利用轉錄組學分析三峽肽素生物合成的基因簇

劉 超，李 坤，白曉軒，楊宇純，薛艷紅，劉士平

（三峽大學生物與制藥學院，中國輕工業功能酵母重點實驗室，湖北宜昌 443002）

近年來，寡肽類抗生素在醫藥、食品、農業和飼料添加劑等領域正在發揮越來越大的作用[1?4]，如環孢霉素等。與傳統的抗生素相比，寡肽結構多樣、廣譜高效、分子量小、穩定性好、溶解度高且不易引起耐藥性，受到了科學家的廣泛關注[5?8]。

寡肽類天然產物在生物體中有兩種合成途徑，即核糖體途徑和非核糖體途徑[9]。前者是指通過依賴核糖體的翻譯途徑來合成，通過該途徑合成的寡肽是一種初生代謝產物，在其基因組中一般會存在編碼目標寡肽的氨基酸重復序列[10?12]，其結構組分一般是20 種天然的氨基酸，如羊毛肽、硫肽和半乳糖肽[13]；而后者是由一種不依賴于翻譯途徑的非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase,NRPS）所催化，通過該途徑合成的寡肽是一種次級代謝產物，其結構中大都含有許多非天然的氨基酸[14?16]，如環肽素等[17]。為了方便研究寡肽合成的NRPS基因簇，科學家們根據非核糖體肽的結構和NRPS的序列及催化特點，開發出一系列預測軟件[18]，如antiSMASH、fungiSMASH、NRPS predictor、Norine等，為解析寡肽生物合成途徑提供了有利條件[19?21]。特別是隨著轉錄組測序技術（RNA-Seq）的應用[22?23]，人們可以方便地從表達水平上確定候選的合成基因簇[24?25]，如劉偉等[26]在2018 年利用轉錄組測序技術，篩選出了銀杏類黃酮生物合成途徑的關鍵基因，并分析了各基因的表達特征，確定了銀杏黃酮醇類物質合成的限速酶基因。

在前期工作中，從三峽地區的疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）的內生草酸青霉SG-4（CCTCC M2015270）中，發現了一種新線性五肽“三峽肽素”，結構是：O-Me-BABA-N-Me-L-Thr-D-Thr-N-Me-LVal-L-Ser，其中BABA是β-氨基丁酸，能抑制柑橘致腐菌，對人體安全，是一種潛在的保鮮劑[27?28]。為了揭示三峽肽素在草酸青霉中的合成機制，本研究在完成不同草酸青霉菌株的轉錄組分析的基礎上，測定了SG-4 在不同培養條件下的轉錄組序列，為剖析三峽肽素的合成機理提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土豆、葡萄糖 科密歐化學試劑有限公司；瓊脂 金燕海洋生物股份有限公司；色譜級乙腈 美國天地有限公司；真菌RNA提取試劑盒 美國Omega Bio-Tek公 司；Goldenstar? RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2、T3 Super PCR Mix北京擎科新業生物技術有限公司。

BS-224s電子天平 德國賽多利斯；SW-CJ-2FD型雙人實驗操作臺 蘇州凈化設備廠；XPX-9052 MBE數顯培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ZQZY-85BN全自動控溫搖床 上海知楚儀器有限公司；Master-s15 和泰純水儀 上海和泰儀器有限公司；MyCyclerTM Thermal PCR儀 美國BIO-RAD公司；GDS-8000 凝膠成像系統 美國UVP公司；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機 美國BECKMAN公司；DYCP-31DN水平電泳儀 北京市六一儀器廠；YM30F不銹鋼智能型立式電熱蒸汽消毒器 上海三申醫療器械有限公司；SPD-16 島津高效液相色譜儀紫外-可見光檢測器 島津儀器蘇州有限公司；C8液相柱，YMC-Triart C8（250 mm×4.6 mm）日本YMC公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗菌株及培養條件 草酸青霉（P.oxalicum）SG-4 為來源于三峽河岸帶植物疏花水柏枝（M.laxiflora）的內生真菌，菌株保藏于4 ℃的PDA固體培養基斜面。

