四種還原糖對魚皮膠原肽美拉德反應產物的理化性質及增咸作用影響

張廷奕,王燦,李治衡,汪蓓,付余*,鄔威

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(西南大學 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心,重慶,400715) 3(西南大學附屬中學,重慶,400700)4(西南大學 動物科學技術學院,重慶,400715)

長期的高鈉鹽飲食是心血管疾病的主要誘發因素之一,而減少鈉鹽攝入可有效降低罹患心血管疾病的風險[1]。目前,常使用的食鹽替代物(如KCl、CaCl2或MgCl2)會導致食品的感官品質下降,例如風味降低、金屬異味增加[2]。因此,如何在減少鈉鹽的同時又不犧牲食品的味道成為亟需解決的問題。

食源性肽是以食源性蛋白為原料,經過酶解、分離后的蛋白水解產物,具有良好的營養價值、生理活性以及呈味特性[3]。日本科學家TADA首次在酪蛋白水解物的N-端類似物合成過程中發現,Orn-β-Ala·HCl和Orn-Tau·HCl具有與NaCl類似的咸味[4]。不同食品蛋白質來源的短肽,特別是魚精蛋白[5]、酪蛋白[5]和大黃魚蛋白[6]來源的肽具有一定的咸味增強作用。但是咸味肽的提取與合成費用十分昂貴,因此不適合實際應用。多肽與還原糖在加熱的條件下會發生美拉德反應,其反應產物的滋味顯著提升,主要關鍵呈味物質為分子質量1 k～5 kDa的美拉德肽。食源性多肽與還原糖的美拉德反應后,少量的美拉德肽可使食物更加美味,同時對人體的咸味受體TRPV1t產生增強作用[7-9]。最新研究表明,大豆蛋白[10]、豬血漿蛋白[11]和火雞肉蛋白[12]來源的美拉德反應產物均有顯著的咸味增強效果。

羅非魚在加工過程中,會產生大量的副產物(如魚皮、魚骨、魚鱗等),約占魚體重的40%～60%。羅非魚魚皮富含膠原,是一種良好的蛋白質資源。此外,由于膠原中含有大量的甘氨酸,因此酶解產生的膠原肽不具有苦味。通過蛋白酶水解結合美拉德反應修飾,有望將羅非魚魚皮轉化為高附加值的咸味增強肽,同時延伸羅非魚加工產業鏈。本研究以羅非魚魚皮膠原為原料,通過蛋白酶水解結合美拉德反應修飾制備咸味增強肽,探究不同還原糖種類對所形成的美拉德反應產物的理化性質以及增咸作用的影響,為制備咸味增強肽提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚皮膠原(蛋白質含量85.2%),上海鑫汐生物科技有限公司;食品級D-核糖、D-木糖、葡萄糖、氨基葡萄糖(純度均>99%),深圳一諾食品配料有限公司；食品級蛋白酶A,日本天野酶制品株式會社；食品級NaCl(純度≥99.1%),重慶市北碚區永輝超市；鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)(純度98%)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(純度99%)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),北京索萊寶科技有限公司;L-亮氨酸(純度99%),瑞士阿達瑪斯試劑有限公司；葡萄糖含量檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所；其他所用試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

F-380熒光分光光度計,天津港東科技發展股份有限公司；UV-6100紫外分光光度計,上海元析儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋,上海齊欣科學儀器有限公司；PB-10 pH計,Sartorius賽多利斯；UltraScan PRO全自動多功能色差儀,美國HunterLab。

1.3 實驗方法

1.3.1 美拉德反應產物的制備

參考FU等[11]的方法。加水調整底物蛋白質質量濃度至50 g/L,調節pH至7.0、溫度50 ℃,加入蛋白酶A進行水解(水解過程中不調整pH,以避免引入過多的Na+)。反應5 h后,沸水浴滅酶15 min。冷卻至室溫,離心除去沉淀后,獲得膠原肽。按蛋白質與還原糖質量比5∶1,添加不同還原糖(木糖、核糖、氨基葡萄糖和葡萄糖)于膠原肽中,調節pH至7.0,沸水浴反應3 h(經過前期實驗優化,反應3 h后的美拉德反應產物具有最高的咸味增強率,同時反應3 h后還原糖已經全部消耗),立即冷卻,冷凍干燥后用于后續分析。選擇未糖基化的膠原肽作為對照組。

1.3.2 pH和色澤變化的測定

利用pH計測定不同美拉德反應產物的pH值。

采用色差儀來測定美拉德反應產物的L*(亮度值)、a*(紅度值)、b*(黃度值),以超純水作為空白組,總色差(ΔE)按公式(1)計算:

