降解黃曲霉毒素B1的乳酸片球菌重組多銅氧化酶學性質

劉暢,馬現永,馬三梅*,鄧盾*

1(暨南大學 生物工程學系,廣東 廣州,510632) 2(廣東省農業科學院動物科學研究所 畜禽育種國家重點實驗室 農業農村部華南動物營養與飼料重點實驗室 廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室 廣東畜禽肉品質量安全控制與評定工程技術研究中心,廣東 廣州,510640)

黃曲霉毒素(aflatoxin,AFT)是一類致毒性超強的真菌毒素,主要是由黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparaciticus)產生[1]。目前已經發現了20多種黃曲霉毒素,根據其結構的不同可以大致分為2類：AFB和AFG[2]。其中黃曲霉毒素B1(Alfatoxin B1,AFB1)分布最廣泛,毒性也最強。畜禽食用含有AFB1的飼料會引起肝臟損傷、免疫力下降甚至死亡；人長期食用被AFB1污染的農產品會引起嘔吐、發育遲緩并誘發肝癌[3]。肝臟既是代謝AFB1的主要場所,同時也是AFB1損傷的主要器官,其損傷過程是由CYP450酶系、線粒體、免疫系統和自由基等機制介導的復雜轉化過程[4]。鑒于AFB1的毒性,如何避免AFB1感染和進行AFB1脫毒,對于食品安全至關重要。

黃曲霉毒素降解的方法一般有物理法[5-6]、化學法[7-8]和生物降解法。物理法和化學法會使原料中營養成分流失,還可能產生新的有害物質[9]。生物降解法主要是利用微生物產生的次級代謝產物或酶將有毒基團分解,具有專一性強、效率高等優點[10]。細菌和真菌中都存在著可以降解AFB1的微生物[11],可降解AFB1的細菌主要有渾濁紅球菌(Rhodococcusopacus)[12-13]、橙紅色粘球菌(Myxococcusfulvus)[9]、食醚紅球菌(Rhodococcusaetherivorans)[14]、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtills)[15]、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)[16-17]等,真菌主要有寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、白腐菌(Trametesversicolor)和假蜜環菌(Armillariellatabescens)等[10]。但是關于微生物降解AFB1的相關酶的報道卻不多。研究表明,在降解AFB1中起作用的酶包括乳過氧化氫酶[18]、漆酶[3]和黃曲霉毒素氧化酶[19]等。但是目前仍缺乏能夠實際應用的微生物酶,有關黃曲霉解毒酶的開發工作仍需要進一步加強。多銅氧化酶具有來源廣泛、易于獲取、底物譜廣泛、對環境非常友好等優點[20-21]。因此,多銅氧化酶在工業上有著廣泛的應用前景,是一類開發潛力較強的霉菌毒素脫毒劑[22-23]。

本文從乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici7_4)基因組中篩選到一種多酮氧化酶,通過基因工程的手段重組到大腸桿菌中進行誘導表達,得到重組的大腸桿菌。將重組大腸桿菌的多銅氧化酶純化,研究其對AFB1的降解能力以及酶學性質,進一步探究重組多銅氧化酶的降解潛力,為后續深入研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

AFB1標準品,上海佰曄生物科技中心;乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)、丁香醛(syringaldehyde,SA)、阿魏酸(ferulic acid,FA)、1-羥基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole,HBT)、酚紅(phenol red,PhR)、2,2′,6,6′-四甲基呱啶氧化物(2,2′,6,6′-tetramethyl-piperidine-N-oxyl,TEMPO)、2,2′-聯氨-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS),生工生物工程(上海),色譜級乙腈、色譜級甲醇,上海阿拉丁試劑有限公司

1.2 AFB1的檢測

向反應后的樣品中加入5 mLV(乙腈)∶V(水)=84∶16的混合液,再加入1 mL正己烷,用旋渦振蕩器充分混勻,靜置60 min,取下層溶液經0.22 μm聚偏氟乙烯濾膜過濾后進樣。使用高效液相色譜-光化學反應器-熒光檢測器(high performance liquid chromatography-Photoelectric reactor-Fluorescence detector,HPLC-PHR-FLD)的方法對AFB1進行檢測。色譜條件：色譜柱為X-BridgeTMC18(4.6 mm×250 mm,5 μm),進樣量20 μL,流動相為V(甲醇)∶V(水)∶V(乙腈)=35∶55∶10,流速1 mL/min,柱溫30oC,熒光激發光波長360 nm,發射光波長440 nm[24]。

