不同液相色譜-串聯質譜法檢測標準測量不確定度的評定

韓帥兵，張耀中，于 淼，薛 雯，李向陽，吳亞玉，周 力

(山東省農藥檢定所， 山東 濟南 250100)

隨著廣大人民群眾及政府部門對農產品質量安全重視程度的不斷加強，各檢測機構承接的農產品中尤其是蔬菜水果中農藥殘留檢測任務不斷增加，如何提供更加科學、準確的檢測數據也成為各實驗室關注的焦點。測量不確定度代表著檢測值的可信區間，是衡量實驗室檢測質量的重要指標，尤其是檢測結果在限量臨界值區間時，不確定度更是合格性判定的重要參考依據[1-3]。因此，不確定度的評定逐漸受到各個實驗室的重視。隨著不確定度評定相關標準及指南的更新或發布[4-5]，不確定度的評定更加有據可循，測量不確定度的評定工作也相應成為各實驗室檢測工作的重要一環。當前，液相色譜-串聯質譜法作為一種應用越來越普遍的農藥殘留檢測方法，關于它的測量不確定度評定的研究雖有所報道[6-8]，但這些報道大多不是建立在標準規定方法之上，對檢測實驗室具體工作參考意義有限。

2021年3月，新的國家標準GB 23200.121-2021《食品安全國家標準 植物源性食品中331種農藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯用法》發布[9]，此方法是建立在QuEChERS方法基礎上的多殘留檢測方法，與原國家標準GB/T 20769-2008《水果和蔬菜中450種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》[10]相比，該方法用料量少、操作簡便，且涉及了很多原標準未涉及的農藥代謝物，一定程度上來說，可以替代原國標。這兩種檢測方法在前處理步驟上存在明顯差異，那么，在測量不確定度的評定過程及結果上是否也存在明顯差異，目前還沒有相關文獻報道。

本研究以檢測大白菜中吡蟲啉殘留量為例，按照標準規定的具體操作步驟及計算方法進行檢測，依據不確定度評定相關標準及指南[4-5]，分別評定了在相同檢測條件下，兩種檢測方法測量結果的不確定度，比較了二者在不確定度組成、最終結果、貢獻度分布及關鍵因素上的區別，并分析了產生原因，為標準方法的比較提供了數據依據，同時也為農藥殘留檢測實驗室提供了不確定評定的參考范例。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與材料 超高效液相色譜-串聯質譜儀(ESI)；氮吹儀(N-EVAP112)；旋轉蒸發儀(RV10 Control)；移液器；石墨炭黑氨基SPE小柱(Carbon/NH2SPE，500mg，6mL)；0.22μm有機濾膜、量筒、容量瓶等。

1.2 主要試劑 乙腈，色譜純；甲醇，色譜純；甲苯，分析純；氯化鈉，分析純；無水硫酸鎂，分析純；檸檬酸鈉，分析純；檸檬酸氫二鈉，分析純。

1.3 樣品前處理 樣品分別按照兩種標準規定的方法進行前處理。

1.3.1 GB/T 20769-2008前處理 提取：準確稱取20g(精確至0.01g)樣品于80mL離心管中，加入40mL乙腈，15 000r/min下勻漿1min，加入5g NaCl再勻漿1mL，離心后取上清液10mL，40℃氮吹至1mL后待凈化。

凈化：用5mL的V(乙腈) ： V(甲苯)= 3：1混合液預淋Carbon/NH2柱后，加入待凈化液，用2mL上述混合液分3次洗滌離心管，將洗滌液轉入柱中，再用25mL淋洗液洗脫，收集所有洗脫液，旋轉濃縮近干，用5mL乙腈定容，過0.22μm有機濾膜后待測。

1.3.2 GB 23200.121-2021前處理 提取：準確稱取10g(精確至0.01g)樣品于50mL離心管中，加入10mL乙腈、4g無水硫酸鎂、1g氯化鈉、1g檸檬酸鈉、0.5g檸檬酸氫二鈉及1顆陶瓷均質子，蓋上離心管蓋，劇烈震蕩1min 后4 200r/min離心5min。