(1)

1.3.3 游離氨基含量測定

采用OPA法測定美拉德反應產物中游離氨基含量[13]。OPA試劑由10 mL 50 mmol/L的OPA,10 mL 50 mmol/L的N-乙酰基-L-半胱氨酸,5 mL 200 mg/mL的SDS和75 mL 100 mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH 9.5)組成。OPA測定由10 μL樣品(或標準品)與1.2 mL OPA試劑混合,室溫反應10 min,通過紫外可見分光光度計測定其在340 nm波長處的吸光值。使用亮氨酸標準溶液繪制標準曲線,吸光值轉換為亮氨酸質量濃度當量(μg/mL),按公式(2)計算：

y=0.000 4x+0.051 3(R2=0.999 2)

(2)

式中：x，亮氨酸質量濃度,μg/mL；y，吸光值(A)。

1.3.4 光譜法分析美拉德反應產物

1.3.4.1 紫外光譜分析

采用紫外光譜法分析美拉德反應的程度。美拉德反應產物用超純水稀釋至5 g/L,利用紫外分光光度計在波長為200～500 nm范圍內進行紫外光譜掃描。

1.3.4.2 熒光光譜分析

采用熒光光譜法分析美拉德反應的程度。美拉德反應產物用超純水稀釋至5 g/L,借助熒光分光光度計在激發波長為347 nm,發射波長為370～600 nm范圍內進行熒光光譜掃描。

1.3.5 分子排阻色譜分析美拉德反應產物

采用Ultimate 3000高效液相色譜系統分析美拉德反應產物的分子質量分布[14]。色譜柱為Phenomenex BioSepTMSEC-S2000。洗脫液為乙腈/水/三氟乙酸。進樣體積10 μL,流速0.5 mL/min,檢測波長214 nm。采用Chromeleon軟件分析色譜數據,美拉德肽的分子質量分布采用標準樣品與洗脫體積擬合方程計算。采用以下標準Trp(204 Da),GLV(287 Da),SGNIGFPGPK(1 114 Da)、胰島素(5 700 Da)和肌紅蛋白(17 600 Da),獲得分子質量校準曲線,按公式(3)計算:

lgMW=-0.608 6t+6.938 1

(3)

式中：MW,分子質量,Da；t,洗脫時間,min。

1.3.6 美拉德產物的增咸特性評估

1.3.6.1 咸味強度標準曲線

根據文獻[15],建立9人感官評價小組,感官評價員均具有2年以上的食品感官評價經驗,對不同還原糖美拉德反應產物的增咸作用進行評價。首先,小組成員對3位數隨機編碼的5種不同濃度NaCl溶液(0.017、0.051、0.085、0.119、0.153 mol/L)進行咸味強度評分(0=無,14=極強),進而建立評價標準尺度。根據每位小組成員對各濃度NaCl溶液進行評分,得出各濃度溶液咸味強度平均值,繪制NaCl溶液濃度與咸味強度的標準曲線。

1.3.6.2 咸味強度評價

配制不同還原糖美拉德反應產物(10 g/L)溶液,加入一定量NaCl,使NaCl終濃度為0.051 mol/L。選擇0.051 mol/L的NaCl溶液為對照,通過感官評價分析不同還原糖美拉德反應產物的咸味增強率。樣品采用3位數隨機編碼,取15 mL置于黑色品飲杯中,隨機順序呈送給各評價員,評價其咸味強度,根據標準曲線方程計算其咸味增強率,按公式(4)計算：

(4)

式中：x1,0.051 mol/L NaCl溶液咸味強度(5.44)；x2,樣品咸味強度。

1.3.7 數據處理

每組試驗重復3次,結果以平均值±標準差來表示。采用SPSS 22.0對實驗數據進行單因素方差分析和Pearson相關性分析,并用Duncan法進行事后多重比較(P<0.05代表有顯著性差異,P>0.05代表無顯著性差異)。

2 結果與分析

2.1 美拉德反應產物的pH和色澤變化

美拉德反應過程中會發生一系列的化學反應,引起反應產物pH和色澤的變化[16]。不同還原糖美拉德反應產物的pH呈不同程度的下降,分別下降至6.23(核糖)、6.35(氨基葡萄糖)、6.69(木糖)和6.95(葡萄糖)。由于美拉德反應過程中會產生一些酸性物質(乙酸等),同時美拉德反應會消耗膠原肽的氨基,進而導致反應體系的pH下降。