1.3 酶活力測定

將1 min 轉化1 pmol AFB1所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。酶降解AFBl的活性采用U/mg的形式表示。

1.4 試驗方法

1.4.1 基因克隆及載體構建

P.acidilactici7_4基因組信息已公布在NCBI上(NZ_ACXB00000000),其基因組中多酮氧化酶D2EK17編碼的基因NZ_GG730086.1由安徽通用系統生物有限公司合成,基因兩端添加EcoRI和XhoI酶切位點,將載體和基因片段分別用EcoRI和XhoI酶切,T4連接酶連接后轉入DH5α感受態細胞,冰浴30 min,在42 ℃水浴鍋熱激90 s,冰浴2 min后加入500 μL LB液體培養基37 ℃,200 r/min培養1 h。培養物離心后涂布在含有50 μL/mL的卡那霉素 LB 平板,培養16 h左右后挑選單菌落,經酶切和測序驗證無誤后,將構建好的pET-28a(+)-CueO轉入到BL21(DE3)感受態細胞中。

1.4.2 重組CueO表達與純化

將含有pET-28a(+)-CueO轉入到BL21(DE3)的單菌落加入含有0.1 mg/mL卡那霉素的LB液體培養基中,37 ℃,170 r/min搖床培養24 h。活化的菌液以1%的接種量培養至OD600為0.6左右,加異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)使其濃度為0.5 mmol/L,同時加入250 mmol/L的無菌硫酸銅溶液,使其終濃度為0.25 mmol/L,16 ℃,150 r/min,培養18～20 h。菌液4 ℃,4 000 r/min,離心10 min,收集菌體。100 mL菌體用25 mL(50 mmol/L,pH 7.2)磷酸緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)重懸菌體,冰水浴超聲破碎15 min,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,收集上清液。上清液通過鎳柱結合后,用30 mmol/L的咪唑洗脫雜蛋白,最后用300 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白。使用購自生工生物工程公司的C500090脫鹽柱進行脫鹽,具體方法參照說明書。純化脫鹽后的蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel-electrophoresis,SDS-PAGE)鑒定分子質量和純度。

1.4.3 酶學性質分析

1.4.3.1 不同介體對重組CueO降解AFB1的影響

反應在一個20 mL無菌玻璃瓶中進行,反應體系為1 mL,包括：20 μL 5 μg/mL的AFB1標準液,380 μL 純化后的酶液(含純酶193.04 μg,下同),濃度為100 mmol/L的不同介體100 μL,生理鹽水500 μL。反應體系在37 ℃下避光靜置反應12 h。每個處理3個重復,以不加入酶的反應體系作為對照。反應結束后用1.2小節的萃取回收方法處理,使用HPLC-PHR-FLD測定AFB1含量。

1.4.3.2 重組CueO降解AFB1的最適溫度和熱穩定性

最適溫度：反應在一個20 mL無菌玻璃瓶進行,反應體系為1 mL,包括：20 μL 5 μg/mL的AFB1標準液,380 μL 純化后的酶液,100 μL 100 mmol/L的SA溶液100 μL,500 μL 生理鹽水。反應體系在4、30、37、50、60、70、80 ℃下避光靜置反應12 h,每個處理3個重復,以不加入酶的反應體系作為對照。反應結束后用1.2小節的萃取回收方法處理,使用HPLC-PHR-FLD測定AFB1含量。

熱穩定性：將酶液分別放置在不同溫度(4、30、37、50、60、70、80 ℃)下處理2 h,12 000 r/min,離心5 min,取上清液。反應在一個20 mL無菌玻璃瓶中進行,反應體系為1 mL,包括：20 μL 5 μg/mL的AFB1標準液,380 μL 處理后的酶液,100 μL 100 mmol/L的SA溶液,生理鹽水500 μL。反應體系在37oC下避光靜置反應12 h。每個處理3個重復,以不加入酶的反應體系作為對照。反應結束后用1.2小節的萃取回收方法處理,使用HPLC-PHR-FLD測定AFB1含量。

1.4.3.3 重組CueO降解AFB1的最適pH

反應在一個20 mL無菌玻璃瓶中進行,反應體系為1 mL,包括：20 μL 5 μg/mL的AFB1標準液,380 μL 純化后的酶液,100 μL 100 mmol/L的SA溶液,500 μL 緩沖液(pH值為4.0～10.0)。反應體系在37 ℃下避光靜置反應12 h,每個處理3個重復,以不加入酶的反應體系作為對照。反應結束后用1.2小節的萃取回收方法處理,用HPLC-PHR-FLD測定AFB1含量。

