耳葉牛皮消二級漿復合微生物發酵工藝研究

陳 明，方希修，嚴雅瑤

（江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300）

耳葉牛皮消又稱濱海白首烏，為蘿摩科鵝絨藤屬耳葉牛皮消種，是中國歷史上較為珍貴的中藥保健品，耳葉牛皮消的藥理成分主要包括C21甾苷、多糖、多肽、氨基酸、脂類（磷脂、揮發油、不飽和氨基酸、苯乙酮類化合物）等（孫彥敏等，2015），其入口微甜后甘苦、藥性微溫，可提升機體特異性及非特異性免疫力，還可增強氣血、促進開胃消食、解毒化瘀。

本試驗選擇耳葉牛皮消粉加工過程中的廢渣廢水（耳葉牛皮消二級漿）為原料，選用各種芽孢桿菌、乳酸菌屬細菌菌株的最佳培養基（焉兆萍等，2019；李慧芬，2018；王德培等，2011），菌種經培養擴大后接種到以耳葉牛皮消二級漿為原料的基礎發酵培養基中。最終根據發酵液中的粗蛋白質含量分析出耳葉牛皮消二級漿最佳發酵條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料及菌種 新鮮耳葉牛皮消由江蘇康諾農業有限公司市場采購；鮮牛奶（脫脂），蔗糖（食品級），泰州某超市購買；微生物菌制劑、芽孢桿菌、鏈球菌、乳桿菌及乳酸菌由江蘇農牧科技職業學院微生物飼料與營養研究所提供。

1.1.2 培養基 枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌（牛肉膏蛋白胨培養基）：胰胨10 g，牛肉膏5.0 g，酵母膏5.0g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL。設置pH為（7.2～7.4）。高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，設置溫度為121℃，設置時間為20 min，最后滅菌后冷卻備用。

保加利亞乳桿菌（牛肉膏蛋白胨培養基）：胰胨10 g，牛肉膏5.0g，酵母膏5.0 g，葡萄糖5.0 g，吐溫80 1.0 g，L-半胱氨酸0.1 g，檸檬酸鈉1.0 g，硫酸鎂0.6 g，硫酸錳 0.3 g，蒸餾水1000 mL（李慧 芬，2018）。設 置pH為（6.8～7.0）。高 壓 蒸汽滅菌鍋滅菌，設置溫度為121℃，設置時間為 15 min，最后滅菌后冷卻備用。

嗜酸乳酸菌、嗜熱鏈球菌用培養基（牛肉膏蛋白胨培養基）：胰胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.6 g，硫酸錳0.3 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1000 mL。設置pH為（6.2～6.4）。高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，設置溫度為121℃，設置時間為15 min，最后滅菌后冷卻備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 固態復合微生物制劑的制備 制備流程見圖1。

圖1 固態復合微生物制劑的制備流程

將培養的二代乳酸菌菌株接種到乳酸菌發酵培養基中，接種條件為厭氧。接種量為發酵培養基的5%，隨后混勻、靜置、密封發酵2.5 d，備用。

將培養的二代芽孢桿菌菌株接種到芽孢桿菌發酵培養基中，提供一定濃度的氧氣。接種量為發酵培養基的5%，隨后混勻、靜置、發酵2.5 d，備用。

1.2.2 耳葉牛皮消二級漿的制備流程

耳葉牛皮消二級漿的制備流程見圖2，通常在秋末冬初選購耳葉牛皮消。選擇直徑大于0.8cm，外觀完整、新鮮、無霉變、無病斑的作為原料。耳葉牛皮消清洗之后放入低速滾筒去皮機中，勻速加注耳葉牛皮消原料體積3倍量的清水，翻滾30 min完成去皮。去皮后將新鮮白首烏放入粉碎機中按一定比例進行注水搗碎，過濾。過濾好的漿放入沉淀桶中沉淀1 d左右，待分層后，棄去上層透明清水層，收集中間灰白層，棄去底層乳白淀粉層。重復步驟沉淀、收集2～3次，即得到較為純粹的耳葉牛皮消二級漿，接著放入烘箱烘干成塊并過30目篩，最后滅菌冷卻后保存備用。

圖2 耳葉牛皮消二級漿的制備流程

1.2.4 活菌數的測定 在超凈工作臺下進行無菌操作，用滴管吸取一定量的發酵液移入無菌干燥試管內，混合無菌生理鹽水或其他滅菌稀釋液，充分混勻。復合微生物制劑活菌數用血球計數板計數；發酵后活菌數用平板計數法計數，將細菌培養液用涂布器置于MRS瓊脂（3%）平板上，隨后覆蓋一層薄薄的營養瓊脂，靜置。待營養瓊脂完全凝固，即可將平板倒扣。放入恒溫箱中培養，設置溫度時間。最終根據固體培養皿上的微生物菌落進行計數。

1.2.5 理化指標

1.2.5.1 蛋白質的測定 量取充分混勻的耳葉牛皮消發酵液至干燥的消化管內，加入硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸等試劑，將消化管放入消化爐中消化，使用全自動凱氏定氮儀，實現加液、蒸餾、滴定和記錄等操作。