美拉德反應高級階段會生成類黑精等褐色物質,引起反應產物色澤的變化。不同還原糖與膠原肽的美拉德反應產物的色差值如表1所示。與對照組相比,核糖美拉德反應產物a*值和L*值變化顯著。不同還原糖美拉德反應產物的b*值呈現上升的趨勢,表明美拉德反應產物具有明顯的黃色特征。此外,不同還原糖美拉德反應產物的總色差(ΔE*)變化趨勢為核糖(14.19)>氨基葡萄糖(5.40)>木糖(3.65)>葡萄糖(0.31),這與pH值變化趨勢一致,其中核糖導致美拉德產物的褐變最強烈,主要由于核糖作為五碳糖,比六碳糖具有更高的反應活性[17]。

表1 不同還原糖與膠原肽的美拉德反應產物的色差值

4種還原糖對應的膠原肽美拉德反應產物如圖1所示,該結果與總色差結果一致,即核糖顏色最深,而葡萄糖顏色最淺。

圖1 四種還原糖與膠原肽的美拉德反應產物的照片

2.2 游離氨基含量變化

在美拉德反應過程中,肽的游離氨基與體系中還原糖的羰基發生反應,造成氨基的損失[17]。游離氨基含量的減少,可間接地反應出美拉德反應的程度。圖2結果表明,與對照組相比,除氨基葡萄糖,其他還原糖美拉德反應產物的游離氨基濃度顯著下降(P<0.05),該結果與JIANG等[18]的結果一致,即美拉德反應后,其反應產物的游離氨基含量下降。氨基葡萄糖與膠原肽的美拉德反應產物游離氨基濃度顯著高于對照組(P<0.05),主要是由于其自身含有氨基,造成其反應產物樣品濃度高于膠原肽對照組。

圖2 不同還原糖與膠原肽的美拉德反應產物的游離氨基含量

在本研究中,其他3種還原糖導致游離氨基下降的順序為核糖>木糖>葡萄糖。

2.3 紫外、熒光光譜分析

紫外掃描光譜法可用于監測美拉德反應的進程[19]。320 nm處的吸光值可用于衡量美拉德反應中間產物的形成,而420 nm處的吸光值常用于衡量美拉德反應終末產物(類黑精等)的形成[12]。在本研究中,不同還原糖美拉德反應產物的紫外掃描光譜如圖3所示。與對照組相比,美拉德反應產物在280～420 nm具有更高的吸光值,其大小順序為核糖>氨基葡萄糖>木糖>葡萄糖。核糖和氨基葡萄糖在320和420 nm處具有更高的吸光值,說明他們在美拉德反應過程中產生了更多的中間產物和終末產物,該結果與pH和色澤分析結果高度相關。在相同反應條件下,五碳糖的反應速率大于六碳糖,進而形成了更多的美拉德反應中間產物和終末產物[20]。核糖作為一種五碳糖,具有極強的反應速率。因此,本研究中核糖美拉德反應產物具有較高的反應程度。

圖3 不同還原糖與膠原肽的美拉德產物紫外吸收光譜圖

熒光掃描光譜法可用于評估美拉德反應產生的小分子熒光產物[12,21]。不同還原糖美拉德反應產物的熒光掃描光譜圖見圖4。總體而言,與對照組相比,各個反應產物在400～550 nm具有更高的熒光強度(最大熒光強度λ=430 nm),說明形成了具有熒光吸收的美拉德反應產物。不同還原糖的美拉德反應產物熒光強度大小順序為氨基葡萄糖>木糖>核糖>葡萄糖。其中,氨基葡萄糖美拉德反應產物具有更多的熒光物質(與紫外掃描光譜結果類似),主要是由于形成的美拉德反應中間產物具有熒光特性,可以作為褐色類黑精等物質前體,所以美拉德體系中熒光強度與紫外光吸收強度表現出不同趨勢[22]。

