高產蛋白酶菌的篩選及其對螺旋藻發酵物活性的影響研究

劉云鵬,尤升波,馬德源,夏晗,邊斐,耿耘,石士濤,于金慧*,畢玉平,,*

1(山東師范大學 生命科學學院,山東 濟南,250014)2(山東省農業科學院 生物技術研究中心,山東 濟南,250100) 3(山東大學 生命科學學院,山東 青島,266237)

蛋白酶廣泛應用于食品、養殖等行業,而微生物作為工業酶制劑的主要來源具有生長空間小、速度快、可控性強等諸多優勢。研究人員分離出多種高產蛋白酶的微生物資源[1-3]。常用篩選方法包括蛋白酶產生水解圈和蛋白酶活性測定。曹慧等[1]從青藏高原土壤樣品中獲得枯草芽胞桿菌XC2;陳蘢等[4]從南昌大學食堂污水中篩選的解淀粉芽孢桿菌CL-10均具有較高的產蛋白酶活力。由于微生物資源豐富且菌株之間存在特異性,更加廣泛地篩選高產蛋白酶菌株并開展其應用研究仍是微生物領域重要的研究方向。

近年來有關螺旋藻發酵的研究多有報道,如乳酸菌和枯草芽胞桿菌混菌發酵螺旋藻可提高多肽和必需游離氨基酸含量分別達16%～19%和6%～19%[5],藏靈菇發酵的螺旋藻酸奶風味成分顯著增加,且醇類物質增加,酸類物質減少[6]。螺旋藻發酵產物還具有多種生物活性,乳酸菌單菌發酵螺旋藻得到的發酵產物抗氧化活性有所提高,但因菌株而異[7],混菌發酵螺旋藻提取物對小鼠原發性脾淋巴細胞具有增殖和免疫調節潛力[8],枯草芽胞桿菌單菌發酵螺旋藻渣所得抗菌肽SP-AP-1和Iturin A對金黃色葡萄球菌具有較強的抑制效果[9]。前人開展了大量有關螺旋藻肽的制備研究,以酶解為主[10-13]。與利用純酶制劑相比,采用發酵法可因微生物的廣譜蛋白酶系產生更多的活性多肽,還能夠降低生產成本。

篩選更適用于螺旋藻蛋白的高產蛋白酶菌株是制備優質螺旋藻肽的關鍵。通過從不同發酵時期的螺旋藻泥自然發酵液中分離篩選高產蛋白酶菌,并利用篩選菌株發酵螺旋藻監測發酵過程中菌量和酶活變化,對發酵產物中多肽等生物活性成分進行分析,對其抗氧化活性和血管緊張素I轉移酶(angiotensin I converting enzyme,ACE)抑制酶活進行測定,以期為采用微生物發酵制備螺旋藻活性肽提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藻株及菌種

螺旋藻藻種(SpirulinaplatensisGY-D18),上海光語生物科技有限公司;解淀粉芽孢桿菌(BacillusamyloliquefaciensLXZ1)、芽孢桿菌(Bacillussp.LXZ2)、短小芽胞桿菌(B.pumilusLXZ3)為本次分離高產蛋白酶菌株。

1.1.2 主要試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(hippuryl-L-histidyl-L-leucine，HHL)、血管緊張素轉換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE),Sigma-Aldrich；2,4,6-三吡啶基三嗪、2,2′-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、抗壞血酸(Vc),上海阿拉丁生化科技股份有限公司；瓊脂粉、鄰苯二甲醛,北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物,北京奧博星生物技術有限公司；NaCl、NaNO3、MgSO4·7H2O、K2SO4、K2S2O4、CaCl2、FeCl3·6H2O、H3BO3、MnCl2·2H2O、Na2MoO4、NaHCO3、葡萄糖等,國藥集團化學試劑有限公司,均為分析純。

1.1.3 主要儀器與設備

JA5003型電子天平,上海舜宇恒平科學儀器有限公司；LDZX-75KB型立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫療器械廠；YT-CJ-2D/B型超凈臺,北京亞泰科隆儀器技術有限公司；HZQ-X100型微生物培養箱,中國哈爾濱市東明醫療儀器廠；SB25-12 DTD型超聲清洗儀,寧波新芝生物技術有限公司；FYY(40～120)01/02型純水儀,青島富勒姆科技有限公司；ZX-LGJ-18壓蓋型真空冷凍干燥機,上海知信實驗儀器技術有限公司；756PC型紫外分光光度計,上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基配制