1.2.5.2 總酸的測定 根據酸堿中和的特性，在無菌干燥的錐形瓶中加入一定量發酵液和酚酞指示劑備用。將堿液置于滴定管中進行滴定，觀察溶液顏色變化，試驗進行3次，減少誤差，最后記錄堿液的消耗量，計算出總酸含量。

1.2.5.3 脂肪的測定 通過低沸點有機溶劑萃取的方法測定脂肪，選擇石油醚作為萃取劑，量取一定量的發酵液，混合海沙一同置于無菌干燥的蒸發皿中，將蒸發皿置于沸水中加熱，使發酵液蒸干。隨后將各蒸發皿放入干燥箱中，設置溫度與時間，干燥結束后冷卻、研細，后移入濾紙包，用石油醚溶液進行抽提，最后蒸干稱重，計算可得脂肪含量。

1.2.6 微生物指標 總菌數、大腸桿菌均采用平板計數法，其他致病菌如沙門氏菌的檢測需通過平板分離后進行生化鑒定實驗和血清檢測才能最終鑒定成功（梁智安，2011）。

1.3 數據整理采用L9（34）正交表作正交試驗，以粗蛋白質含量（CP%）為指標，采用SPSS19.0分析因變量的影響程度。

2 結果與分析

2.1 固態復合微生物制劑中活細菌數含量通過制作發酵菌株的最佳培養基培養擴增的二代細菌，各菌種主要包括嗜酸乳酸菌（36%）、保加利亞乳桿菌（20%）、枯草芽孢桿菌（18%）、嗜熱鏈球菌（16%）、蠟狀芽孢桿菌（10%），每克復合微生物菌劑的有效活菌數為3.09×109，各菌按照比例其數量如下：1.11×109（嗜酸乳酸菌）、0.62×109（保加利亞乳桿菌）、0.56×109（枯草芽孢桿菌）、0.49×109（嗜熱鏈球菌）、0.31×109（蠟狀芽孢桿菌）。結果表明，復合微生物菌劑中的活菌可進行正常的新陳代謝，從而在動物機體內發揮促進作用。

2.2 耳葉牛皮消二級漿發酵工藝條件的優化采用L9（34）正交表，以發酵液中粗蛋白質含量（CP%）為指標，優化發酵條件，并通過極差分析評價影響產品質量的因素程度。因素和水平如表1所示，根據CP確定白首烏二級漿發酵的最佳工藝條件，結果見表2、表3。

表2 白首烏二級漿發酵條件的優化結果

表3 白首烏二級漿發酵條件優化的方差分析

由表1、表2可知，發酵溫度（A）為30%、發酵時間（B）為24 h、復合微生物制劑添加量為1.5%時，發酵液中蛋白質含量最高為3.89%，可見該組為最佳搭配。根據表格中所計算的極差可知：A＞B＞C，表明發酵效果中的主要影響因素為A，其次為B，C影響效果最小。即發酵溫度對液體中蛋白質量影響最大，其次為發酵時間和微生物添加量。對表格整體分析可知，耳葉牛皮消二級漿發酵條件可設定為A2（30℃）、B2（24 h）、C2（1.5%），此發酵條件下發酵液的營養價值最高。

2.3 質量指標

2.3.1 感觀指標 樣品液呈奶白色，黏稠均勻，濃度適中，風味有濃郁的酸乳香味和白首烏特有的香味，無酸臭異味；口感自然爽滑，細膩溫和。表面無乳清、結塊析出，無分層渾濁等異常現象。

2.3.2 理化指標 蛋白質2.78 g、酸度56.9° T、脂肪2.35 g。

2.3.3 微生物指標 發酵液中細菌總數≤62 CFU/mL、大腸桿菌＜28 MPN/100mL、致病菌數未檢出。

3 討論

目前國內耳葉牛皮消的市場空前膨脹，但其生產研發程度不高。傳統耳葉牛皮消粉的加工材料大部分為淀粉，而活性成分C21甾苷、多糖、揮發油、各種氨基酸等在加工過程中流失于廢渣和廢水中。現代藥理研究表明，甾苷類物質擴散至細胞內可清除自由基，增強免疫細胞活性，從而提升機體非特異性及特異性免疫力，增強機體監測系統對腫瘤細胞的識別，進而抑制腫瘤；脂類等物質大多數為揮發性脂肪酸，分子量較小機體易于吸收，可降低膽固醇。耳葉牛皮消二級漿的排放不但給環境帶來了巨大壓力，更重要的是浪費了耳葉牛皮消的藥用價值。需要開展變“廢”為寶的創新性研究，發揮耳葉牛皮消廢渣廢水中活性物質的藥用價值是本試驗的關鍵。

4 結論

試驗根據不同菌株的生化特點（好氧菌、厭氧菌）制備不同的培養基進行菌株擴大，又將各二級菌進行配合制成復合微生物制劑。耳葉牛皮消二級漿的最佳發酵條件是發酵溫度為30℃、發酵時間為24 h、復合微生物制劑接種量為1.5%時，發酵后二級漿粗蛋白質含量（%）最高為3.89。