毒性緩解能力。其中CCFM8661+大豆蛋白促進糞便鉛排泄,降低組織鉛含量及緩解腸道炎癥的效果更顯著,這可能由于植物乳桿菌發酵大豆蛋白能顯著提高益生菌的活力,促進腸道蠕動,提高糞便鉛排泄,而大豆蛋白被降解成多肽和生物活性物質,兩者共同改善機體異常氧化應激及腸道菌群組成,保護腸道免疫屏障并阻礙鉛被胃腸道吸收利用。此外,補充CCFM8661+大米蛋白能顯著緩解鉛對神經系統的毒害及肝腎臟的氧化損傷,其主要作用機制可能是通過CCFM8661發酵大米蛋白產生的水解產物和多肽組分具有強大的抗氧化等生物活性功能,而且發酵后活性增強的CCFM8661能通過腦腸軸更好地緩解鉛的神經毒性。以上表明,CCFM8661能夠與植物蛋白進行復配,并作為一款具有排鉛功能的復合膳食補充劑產品進入市場,彌補目前市場上關于這類產品的空白。同時,復配產生的功能增強效果也為同類功能性菌株的進一步開發與應用提供了指導。