1.5 Km與Vmax的測定

選用不同質量濃度的AFB1(50、100、200、400、800、1 000、2 000 ng/mL)作為底物,在最適溫度與最適pH條件下反應24 h,通過公式(1)[25]計算出反應速率[pmol/(min·mg)],使用米氏方程獲得Km和Vmax值[26]。

(1)

1.6 降解產物的毒性分析

降解產物毒性分析實驗設置3個處理,分別是未反應的AFB1、CueO降解后的AFB1以及SA介體對照(含有SA和AFB1)。反應在一個250 mL無菌錐形瓶中進行,反應體系為50 mL,包括：500 μL 1 mg/mL的AFB1標準液,44.5 mL 純化后的酶液,5 mL 100 mmol/L的SA溶液。反應體系在37 ℃下避光靜置反應12 h。未反應的AFB1處理組和SA介體對照組中用pH 7.0的磷酸緩沖液代替酶液,反應結束后用旋轉蒸發儀濃縮樣品,DMSO回收AFB1用于下一步實驗,每個處理做3個重復。

取處于生長對數期的LO2肝細胞,消化后用1640培養液吹勻成單細胞懸液。細胞計數后,以5×104cell/mL的密度種進96孔板中,每孔加入100 μL。5% CO2,37 ℃隔夜貼壁陪養后,加入100 μL降解產物處理液。繼續培養48 h后每孔加入20 μL 5 mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT),繼續培養4 h。吸掉上清液后每孔加入200 μL DMSO,置搖床振勻后,測量各孔在570 nm處的吸光值[27]。

2 結果與討論

2.1 序列分析

CueO的開放閱讀框由1 434個堿基構成,對應477個氨基酸殘基。通過SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)同源建模法預測蛋白質結構,根據可信度(GMQE)選擇合適的模板。其中可信度最高的模板是2yxw.1(GMQE為0.61)。3zx1.1的GMQE為0.53,6iqx.1的GMQE為0.58。根據模板可推測,CueO氨基酸序列含有細菌多銅氧化酶的保守序列HXHG,HXH,HXXHXH和HCHXLXHEDXXM(紅色下劃線部分),符合多銅氧化酶序列特征。

圖1 CueO氨基酸序列多序列比對結果

2.2 蛋白表達純化

CueO蛋白的理論分子質量為54.36 kD,pI為5.42。經過SDS-PAGE檢測(圖2),重組蛋白可以在上清液中表達。使用30 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白,300 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白,純化的純度較好。重組蛋白分子質量大小約60 kDa左右,比CueO理論分子量稍大,原因是pET-28a(+)載體上N端序列和CueO融合表達,加上這部分氨基酸殘基的分子質量和電泳結果一致。以上結果說明CueO可以在大腸桿菌中實現可溶性表達。

1-Ni-NTA純化后的CueO;2-IPTG誘導后E.coli BL21(DE)3,pET28(a)-CueO可溶蛋白;3-IPTG誘導后E.coli BL21(DE)3,pET28(a)-CueO不可溶蛋白;4-IPTG誘導后E.coli BL21(DE)3,pET28(a)-CueO全細胞;5-Marker;6-E.coli BL21(DE)3,pET28(a)-CueO未誘導

2.3 重組CueO對AFB1的降解性質

2.3.1 不同介體對重組CueO降解AFB1的影響

常見介體主要分為2大類,即天然介體(natural mediators)和合成介體(synthetic mediators)[7]。實驗比較了7種不同介體對重組CueO酶降解AFB1活性的影響。AS、SA、FA屬于天然介體；ABTS、HBT、PhR和TEMPO為合成介體。由圖3可知,介體本身對AFB1會有一些降解作用,但不同的介體催化AFB1的反應能力不同,其中SA最強。當加入重組CueO酶時,“CueO-介體”催化AFB1降解的能力均顯著提高,SA作為介體時,相對降解率最高,達到96.89%。