ZK培養基：參考文獻[7]配制；LB培養基：胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,定容至1 000 mL,115 ℃滅菌20 min。蛋白酶篩選培養基：干酪素8.0 g,Na2HPO42.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NaCl 5.0 g,牛肉膏3 g,定容至1 000 mL,pH 7.4。固體培養基每升加入20 g 瓊脂粉。螺旋藻發酵培養基：葡萄糖20 g,螺旋藻干粉10 g,蒸餾水定容至 1 000 mL,115 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌種分離篩選與鑒定

螺旋藻培養至OD660>2時,離心收獲藻泥(呈墨綠色,其中干物質占藻泥質量分數的15.8%,蛋白質占干物質的66.2%),將新鮮藻泥放入發酵桶中并添加質量分數為10%的葡萄糖,置于實驗室自然發酵,在發酵的不同階段(6個月,12個月)取樣進行菌種的分離篩選,將自然發酵液在超凈工作臺中梯度稀釋,取100 μL涂布于LB平板。于37 ℃恒溫培養24 h后挑取單一菌落,劃線法純化培養3代。采用福林法測定蛋白酶活力(GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》附錄B),篩選酶活力較高的菌株進行后續試驗。

采用革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗對菌株進行初步判斷,后用細菌通用引物(A27F：5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGT-TACGA-3′,A1495R：3′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAG-TTTGATCCTGGCTCAG-5′)進行16S rRNA驗證。檢測和比對工作委托北京擎科新業生物技術有限公司完成。

1.2.3 高產蛋白酶菌株的培養及生長曲線繪制

采用LB固體平板劃線法將純化后的解淀粉芽孢桿菌、芽孢桿菌和短小芽胞桿菌進行同步化處理,劃線后置37 ℃培養24 h。分別挑取單菌落至200 mL液體培養基中,每隔8 h取樣測定其600 nm下的吸光度值,并繪制生長曲線。

1.2.4 螺旋藻發酵處理

高產蛋白酶菌株種子液制備：取篩選菌種固體板上的單菌落分別接入LB液體培養基,置37 ℃培養箱中培養,24 h后進行濃縮,以107CFU/mL的接種密度分別接入螺旋藻培養基中,其中混菌發酵按照1∶1∶1比例。發酵72 h后,5 000 r/min離心5 min得到發酵上清液,留取一部分上清液用于測定多肽、總黃酮和總酚含量,另一部分上清液調整pH至8.3后凍干備用,用于活性指標測定。

1.2.5 菌種計數

分別在0、24、48、72 h取樣,梯度稀釋后取適合的稀釋倍數樣品溶液進行平板涂布,置于37 ℃培養箱中培養,24 h后計數菌落數量,以每毫升發酵液中的菌落統計(lg CFU/mL)。

1.2.6 發酵產物的活性成分分析

多肽采用鄰苯二甲醛法[14],分別取50 μL發酵液樣品,加入2 mL反應試劑(含50 mmol/L 硼砂,1% 十二烷基硫酸鈉,0.8 mg/mL鄰苯二甲醛和200 μL β巰基乙醇),混合均勻后室溫靜置2 min。以蒸餾水代替樣品作為空白,在340 nm處測定吸光度值。以胰蛋白胨作為標準品做標準曲線,樣品中多肽含量以mg(tryptone equivalent,TE)/mL表示。

總黃酮采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[15],略有改動。分別取3 mL發酵液樣品,加入1 mL 0.5 g/L的亞硝酸鈉,充分混勻后靜置5 min,加入1 mL 1g/L的三氯化鋁,混勻后25 ℃水浴6 min,加入10 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液,最后補足30%乙醇至25 mL,充分混勻放置15 min。于510 nm測定吸光度值,以蘆丁為標準品做標準曲線,樣品中總黃酮含量以mg(rutin equivalent,RE)/mL 表示。

總酚采用Folin-Ciocalteu法[16],略有改動。分別取0.1 mL發酵液樣品,加入0.9 mL蒸餾水和2 mL Folin-Ciocalteu 試劑(稀釋10倍,現用現配),混勻后反應5 min。加入2.0 mL 0.75 g/L碳酸鈉溶液,黑暗條件下25 ℃水浴反應30 min。于765 nm 測定吸光度值,以沒食子酸為標準品做標準曲線,樣品中總多酚含量以mg(galic acid equivalent,GAE)/mL 表示。