PDA固體培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1000 mL，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

草酸青霉SG-4 經活化培養以后，采用無菌操作取 1 環孢子分別接種于裝有PDA液體培養基的三角搖瓶中，培養條件為28 ℃、120 r/min。

1.2.2 菌體量測量和三峽肽素含量檢測 將SG-4接種至200 mL PDA液體培養基中，培養條件按1.2.1 中進行，培養2～9 d，每天獲取菌絲和發酵液，菌絲烘干后稱量，記錄2～7 d的菌體量；發酵液使用等體積無水乙醇混勻沉淀24 h，將上清液旋蒸凍干獲得粗提物，使用純水將粗提物配制成5 mg/mL的溶液，按照楊宇純等[27]檢測方法，記錄2～9 d的三峽肽素出峰的峰面積。

具體檢測方法如下：利用C8色譜柱及高效液相色譜設備進行分析。流速1 mL/min，柱箱溫度為35 ℃，流動相A為乙腈，流動相B為純水。梯度洗脫：0～20 min 90%～0% B。進樣量為80 μL，檢測波長為210 nm，記錄5～6 min出峰的峰面積。

1.2.3 SG-4 在不同培養條件下三峽肽素含量檢測將SG-4 分別接種至200 mL和300 mL的PDA液體培養基中，其中200 mL分別培養4 d和7 d，300 mL培養7 d，培養條件及三峽肽素檢測按照1.2.1 和1.2.2 中進行。

1.2.4 RNA提取及轉錄組測序 離心獲取200 mL培養4、7 d及300 mL培養7 d的菌絲體，液氮研磨后采用OMEGA試劑盒提取總RNA，提取方法按試劑盒操作方法進行，使用Agilent 2100 和NanoDrop對RNA濃度、OD值（OD260nm/280nm和 OD260nm/230nm）、28S/18S、RIN/RQN值進行檢測，根據結果對RNA進行質量評估。將質量檢測合格的RNA樣品使用BGISEQ-500 進行高通量轉錄組測序，操作簡述如下：先用帶有OligodT的磁珠富集有polyA尾巴的mRNA，再用DNA探針雜交rRNA，利用RNase H選擇性消化DNA/RNA雜交鏈，再用DNase I消化掉DNA探針，純化后即得到所需RNA。然后將RNA片段化，用隨機的N6 引物進行反轉錄，進一步形成雙鏈DNA。將雙鏈DNA末端補平并進行5’端磷酸化，3'端形成突出一個“A”的粘末端，再連接一個3'端有凸出“T”的鼓泡狀的接頭。然后連接產物通過特異的引物進行PCR擴增和上機測序。

1.2.5 轉錄組數據分析 轉錄組數據使用過濾軟件SOAPnuke進行統計，使用Trimmomatic進行過濾，得到clean reads；使用Bowtie2 軟件將clean reads比對到參考基因序列上。根據比對結果，利用RSEM軟件進行定量分析，并以FPKM計算基因的表達水平。差異表達分析重點在于找出樣本之間差異表達的基因，并對這些基因進行深入挖掘分析。在分析中，差異表達基因默認定義為 FDR≤0.001 且倍數差異在1 倍以上的基因。篩選獲得的差異表達基因，根據GO和KEGG注釋結果進行分類，同時使用R軟件中的phyper函數進行富集分析。同時將檢測到的基因進行NR和NT注釋，明確基因所在物種以及基因功能。

1.2.6 RT-PCR驗證 使用Oligo 7 軟件設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，使用反轉錄試劑盒Goldenstar? RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2 將所提RNA反轉錄成cDNA，添加引物進行RT-PCR驗證，所用的引物序列見表1。

