酸啤酒釀造用乳酸菌的篩選及應用

肖健,蔡國林*,吳殿輝,李曉敏,陸健*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)3(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

乳酸菌廣泛存在于人體的腸道中,能促進動物生長、調節胃腸道菌群,從而調節胃腸道穩態等,常用于食品生產,但在啤酒釀造中卻應用很少。在適當的條件下,啤酒可以作為乳酸菌的載體[1]。

在工業啤酒中,乳酸菌常被認為是啤酒腐敗菌,影響啤酒口感,乳酸菌污染占啤酒釀造行業報告所有污染的70%。但并不是所有的乳酸菌都是啤酒腐敗菌[2]。酵母菌和乳酸菌都可以通過在發酵過程中產生各種風味化合物來增加感官特征[3]。DYSVIK等[4]研究證明,植物乳酸菌與釀酒酵母共發酵釀造的啤酒比對照啤酒增強了果味和干果味。隨著消費者對啤酒品質和個性體驗需求的提升,導致由小型啤酒生產線生產,且在釀造過程中不添加與調整啤酒風味無關的物質,風味特點突出的工坊啤酒受到了廣大消費者的青睞,而口感酸甜且富含乳酸菌的酸啤酒就是其中的一種[5]。工坊啤酒在酒精度和苦味值(以異α-酸計)上遠遠高于傳統工業啤酒,由于缺乏工坊啤酒釀造專用乳酸菌的選育等應用基礎研究工作,目前大部分乳酸菌不能耐受工坊啤酒的較高酒精度和高苦味值,導致酸啤酒良莠不齊,質量波動性大,難以達到消費者的心理預期。

本研究主要通過乳酸菌的對酒精度和異α-酸耐受性的分析,結合益生潛力評價,篩選獲得1株適用于工坊啤酒釀造用的乳酸菌,并開發一款口感酸甜、醇厚豐滿且果香濃郁的工坊啤酒,同時還富含活性乳酸菌,以期進一步拓展乳酸菌在發酵食品中的應用,豐富工坊啤酒的品類。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸奶,無錫當地超市；大麥麥芽,粵海永順泰集團股份有限公司；酒花浸膏、酒花顆粒,上海金啤食品原料有限公司；釀酒酵母S-23,實驗室保藏；酵母提取物蛋白胨,英國OXOID公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離

乳酸菌的分離按照KANG等[6]的方法執行。

1.2.2 乳酸菌的初步篩選

將分離得到的乳酸菌進行2次活化(37 ℃,12 h),按體積分數為2%的接種量分別接種于含有5%(體積分數,下同)酒精的MRS培養基中,12 ℃靜置培養7 d,每24 h測其OD600。將耐酒精優勢菌株2次活化(37 ℃,12 h),按體積分數為2%的接種量分別接種于苦味值為25 BU的MRS培養基中,12 ℃靜置培養7 d,每24 h測其OD600。

1.2.3 啤酒釀造用乳酸菌的確定

乳酸菌細胞表面疏水性采用乳酸菌對2種碳氫化合物的黏附的方法執行[7]。乳酸菌人工胃腸液耐受性按照印伯星[8]的方法執行。

1.2.4 啤酒釀造用乳酸菌的鑒定

乳酸菌鑒定采用基于16S rDNA的方法進行[9]。將乳酸菌的16S rDNA序列通過NCBI BLAST與Genebank中已知細菌的16S rDNA序列進行比對。利用MEGA6軟件,構建系統進化樹[10]。

1.2.5 乳酸菌啤酒的指標測定

將大麥麥芽采用EBU磨進行粉碎,以料水比為1∶5(g∶mL)進行糖化,糖化工藝為：52 ℃保溫10 min,升溫至65 ℃保溫70 min,再升溫至72 ℃保溫10 min,最后升溫至78 ℃保溫10 min；糖化結束后過濾,用78 ℃水洗糟；煮沸60 min,期間酒花分3次添加,分別為煮沸0 min投入0.1 g/L馬格努門酒花,煮沸45 min時投入0.1 g/L馬格努門酒花,煮沸結束投入0.1 g/L卡斯卡特酒花；最終完成12°P定型麥汁。麥汁冷卻充氧后同時接種乳酸菌和酵母共同發酵,乳酸菌接種量為2%(體積分數),酵母數量控制在7 lg CFU/mL,12 ℃發酵至日失量小于0.2 g/d；主發酵結束后,4 ℃進行后發酵7 d。

酒精度、真正發酵度、原麥汁濃度、真正濃度參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》進行測定；pH值由pH計測定；總酸測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；啤酒揮發性物質按照YANG等[11]的方法測定；感官評價由經過訓練的20人品嘗小組按照100分的方法進行,感官評價標準見表1。

表1 乳酸菌酸啤酒感官評價表

1.2.6 數據分析

實驗均重復3 次,數據以平均值±標準偏差表示。采用SOSS 22進行分析,并進行單因素方差分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 工坊啤酒釀造用乳酸菌的初步篩選