圖4 不同還原糖與膠原肽的美拉德產物熒光光譜圖

2.4 分子質量分布

采用分子排阻色譜分析美拉德反應產物的分子質量分布,結果如圖5所示。與對照組相比,不同還原糖美拉德反應產物的分子質量分布變化不顯著,其中分子質量<1 kDa肽組分略有下降,主要歸因于低分子質量的小肽具有較高反應活性,參與美拉德反應后比例降低[11]。1 k～5 kDa的美拉德肽組分比例增加不顯著(P>0.05),可能是由于交聯反應以及分子質量>5 kDa的肽組分降解導致。還原糖美拉德反應產物的分子質量變化不顯著,主要是由于各實驗組中熱降解和交聯同時發生,達到了一個動態平衡狀態[22-25]。值得一提的是,分子質量為1 k～5 kDa的美拉德肽可以作為風味增強物質,有助于增加食物的咸味強度[9]。FU等[11,14]研究表明,豬肌肉蛋白水解物與氨基葡萄糖的美拉德反應產物的分子質量分布比例與水解物之間無顯著差異。美拉德反應產物具有更高比例的1 k～5 kDa肽組分,是否能提高其咸味增強特性,需要進行感官實驗來進一步驗證。

圖5 不同還原糖與膠原肽的美拉德產物的分子質量分布

2.5 咸味增強作用評價

根據不同NaCl溶液濃度與咸味強度繪制標準曲線為y=75.49x+1.716 7,R2=0.980 4。將4種還原糖美拉德反應產物加入NaCl溶液后(終質量濃度為10 mg/mL),其咸味強度評價結果見表2。總體而言,4種還原糖美拉德反應的產物呈現出不同的增咸效果。木糖、核糖及氨基葡萄糖經過美拉德反應后均具有一定咸味增強作用,然而不同還原糖間差異不顯著(P>0.05)。與NaCl對照溶液(51 mmol/L)相比,木糖、核糖和氨基葡萄糖美拉德反應產物的咸味增強率分別為8.64%、6.25%和18.01%,其中氨基葡萄糖增咸效果顯著(P<0.05),可能是由于氨基葡萄糖具有較高的反應速率。

表2 不同還原糖與膠原肽的美拉德反應產物的咸味增強率

在前期實驗中,以葡萄糖為例,測定美拉德反應3 h后葡萄糖的消耗量超過91.5%。該結果表明,在溫度100 ℃、膠原肽與葡萄糖添加質量比例為5∶1、反應時間3 h,絕大部分葡萄糖被消耗。在相同的美拉德反應條件下,4種還原糖的反應活性為核糖>氨基葡萄糖>木糖>葡萄糖,考慮到其他3種還原糖比葡萄糖具有更強的反應活性,因此在美拉德反應過程中完全消耗。此外,本研究美拉德反應中蛋白質與還原糖質量比為5∶1,因此體系中糖含量較低,加之它們的甜度值也較低(核糖沒有甜味)，即使有剩余,對反應產物的咸味影響很小。

本實驗結果與之前研究結果一致,即不同還原糖美拉德反應產物對人咸味受體TRPV1t產生不同增強作用,增咸趨勢為氨基葡萄糖>木糖>葡萄糖[7]。課題組前期研究表明,豬血漿蛋白水解物與氨基葡萄糖的美拉德反應產物能夠起到一定的增咸作用,其主要原因是反應產物中含有咸味增強作用的美拉德肽(1 k～5 kDa),但是其確切的增咸分子機制尚未闡明。王欣等[26]發現雙酶酶解哈氏仿對蝦蛋白可將其酶解產物的感官咸味強度從10 mmol/L NaCl 提高至55 mmol/L NaCl。陳瑞霞等[27]研究發現,淘汰蛋雞蛋白酶解物可將50 mmol/L NaCl 溶液的咸味強度提升26.2%。本研究中氨基葡萄糖美拉德反應產物有望作為咸味增強物質在食品領域應用,然而其確切的增咸構效關系有待進一步研究。

3 結論

探究核糖、木糖、葡萄糖和氨基葡萄糖對魚皮膠原肽美拉德反應產物的理化性質和咸味增強作用的影響,發現4種還原糖得到的美拉德反應產物具有不同的理化特性及增咸作用,其中氨基葡萄糖美拉德反應產物的增咸效果顯著。4種還原糖美拉德反應產物pH和游離氨基含量呈下降趨勢,核糖和氨基葡萄糖膠原肽美拉德反應產物總色差變化顯著。氨基葡萄糖-膠原肽美拉德反應產物形成了大量的中間產物和終末產物。美拉德反應產物中1 k～5 kDa肽組分比例增加,主要是形成具有咸味增強作用的美拉德肽。不同美拉德反應產物具有不同的咸味增強作用,其趨勢為氨基葡萄糖>木糖>核糖>葡萄糖,其中氨基葡萄糖美拉德反應產物的咸味增強作用最佳,能夠將51 mmol/L的NaCl溶液的咸味感知強度提高18%。然而,美拉德反應產物的構效關系以及確切的增咸機制有待進一步研究。