表1 實驗中所用的引物序列Table 1 Primer sequences in the experiment

1.3 數據處理

數據處理軟件使用Graph Pad Prism 8。

2 結果與分析

2.1 草酸青霉SG-4 不同培養條件下生產能力比較

為了明確三峽肽素的合成特點，分析了SG-4 菌體生長規律和合成三峽肽素的時期，結果顯示，菌體的生長在第6 d質量達到最大（圖1A），而三峽肽素在第4 d開始累積，第8 d達到最大值（圖1B），而在300 mL培養下，SG-4 不產三峽肽素（圖2A，箭頭標記處），暗示三峽肽素生物合成的基因受培養時間和裝夜量的影響，這為研究三峽肽素合成機制提供了線索。由于基因表達與物質合成呈相關性[28]，因此，三峽肽素在不同培養條件下的含量差異與其控制合成的基因表達量相對應，所以選取SG-4 在200 mL分別培養4、7 d以及300 mL培養7 d的菌絲提取RNA進行高通量轉錄組測序，通過對差異基因分析，挖掘三峽肽素合成基因簇。

圖1 SG-4 的生長（A）和三峽肽素的生產曲線（B）Fig.1 Growth curve (A) of SG-4 and production curve of sanxiapeptide (B)

圖2 三峽肽素在不同培養條件下液相檢測Fig.2 Determination of sanxiapeptide in different culture conditions by liquid chromatography

2.2 轉錄組測序質量分析

將測序的原始數據（raw reads）中的低質量、接頭污染以及未知堿基含量過高的數據過濾后，平均每個菌株產生了4278 萬條凈序列（clean reads），平均容量達6.42 Gb，高質量數據高達97.19%。使用Bowtie 2 軟件將獲得的clean reads比對到參考基因序列上，平均比對率達到93.88%（表2），上述結果表明，此次測序的質量有保證，結果可靠；同時使用Trinity對clean reads進行組裝，然后使用Tgicl對轉錄本進行聚類去冗余得到Unigene，獲得的All-Unigene為 22731 條，將 Unigene與 NR (RefSeq non-redundant proteins) 數據庫進行BLAST比對，發現本樣品SG-4 轉錄組測序得到的Unigene與草酸青霉114-2 的Unigene相似數目最多，高達85.08%（表3），其它占比則非常少。

表2 轉錄組測序概況Table 2 A survey of transcriptome sequencing

表3 NR物種注釋Table 3 NR Species notes

2.3 差異表達基因分析

由于三峽肽素含量差異會體現在基因表達差異上，因此按照差異的倍數（|log2（FoldChange）|）和錯誤發現率（FDR）來篩選差異表達基因[29]，分析中將同時滿足|log2（FoldChange）|≥1 且 FDR ≤0.001 的轉錄本確定為差異表達基因[30?31]。三個轉錄組中的表達發生顯著變化的基因數見表4。

表4 差異表達的基因數Table 4 Number of genes differentially expressed

上述結果表明，高產（S7-2）相較于低產（S4-2）和不產（S7-3），其差異表達的基因占比相近，且明顯集中在上調基因中，這表明在它們之間，五肽調控存在一定的共性，同時與三峽肽素含量差異也呈現一致性；而高產和低產相較于不產，其差異基因均達到了27%以上，特別是低產和不產之間，差異基因顯著存在于下調基因，這表明在它們之間，五肽合成調控存在差異性。由于控制三峽肽素合成的基因簇相同，因此S7-2 與S4-2、S7-3 差異基因會趨于一致，且呈現上調趨勢，所以在后期的比較中，重點關注在S4-2 對S7-2 ∩ S7-2 對S7-3 中的3312 個基因，特別是上調基因（圖3）。

圖3 在S4-2 對S7-2（A）S4-2 對 S7-3（B）中的差異表達基因Fig.3 Differentially expressed genes in S4-2 vs S7-2 (A)and S4-2 vs S7-3 (B)