凈化：吸取6mL上清液至內含900mg無水硫酸鎂、150mgPSA的離心管中，渦旋混勻1min。4 200r/min離心5min，吸取上清液過0.22μm有機濾膜后待測。

1.4 樣品檢測 前處理后的樣品經UPLC-MS/MS檢測，兩種檢測標準采取相同的儀器方法，參考儀器條件如下：

色譜柱：Shim-pack XR-ODS Ⅲ(2.0mm I.D.×50mm，1.6μm)

流動相：A：甲醇，B：5 mM醋酸銨+0.02%甲酸水溶液；柱溫：40℃；進樣量：0.5μL

流速及梯度：(表1)

表1 流動相流速及梯度設置

質譜儀條件：離子源：ESI源，正離子模式；檢測方式：MRM；電離電壓：4.5kV；碰撞氣及壓力：Ar，0.23MPa；霧化氣流速：3.0L/min；檢測器電壓：1.74kV；干燥氣流速：10.0mL/min；加熱氣流速：10.0mL/min；定量離子：256.10-209.10，碰撞電壓-14V；定性離子：256.10-175.10，碰撞電壓-16V。

1.5 數學模型的建立 根據兩種檢測標準規定的方法，兩種方法的殘留量(mg/kg)計算分別見公式(1、2)。

(1)

(2)

其中，公式(1)為GB/T 20769-2008計算公式，公式(2)為GB 23200.121-2021計算公式。式中，ω為樣品中被測農藥組分的含量(mg/kg)；Ai為樣品中被測農藥組分的峰面積；As為標準溶液中被測農藥組分的峰面積；V1為提取溶液總體積(mL)；V2為吸取出用于檢測的提取溶液體積(mL)；V3為樣品定容體積(mL)；m為樣品取樣量(g)；ρ為標準溶液中農藥的含量(mg/L)。

2 結果與討論

2.1 不確定度來源分析 通過對檢測過程的分析，兩個標準的檢測都有4個主要步驟：標準溶液配制、稱樣、前處理和上機檢測，據此可將引入不確定度的來源細化為：所購買標準溶液、標準溶液配制、稱樣、前處理過程、儀器穩定性。另外，在實際檢測工作中，還需要考慮方法精密度對測定結果的系統性影響，由此可以得到不確定度來源分析魚骨圖(圖1)。

圖1 不確定度來源分析魚骨圖

其中，對于GB 23200.121-2021來說，樣品前處理過程中并不包含分取和定容的過程。綜合公式(1、2)及(圖1)，可以判定檢測結果的不確定度主要來源包括：標準溶液質量濃度(ρ)，樣品進樣峰面積(Ai)，標準溶液峰面積(As)，樣品的最終定容體積(V)，樣品稱樣量(m)及方法精密度(frec)，由此可根據公式(3)得到合成不確定度urel(ω)：

即：urei(ω)=

(3)

2.2 相對不確定度的評定

2.2.1 標準溶液引入的不確定度 兩種檢測方法所用標準溶液均為用購買的吡蟲啉有證標準溶液稀釋后得到，因此，由標準溶液引入的不確定度是相同的，包括所購標準溶液urel(ρ1)和配制過程引入urel(ρ2)，均為B類評定。

2.2.1.1 購買標準溶液引入的不確定度 本研究所購買吡蟲啉標準溶液質量濃度為1 000mg/L，標準物質證書顯示其擴展不確定度為7mg/L(包含因子k=2)，則所購標準溶液引入的相對不確定度為：urel(ρ1)=0.35%。

2.2.1.2 標準溶液配制引入的不確定度 本研究最終所用質量濃度為0.2mg/L的標準工作溶液是使用質量濃度為1 000mg/L的標準溶液用乙腈2次稀釋后配制而得：先用1mL A級分度吸量管移取0.25mL 1 000mg/L標準溶液，用乙腈定容到25mL，配制得1.0mg/L標準溶液；再用1mL A級分度吸量管移取1.0mL 1.0mg/L標準溶液，用空白樣品溶液定容到5mL，得到0.2mg/L的標準工作溶液。在標準溶液的配制過程中，引入不確定度的因素應該包括溫度變化對試劑膨脹的影響，及配制過程中所使用玻璃儀器的允差及讀數誤差。