1.2.7 發酵產物的抗氧化活性分析

將凍干后的產物配制成0.5 mg/mL的樣品溶液,進行DPPH自由基清除能力[15]、ABTS陽離子自由基清除活性[16]、鐵離子還原力(FRPA)[17]和總抗氧化活性[15]等抗氧化指標的測定,均以0.1 mg/mL抗壞血酸作為陽性對照。

1.2.8 發酵產物的ACE抑制活性分析

將凍干后的產物配制成0.5 mg/mL的樣品溶液,進行ACE抑制活性測定[18],方法略有改動。取50 μL樣品溶液與100 μL 5.0 mmol/L HHL溶液混合,37 ℃水浴3 min,加入50 μL 10 μmol/L ACE溶液,置37 ℃水浴鍋中水浴30 min,加入200 μL 1.0 mol/L HCl溶液終止反應。加入1.5 mL乙酸乙酯,充分振蕩后于3 000 r/min離心10 min,取1.2 mL上清液,于80 ℃烘干。加入2.5 mL蒸餾水后,在228 nm處測定吸光度值,根據公式(1)計算ACE抑制率:

(1)

式中：Aa，反應中未加入樣品液，反應結束后添加樣品液以維持整個反應體系平衡，是ACE和HHL完全反應的參照的測定值；Ab，反應中加入樣品液與ACE、HHL共同反應的測定值；Ac，樣品在反應前先使ACE失活，再加入樣品液，是ACE與HHL反應的空白對照的測定值。

1.2.9 數據分析

各處理均進行3次重復,數據均為平均值±標準差。采用SPSS 16.0對所得數據進行one-way ANOVA統計分析。采用DUCAN多重分析比較方法進行顯著性分析(P<0.05)。采用SPSS 16.0多元線性回歸進行活性成分與抗氧化指標的相關性分析,根據Pearson’s相關分析結果判斷其顯著水平。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的鑒定及特性分析

微生物是蛋白酶的重要來源,由于微生物無處不在,前人從各種環境及不同的原料中開展高產蛋白酶菌株的分離篩選工作[1-2,4]。本研究從螺旋藻自然發酵培養基中分離篩選高產蛋白酶的菌株,通過酶活力測定選取初測蛋白酶活性較高的3株菌(蛋白酶活力分別為101.3、120.4、176.5 U/mL)作為后續實驗菌種。首先對3株菌的形態進行鑒定[19]：LXZ1、LXZ2和LXZ3均為白色不透明菌落,濕潤,無光澤,其中LXZ1、LXZ2菌落呈圓形微凸,邊緣絨毛狀,LXZ3菌落呈圓形較平,邊緣較規則。3株菌均為革蘭氏陽性菌,過氧化氫酶陽性,其中LXZ1菌體為長桿狀,多個連接呈鏈狀(圖1-a),LXZ2和LXZ3菌體為短桿狀,單個或成對(圖1-b、1-c)。通過16S rRNA擴增并在NCBI中進行Blast序列比對,其中LXZ1(登錄號MN759438)與B.amyloliquefaciensstrain HS10(登錄號GU323370)的相似度為99%,將其命名為B.amyloliquefaciensLXZ1；LXZ2(登錄號MN759437)與Bacillussp.B1(2014b)(登錄號KF922381)的相似度為100%,將其命名為Bacillussp.LXZ2；LXZ3(登錄號MNMW180955)與B.pumilusJH4(登錄號DQ232734)的相似度為100%,將其命名為B.pumilusLXZ3。

圖1 篩選菌種形態特征及生長曲線

從生長曲線來看(圖1-d),3株菌均在24 h后進入平臺期,其中以LXZ3的生物量最大,且在48 h內均能維持較高水平,OD600的吸光度值在2.5～2.8,LXZ2在平臺期處于相對較低的狀態,OD600的吸光度值在2.0～2.1,LXZ1則處于而者之間,且波動幅度較大。

2.2 螺旋藻發酵過程參數變化

以上述3株菌進行螺旋藻的發酵,對其發酵過程中的菌量和蛋白酶力活進行測定(圖2),發現LXZ1和LXZ2在24 h時的菌量顯著高于LXZ3(P<0.05),而LXZ3的菌量在48 h居上且持續處于較高的水平,48 h前后3株菌的菌量基本維持在平臺期,且前人篩選高產蛋白酶細菌多在24～72 h區間測定酶活力或達到產酶高峰[1-2,4],因此將這3株菌的培養周期設定為72 h。從蛋白酶活力來看,3株菌的蛋白酶活性在24 h內基本相當,48 h后LXZ3的酶活力顯著增加。與前人的結果不同的是,至72 h時3株菌的酶活力一直處于上升趨勢,說明菌株在平臺期仍保持較好持續產酶能力,因此后續還需進一步優化其最佳產酶條件。相對于單菌,混菌的菌量與蛋白酶活均維持在較高的水平,在72 h時菌量和蛋白酶活力均顯著高于各單菌(P<0.05)。