2.4 差異表達基因的功能注釋

對于差異表達的基因分別采用GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes）分類富集分析了其可能的功能及所參與的細胞代謝過程。GO分類表明上述3312 個基因，主要參與細胞進程、代謝過程、細胞膜、催化活性以及連接相關等生物學過程中（圖4A）。而KEGG分類表明差異集中在運輸和分解代謝、翻譯、碳水化合物代謝以及氨基酸代謝等過程中（圖4B）。GO富集表明差異基因主要在細胞膜成分、碳水化合物代謝以及單加氧酶活性等過程中（圖4C），KEGG富集表明差異基因主要集中在抗生素合成、糖酵解和糖異生過程以及氨基酸合成等途徑（圖4D）。

圖4 差異基因表達分析Fig.4 Differential gene expression analyses

2.5 NRPS基因家族表達分析

在此之前，本課題組通過對不同草酸青霉菌株（114-2、SG-4、SJ-3、114-2 來源于山東大學微生物技術國家重點實驗室，SG-4 和SJ-3 菌株均系三峽河岸帶植物疏花水柏枝的內生真菌；相同培養條件下，114-2 不產三峽肽素，而SJ-3 產量高于SG-4）進行了轉錄組分析[32]，篩選出7 個可能的NRPS基因簇（表5），結合實驗數據，預測三峽肽素合成基因簇為PDE_01071（Non-ribosomal peptide synthetase,NRPS基因簇）；因此，對此次轉錄組進行NR和NT注釋，注釋結果與預測基因簇PDE_01071 進行比對，結果如下表，其中Unigene5452_All包含PDE_01066 和PDE_01067 兩個基因的部分CDS序列；同時，也對上述3312 個差異基因進行了比對，發現其中有21 個差異基因與PDE_01071 基因簇一致，且在S7-2 中均為上調基因（表6）；而且RT-PCR結果與測序表達結果完全一致（圖5A），為了保證結果的準確性，也對另外6 個可能的NRPS基因簇進行了表達驗證（圖5B），RT-PCR結果表明6 個基因表達結果和轉錄組數據不一致，因此將這6 個基因排除，該結果進一步說明PDE_01071基因簇可能參與草酸青霉中三峽肽素的合成。

圖5 RT-PCR驗證表達結果Fig.5 RT-PCR to verify the expression

表5 7 個可能的NRPS基因在不同培養條件下的表達量Table 5 Expression levels of the 7 possible NRPS genes under different culture conditions

表6 差異基因與基因簇PDE_01071 比對Table 6 Comparison of differential genes with gene cluster PDE_01071

3 結論

通過分析SG-4 菌體生長規律和合成三峽肽素的時期，表明菌體的生長在第6 d質量達到最大，而三峽肽素在第4 d開始累積，第8 d達到最大值，因此三峽肽素合成特點符合次生代謝途徑，同時通過對草酸青霉基因組序列進行檢索，并未找到Ser、Thr、Val的重復編碼序列，所以三峽肽素合成途徑符合NRPS途徑；由于三峽肽素含量與其控制合成的基因表達相關，所以草酸青霉SG-4 在不同培養條件下的含量差異與基因表達差異會趨于一致，因此本研究基于BGISEQ-500 測序平臺，分析比較了草酸青霉SG-4 在不同培養條件下無參轉錄組測序數據，對差異表達基因進行了分析，將可能的合成基因鎖定在3312 個差異基因中；由于此前完成了不同草酸青霉（114-2、SG-4、SJ-3）轉錄組測序及分析，分析結果認為NRPS基因簇PDE_01071 可能參與三峽肽素的合成，因此將3312 個基因同此基因簇進行NR及NT比對，比對結果表明：3312 個差異基因中有21 個基因與基因簇PDE_01071 基因一致，而這21 個基因均為上調基因，且集中在高產樣本S7-2 中，這更進一步驗證了此前的猜想，而所有這些嘗試為明確其生物合成機制奠定了基礎。后面的工作中，需對基因簇成員進行針對性敲除，在明確酶活性和基因功能的基礎上，對其合成機理進行解析。