實驗室溫度一般控制在(20±5)℃，乙腈的膨脹系數為0.001 37℃-1，服從矩形分布，由此，由溫度效應引入的相對不確定度可由公式(4)計算而得：

(4)

配制過程中所用玻璃儀器引入的不確定度主要由允差和讀數重復性偏差組成，每個分量可用公式(5)計算：

(5)

式中aL為玻璃儀器的最大允許誤差或讀數重復性偏差，其中，1mL A級分度吸量管精度較高，讀數重復性引入不確定度可以忽略不計，允許誤差為±0.008mL[11]；25mL容量瓶允許誤差為±0.03mL，重復性偏差為±0.01mL；5mL容量瓶允許誤差為±0.02mL，重復性偏差為±0.01mL；服從三角形分布，k取 ；V為所用體積。由此，在標準溶液配置過程中每次使用玻璃儀器由誤差、偏差及溫度引入的不確定度(表2)。

表2 標準溶液配制中玻璃儀器使用引入的不確定度

將上述不確定度合并，得到標準溶液配制過程引入的不確定度urel(ρ2)公式(6)。

(6)

據此，計算標準溶液所引入的不確定度urel(ρ)公式(7) 。

(7)

2.2.2 樣品稱量引入的不確定度 本研究中，兩種檢測方法稱樣時所用天平相同，均為精度為0.01g電子天平，樣品均勻性及稱量重復性引入不確定度均可忽略不計。該級別天平在量程內允許的最大誤差為±0.01g，則由稱量誤差引入的不確定度服從矩形分布(B類評定)，兩種方法稱樣量有所不同，則GB/T 20769-2008中由稱量引入不確定度urel(mⅠ)計算公式(8)，GB 23200.121-2021中由稱量引入不確定度urel(mⅡ)計算公式(9)。

(8)

(9)

2.2.3 樣品前處理引入的不確定度 前處理所引入的不確定度主要來源于添加提取試劑、移取及凈化后定容時的玻璃器皿的允差及溫度變化引起試劑膨脹，均為B類評定。

2.2.3.1 GB/T 20769-2008前處理引入的不確定度 由1.3.1可知，對于GB/T 20769-2008來說，可以引入不確定度的步驟所用器皿包括：添加40mL乙腈所用50mL量筒，允許誤差為±0.50mL，讀數重復性偏差為±0.10mL；移取提取液所用10mL單標線吸量管，A級允許誤差為±0.020mL，讀數重復性偏差可以忽略；最終定容所用5mL單標線吸量管，A級允許誤差為±0.015mL，讀數重復性偏差可以忽略，均服從三角分布。應用公式(4、5)可計算在前處理過程中每次使用玻璃儀器由誤差、偏差及溫度引入的不確定度(表3)。

表3 GB/T 20769-2008前處理過程玻璃儀器使用引入不確定度

將上述不確定合并，得到前處理過程引入的不確定度urel(VⅠ)公式(10)。

(10)

2.2.3.2 GB 23200.121-2021前處理引入的不確定度 由1.3.2可知，對于GB 23200.121-2021來說，可以引入不確定度的步驟所用器皿只有在加入10mL乙腈時所用規格為10mL的量筒，其允許誤差為±0.10mL，讀數重復性偏差為±0.02mL；雖然在后續步驟中有提取液的取用，但這一步驟并不需精確量取，且不參與最終結果的計算，由此可以計算前處理過程引入的不確定度urel(VⅡ)公式(11)。

(11)

2.2.4 儀器檢測引入的不確定度 由2.1可知，儀器檢測引入的不確定度可以分為標準溶液峰面積引入的不確定度和樣品溶液峰面積引入的不確定度。由于超高效液相色譜-串聯質譜儀靈敏度較高，可以認為儀器穩定性即測定值的分散性就是構成測量峰面積的不確定度的主要來源，其他因素可以忽略不計。此類不確定度可以在重復性條件下對同一被測量對象獨立重復觀測多次，最后采用統計方法進行計算，即進行A類評定。在重復性條件下，對標準溶液和樣品進行分別進樣6次，得到6次進樣的峰面積，根據貝塞爾公式(12)計算標準偏差，標準不確定度根據公式(13)計算。

