表面復合微/納拓撲化絲素/殼聚糖/沙蒿籽膠水凝膠的制備及對雪旺細胞的影響*

韓琦，梁如宇，張李玲，張魯中，吳紅，楊宇民△，李貴才△

(1.南通大學神經再生江蘇省和教育部重點實驗室，南通 226001;2.南通大學神經再生協同創新中心，南通 226001;3.南通大學生命科學學院，南通 226001)

1 引 言

周圍神經損傷是一種嚴重影響患者正常生活和健康的疾病[1]。修復周圍神經損傷的金標準是自體移植[2]，但其組織供應來源有限。目前，隨著組織工程和生物材料的發展，具有良好生物相容性、可降解性、安全無毒的各類生物材料支架正逐漸應用于周圍神經損傷的治療中[3]，如膠原、殼聚糖、聚丙交酯膜[4]和聚己內酯微納纖維[5]等。

水凝膠是以水為分散介質而形成的凝膠，其吸水性、保水性、穩定性、柔軟性高，生物相容性好，可作為組織工程材料，用于模擬人體組織[6]，對于組織的修復和再生起介導作用[7-8]。研究發現水凝膠支架對周圍神經再生具有重要影響，黃銳等[9]用全氟三丁胺(PFTBA)水凝膠聯合神經導管修復大鼠坐骨神經缺損，發現PFTBA水凝膠能很好地促進周圍神經的修復與再生。為了提高水凝膠的力學性能[10]，Li等[11]制備出一種氧化石墨烯(GO)/聚丙烯酰胺(PAM)復合水凝膠，并證明水凝膠的疏水性和力學性能隨著GO濃度的增加而增加，同時在PAM水凝膠中添加適當濃度的GO，可以有效促進雪旺細胞生長。

微模塑技術可在生物材料表面產生規整的微/納米結構，用于模擬細胞生長的物理微環境。高均超等[12]制備了圖案化的聚二甲基硅氧烷(PDMS)軟模板，軟模板上的圖案與硅片硬模板上完全一致。徐盼舉等[13]利用微模塑技術制作出了一種圖案規整的氧化石墨烯陣列，并證明該氧化石墨烯陣列具有促進PC12細胞粘附、增殖的作用。微拓撲結構能夠調控細胞取向性生長，但目前多數研究僅評價了單一微米級或納米級尺寸的拓撲結構對細胞行為的影響，鮮有構建兼具微米和納米復合拓撲結構用于調控細胞的研究。

本研究聯合采用溶膠凝膠技術及微模塑技術構建了表面具有微圖形結構的絲素/殼聚糖/沙蒿籽膠(SF/CS/AS)水凝膠，殼聚糖具有良好的降解性能和抗菌性[14]，但殼聚糖水凝膠力學強度差[15]；絲素蛋白[16]具有良好力學性能，且可降解性和生物相容性高[17]；沙蒿籽膠是黏度較高的一種多糖類物質，在生物醫學中可以作為增稠劑、穩定劑和乳化劑等。因此，構建SF/CS/AS水凝膠可以優勢互補[17-18]，進一步提高自身的力學性能、生物相容性、成膜性，作為生物材料可以更好地應用到組織工程當中。本研究首先對該凝膠的表面形貌、力學性能進行了評價，進一步對成纖維細胞和雪旺細胞進行了生物學評價，表明具有微/納拓撲結構的復合水凝膠可以促進雪旺細胞的黏附、遷移，期望該研究能夠為周圍神經損傷移植物的選擇和制備提供一定依據。

2 材料與方法

2.1 實驗試劑和設備

家蠶絲素(南通仙基達繭絲制品有限公司)；殼聚糖(江蘇南通興成生物制品廠)；沙蒿籽膠(寧夏綠洲草業有限公司)；NaOH(西隴化工股份有限公司)；生理鹽水(Gibco公司)；無水乙醇(永華化學科技有限公司)；Na2CO3(西隴化工股份有限公司)；化鋰(上海邁瑞爾化學技術有限公司)；CH3COOH(Dow Corning公司)；PBS緩沖液(Corning公司)；NaH2PO4·12H2O(西隴科學股份有限公司)；NaH2PO4·2H2O(西隴科學股份有限公司)；甲苯胺藍(Sigma-Aldrich公司)；羅丹明(Sigma-Aldrich公司)；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma-Aldrich公司)；HCHO溶液(西隴科學股份有限公司)；DMEM基礎培養基(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；生理鹽水(Gibco公司)；胰酶(Gibco公司)；膠原酶(Gibco公司)；細胞表面抗原重組蛋白(Thy，Gibco公司)；多聚賴氨酸(PLL，Gibco公司)。