圖2 螺旋藻發酵過程中菌量與酶活力的變化

2.3 發酵產物的活性成分含量

本文采用微生物發酵螺旋藻的目標產物為多肽,而黃酮和多酚也具有較好的抗氧化能力,故對發酵產物中多肽、總黃酮和總酚的含量均進行了測定,由表1可看出,發酵后上清液中的多肽、總黃酮和總酚含量均顯著高于未發酵(P<0.05)。就多肽而言,單菌發酵以LXZ3發酵液中的含量最高,比對照提高了209.6%,而混菌發酵顯著優于單菌(P<0.05),表現出更好的效果,比對照提高了305.2%；就總黃酮而言,單菌發酵LXZ1和LXZ3的效果與混菌發酵相當,而LXZ2的效果略差,但仍是對照的2.25～2.73倍；就總酚而言,LXZ2的效果優于LXZ1和LXZ3(P<0.05),增幅為138.3%,而以混菌發酵最佳,增幅達164.2%。發酵后總黃酮和總酚增幅較大,然而多肽含量總體較高,為總黃酮的300～500倍,總酚的8～14倍。

表1 不同發酵處理螺旋藻發酵產物中活性成分的含量

2.4 發酵產物的抗氧化活性分析

ANGELA等[20]通過同時糖化和發酵獲得的螺旋藻生物活性肽具有較高的ABTS陽離子清除能力;YU等[21]研究表明,枯草芽孢發酵螺旋藻產物的DPPH自由基清除能力、FRAP值均顯著提高。本研究與前人結果一致,螺旋藻發酵產物相比未發酵處理,其DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力、鐵離子還原力和總抗氧化能力均顯著提高(P<0.05)(圖3)。不同單菌發酵產物的抗氧化活性也有顯著差異(P<0.05),其中LXZ3發酵產物的DPPH和ABTS陽離子自由基清除能力最強,分別是對照的5.3和2.8倍；LXZ 2發酵產物的FRAP值最高,是對照的3.1倍；LXZ1發酵產物的總抗氧化能力最高,是對照的4.8倍。混菌發酵產物的DPPH和ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP值均顯著優于單菌(P<0.05)。

圖3 不同發酵處理螺旋藻發酵產物的抗氧化活性

通過相關分析可知(表2),各抗氧化指標的水平與多酚、總黃酮和總酚均有較強的正相關性,說明發酵產物的抗氧化活性是3種活性成分共同作用的結果,本研究篩選的高產蛋白酶菌不僅可提高螺旋藻發酵產物的多肽含量,還能增加黃酮和多酚等其他活性成分的含量,進一步增強發酵產物的抗氧化功效。

表2 螺旋藻發酵產物活性成分與抗氧化指標的相關性分析

2.5 發酵產物的ACE抑制酶活力分析

ACE是高血壓的重要靶點,其活性抑制后可阻止血管緊張素Ⅱ的合成,進而緩解血壓升高[22],因此,通過ACE抑制酶活測定可篩選具有降血壓功效的成分。對發酵產物進行了ACE抑制酶活力測定,結果表明各發酵處理的ACE抑制酶活力均顯著提高(P<0.05),其中LXZ1處理提高了25.5%,LXZ2處理提高了30%,LXZ3發酵處理提高了31%,混菌發酵則提高了39.0%,從而說明螺旋藻發酵產物具有潛在的降血壓作用。

圖4 螺旋藻發酵產物的ACE抑制活性

3 結論

本研究從螺旋藻自然發酵液中篩選出3株高產蛋白酶的菌株,分別為B.amyloliquefaciensLXZ1、Bacillussp.LXZ2和B.pumilusLXZ3,其中B.pumilusLXZ3產酶最高,但是最佳產酶條件仍需進一步優化。以單菌或混菌發酵螺旋藻,發酵產物中多肽、總黃酮和總酚含量顯著高于未發酵,抗氧化活性和ACE抑制活性也顯著提高,且混菌發酵的效果優于單菌發酵,可能是由于多菌之間的協同作用所致,然而關于菌間互作機制還需深入研究。