(12)

(13)

根據方法(1、2)的標樣溶液和樣品峰面積檢測結果，分別計算得到相應的標準不確定度及相對標準不確定度(表4)。

表4 標準溶液和樣品峰面積檢測結果及不確定度(n=6)

2.2.5 方法精密度引入的不確定度 由方法精密度引入的不確定度符合A類評定，本研究通過檢測多個空本樣品添加標準溶液進行評定。按照GB/T 20769-2008及GB 23200.121-2021的稱樣量分別制備5個添加樣品并在重復性條件下進行檢測，添加濃度均為0.2mg/kg，根據檢測結果應用公式(12、13)計算相應標準偏差及標準不確定度，最終計算得到相對標準不確定度(表5)。

表5 添加回收樣品檢測結果及不確定度(n=5)

2.2.6 相對標準不確定度的合成 綜合上述得到的各不確定度分量，通過公式(3)可計算得到兩個方法的合成相對標準不確定度urel(ω)，具體各分量不確定度及合成相對不確定度計算結果(表6)。

表6 各分量不確定度及合成相對不確定度

由結果可知，對于本次實驗來說，兩種方法的合成相對標準不確定度均比較低，但依舊存在一定的差異，GB/T 20769-2008明顯高于GB 23200.121-2021，主要差別出現在方法精密度上，其他分量引入的不確定度相差并不多。分析原因應該是由于GB/T 20769-2008的前處理步驟相對復雜，需要經過濃縮—凈化—濃縮—定容等一系列操作，造成方法精密度較方法二更低，從而提高了不確定度。

對于每個分量對合成相對標準不確定度的貢獻度而言，GB/T 20769-2008結果中，貢獻度最高的是方法精密度(51.7%)和標準溶液(33.1%)；其他分量的貢獻度都較低；GB 23200.121-2021結果中貢獻度最高的是標準溶液(64.3%)，其他各分項貢獻度相對較低且比較平均。由此可見，對于兩種檢測方法來說，標準溶液的不確定度都是影響檢測結果不確定度的關鍵因素，而對于GB/T 20769-2008來說，精密度則是另一個關鍵因素。

雖然從本次實驗的評定結果來看，在不確定度的表現上，GB 23200.121-2021確實優于GB/T 20769-2008，但這一結果僅是反應吡蟲啉一種農藥在大白菜這一種基質中的情況，并不能得到標準所涉及的所有農藥在各種基質中均符合這一規律的結論。這是因為，兩種檢測方法樣品的最終凈化效果是差別較大的，GB/T 20769-2008對樣品的凈化效果要明顯優于GB 23200.121-2021，在這種情況下，對于復雜基質，比如含色素較多的綠色蔬菜，含其他雜質較多的鱗莖類蔬菜等，GB 23200.121-2021是否還能保持優于GB/T 20769-2008的精密度，進樣溶液雜質的增多是否會影響儀器檢測峰面積的重復性等，這些因素都會影響最終不確定度的評定結果，還需要通過進一步的實驗具體分析。

2.3 檢測結果擴展不確定度的表示 根據測量不確定度評定指南對一般實驗室的要求，在置信概率p=95%時，取測量結果的擴展不確定度包含因子k=2，由此得到，對于一個吡蟲啉在大白菜樣品中殘留量的檢測結果為MRL值[12](0.2mg/kg)附近的樣品來說，用標準方法GB/T 20769-2008和GB 23200.121-2021分別進行檢測，其結果的相對擴展不確定度分別為5.6%和4.0%。

3 結論

本研究評定了使用兩種液相色譜-串聯質譜法檢測吡蟲啉在大白菜中殘留量時結果的不確定度。通過實驗及計算可知，由于檢測方法更加簡便易行，方法重現性更好，新檢測標準GB 23200.121-2021的結果不確定度要小于原方法GB/T 20769-2008。但是，本研究只針對吡蟲啉一種農藥在大白菜基質中，對于更多種農藥在其他基質尤其是復雜基質中的不確定度是否符合這一規律還有待更進一步的研究。