對酒花顆粒、啤酒發酵液和酸奶中分離得到形態不一,差異性較大的若干株乳酸菌進行酒精和異α-酸耐受性實驗,其在酒精和異α-酸存在時的生長曲線如圖1所示。乳酸菌在5%的酒精下有較好的生長。對其進行耐高苦味值能力測定,篩選得到7株優勢菌株,分別重新命名為J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7(均來自于啤酒發酵液)。異α-酸對乳酸菌生長有較大的抑制作用,它們作為離子載體,在胞質膜上驅散pH梯度,降低質子移動勢(proton motive force,PMF)。因此,依賴于PMF的養分吸收受阻,導致細胞死亡[12]。與其他菌株相比,菌株J6在5%酒精度和25 BU苦味值下生長情況均為最佳。

a-耐酒精生長曲線圖；b-耐異α-酸生長曲線圖

2.2 乳酸菌的表面疏水性及人工胃腸液耐受性

乳酸菌對腸道上皮細胞的黏附是其定植的前提,而乳酸菌表面疏水性是其黏附能力的重要表征[13]。乳酸菌的細胞表面疏水性結果如圖2所示。菌株J5和J6表現出良好的疏水性,其中菌株J6對2種碳氫化合物的黏附率最高。

圖2 七株優勢乳酸菌表面疏水性

為了使乳酸菌更好的發揮其益生作用,它們應該保持較高的胃腸道存活率。菌株J6在人工胃液和人工腸液2 h中的存活率分別達到77.6%和92.4%。劉江等[14]通過從傳統發酵食品中分離得到的植物乳桿菌,其在pH=3.0的培養基中16 h的存活率能夠達到87.29%,有很好的耐酸性,這與本研究結果一致。菌株J6在人工腸液2和4 h條件下,其存活率沒有顯著差異(P>0.05),且有很好的存活率。

綜合上述實驗結果,只有菌株J6在各項指標中表現出較好的結果,其在5%酒精度和25 BU苦味值下生長情況均為最佳,疏水性、人工胃液和人工腸液存活率分別達到81.6%(正辛烷)、77.6%(2 h)和92.4%(2 h)。故選用該菌株作為酸啤酒釀造菌株。進一步采用16S rDNA測序,經過BLAST分析,鑒定其為植物乳桿菌,將其命名為植物乳桿菌J6,構建的進化樹如圖3所示。

圖3 植物乳桿菌J6的系統進化樹

2.3 植物乳桿菌J6在工坊啤酒中的應用

對成品啤酒進行理化指標的測定,結果如表2所示。乳酸菌啤酒與對照啤酒在真正濃度、原麥汁濃度、發酵度和酒精度上沒有顯著差異性(P>0.05),表明乳酸菌的加入,并不會對啤酒常規理化指標產生影響；這也與前人報道一致,劉彩霞等[15]研究干酪乳桿菌與釀酒酵母共發酵,發酵結束其酒精度與對照啤酒之間沒有顯著性差異。但在pH和總酸含量這2個指標與對照之間存在著極顯著性差異(P<0.01),且在口感上有著明顯酸感[16]；馬立娟等[17]在研究乳酸乳球菌、干酪乳桿菌和酵母之間的相互作用,發現干酪乳桿菌與酵母混合發酵比純酵母發酵能夠更大幅度的降低其pH。此外,乳酸菌啤酒中還含有7.34 lgCFU/mL的活性乳酸菌,一般認為活性乳酸菌數>7.00 lgCFU/mL是比較滿意的水平[18]。乳酸菌啤酒色澤光亮,泡沫細膩,泡持性久,具有口感酸甜,酒體醇厚豐滿,香味協調且有更高的果香,得到較高感官評價分,而對照啤酒泡沫較細膩,酒香平淡,口感柔和。

表2 乳酸菌酸啤酒與對照啤酒指標對比

乳酸菌酸啤酒和對照啤酒發揮性物質濃度對比見表3。從表3可以看出,乳酸菌啤酒的總高級醇和總酯分別達到了149.25和47.60 mg/L,此對照組分別提高了19.48%和28.68%,其中乙酸乙酯和乙酸異戊酯顯著提高(P<0.05),比對照分別提高了26.86%和59.31%,這可能由于植物乳桿菌產生的乙酸被酵母代謝,產生了更多的乙酸乙酯和乙酸異戊酯[19]。根據文獻報道,乙酸乙酯和乙酸異戊酯與水果味相關[4]。

表3 乳酸菌酸啤酒和對照啤酒揮發性物質濃度

3 結論

分離得到1株具有耐高酒精度和耐高苦味值的植物乳桿菌J6,體外益生潛力評價表明,該菌對正辛烷和正十六烷的疏水性分別是81.6%、80.0%,在人工胃液和人工腸液2 h存活率分別是77.6%、92.4%。同時,在與釀酒酵母混合發酵時有更好的感官評價,泡沫細膩,泡持性久,口感酸甜,酒體醇厚豐滿,香味協調,總高級醇和總酯含量分別達到了149.25和47.60 mg/L,更重要的是,還富含活性乳酸菌,大大提高了啤酒的營養價值,符合當今消費者的需求。