圖3 不同介體對AFB1降解率的影響

AS次之,相對降解率達到76.52%,HBT和ABTS效果較差。因此CueO最佳的反應介體是SA。

漆酶催化氧化還原反應,對底物具有一定選擇性,只有氧化還原勢能低于漆酶的物質,且能夠進入活性中心的物質才能直接被漆酶氧化[28]。而高于漆酶氧化還原勢能的底物,需要有介體參與才能被氧化[29]。由于漆酶CueO不能和AFB1直接反應,漆酶-介體-底物的反應是否能夠進行,取決于介體是否能夠進入到活性中心以及介體的氧化還原勢能。CueO-SA具有較強的AFB1降解能力可能和上述原因相關。

2.3.2 重組CueO降解AFB1的最適溫度和熱穩定性

不同溫度條件下,重組CueO降解AFB1的結果如圖4所示。重組CueO在37 ℃下相對降解率最高,隨著溫度的升高呈現先升高再降低的趨勢。從4 ℃到37 ℃,溫度越高,AFB1相對降解率越高,降解效果越好。當溫度超過37 ℃時,降解率開始急劇下降。由此可見重組CueO降解AFB1的最適反應溫度為37 ℃。

圖4 溫度對AFB1降解率的影響

該重組CueO酶在4 ℃處理后,相對降解率最高。50 ℃處理后,酶對AFB1的相對降解率下降了26.89%；在80 ℃時,酶失去活性。因此該酶在低于70 ℃時,具有一定的熱穩定性。

2.3.3 重組CueO降解AFB1的最適pH

在不同pH緩沖液處理下,降解AFB1結果如圖5所示。重組CueO在pH 4.0～6.0,隨著pH值的升高,AFB1的降解率呈現下降趨勢。當pH為7.0時,重組CueO降解AFB1效果最好。pH值超過7.0之后,隨著pH值的升高,AFB1降解率反而降低。因此,重組CueO降解AFB1的最適pH為7.0。

圖5 不同pH條件對AFB1降解率的影響

在上述優化的條件下,以SA為介體檢測了重組酶CueO降解AFB1的能力,結果如圖6所示,AFB1的出峰時間在11.45 min左右,隨著反應時間的延長峰面積不斷減少,12 h后對100 ng/mL AFB1的降解率可達64.8%。

圖6 重組CueO酶降解AFB1的HPLC結果

2.3.4 底物濃度對重組CueO降解AFB1酶活力的影響

比較了從0～0.006 4 μmol/L濃度下重組CueO降解AFB1的酶活變化。在起始階段,隨著底物濃度的增加,重組CueO的酶活力不斷增加,但到0.003 2 μmol/L(1 000 ng/mL)時酶活力達到最大值,為7.895 U/mg,之后再增加底物濃度,其降解AFB1活性不再增加。

圖7 底物濃度對重組CueO降解AFB1酶活的影響

2.4 Km與Vmax的測定

利用GraphPad Prism5.0計算重組CueO的Km與Vmax,通過Michaelis-Menten做圖,計算出Km=1.99×10-3μmol,Vmax=11.31 pmol/(min·mg)。

2.5 降解產物的毒性分析

通過MTT實驗,得到了不同質量濃度AFB1對人肝細胞LO2存活率的影響,0～0.5 μg/mL AFB1對肝細胞LO2存活率影響不大。當AFB1質量濃度達到10 μg/mL時,細胞存活率下降到51.29%。因此實驗選用10 μg/mL作為AFB1的處理質量濃度。

將未處理的AFB1、回收的降解產物以及SA對照(含有介體和AFB1)加入到肝細胞中混合培養,以比較三者的細胞毒性差異,結果如圖8所示。與未降解的AFB1相比,CueO脫毒產物對細胞毒性明顯降低,細胞存活率上升了24.86%；同時,未降解的AFB1組與SA對照組對肝細胞的毒性影響差異不顯著。這些結果說明了重組酶CueO不僅可以有效的降解AFB1,而且降解產物對細胞的毒性明顯減少。

圖8 降解產物對肝細胞LO2存活率的影響

3 結論

本文首次研究了乳酸菌多酮氧化酶對AFB1的降解效果,發現Pediococcusacidilactici7_4中多銅氧化酶CueO基因可在大腸桿菌中成功表達出可溶性蛋白,純化獲得的重組多銅氧化酶CueO對AFB1有降解作用。重組CueO最佳介體為SA,最適溫度為37 ℃,最適pH為7.0。通過Michaelis-Menten法計算得Km=1.99×10-3μmol,Vmax=11.31 pmol/(min·mg),表明其對AFB1的親和力較強。細胞毒性實驗表明,重組CueO可以有效降解AFB1,并且降解產物對細胞毒性降低,具有進一步的研究和開發價值。