電子分析天平(shimadzu公司，日本)；磁力攪拌機(鞏義市英裕予華儀器廠)；超聲震蕩儀(張家港市科宇信超聲有限公司)；光學顯微鏡(德國Leica公司)；紫外超凈臺(上海醫療器械有限公司)

2.2 實驗方法

2.2.1實驗試劑配制 文獻[19]中的方法配制絲素蛋白溶液。配制殼聚糖溶液時，先配制2%的CH3COOH溶液，再用電子分析天平分別稱取5、2.5、1 g殼聚糖粉末倒入燒杯，加入配好的乙酸溶液，在磁力攪拌機上攪拌1 d，得到5%、2.5%、1%殼聚糖溶液，裝入試劑瓶中，于4℃冰箱中保存備用。最后配制沙蒿籽膠(AS)溶液，分別稱取0.1、0.2、0.4 gSA粉末溶于10 mL雙蒸水中，充分混勻后，制得1%、2%、4%SA溶液。

2.2.2SF/CS/AS共混膠的制備 將絲素溶液、殼聚糖溶液、沙蒿籽膠粉末按照：10%絲素溶液0.1 mL、2.5%殼聚糖溶液5 mL、沙蒿籽膠粉末100 mg；10%絲素溶液0.5 mL、2.5%殼聚糖溶液5 mL、沙蒿籽膠粉末100 mg；10%絲素溶液0.1 mL、1%殼聚糖溶液5 mL、沙蒿籽膠粉末100 mg；10%絲素溶液0.5 mL、1%殼聚糖溶液5 mL、沙蒿籽膠粉末100 mg配制四組共混膠溶液，依次加入10 mL離心管中并做好相應標記(分別為A、B、C、D)，放入超聲震蕩儀超聲15 min，并用玻璃棒攪拌，使之充分混勻。

2.3 圖案化共混膠膜的制備與處理

2.3.1圖案化共混膠膜的制備 分別取A、B、C、D組的共混膠50 μL滴在干凈的小圓玻片上，將洗凈的PDMS印章有圖案的一面壓在液滴上，并使液滴完全覆蓋圖案，見圖1。在通風干燥實驗臺上自然風干3 d后，將印章與玻片剝離，可得完整的圖案化共混膠膜。再將此膜在4%NaOH溶液下浸泡30 min進行脫酸處理，用去離子水洗至pH中性，放入冰箱中保存備用。

圖1 圖案化共混膠膜制備過程

2.3.2共混膠膜光鏡拍照 將圖案化共混膠膜在光學顯微鏡下進行形態學觀察，包括凹槽寬度的各種差異，并利用光學顯微鏡進行拍照觀察。通過放大20倍并拍照記錄，可以看出該圖案含有好幾種不同寬度的凹槽，且寬窄交替排列。

2.4 細胞毒性檢測

2.4.1成纖維細胞的接種 首先對材料進行消毒和滅菌，每組設置三個平行樣放置于24孔板中，標記，在孔板中加入1 mL酒精浸泡30 min后用PBS簡單清洗3次，再將孔板放入紫外超凈臺下照射30 min。將成纖維細胞稀釋為2×104cells/mL，每孔分別種1 mL細胞液，放入培養箱，培養1、3、5 d后移除細胞液，加4%的HCHO固定。

2.4.2甲苯胺藍染色 選出在共混膠膜上培養1 d的成纖維細胞，用PBS清洗3～5遍，每個玻片上加入200 μL的甲苯胺藍染液，置于常溫下染色15～20 min，用PBS洗滌3～5次，然后放置于光學顯微鏡下拍照。利用ImageTool圖像處理軟件統計細胞數量，并用Origin軟件做出統計圖。

2.4.3DAPI染色 在24孔板中培養了1、3、5 d的成纖維細胞用PBS清洗后，向每個玻片上加入20 μL的DAPI染液(5 μg/mL)，玻片染色30 min，用PBS清洗3遍后，用熒光顯微鏡觀察，整個過程避光處理。

2.4.4羅丹明染色 向每個玻片上均勻加入20 μL羅丹明染液(5 μg/mL)，染色30 min后，吸取PBS 1 mL加入孔板中，清洗玻片3遍，熒光顯微鏡觀察并拍照，整個過程要進行避光，避免熒光強度減弱。

2.5 雪旺細胞的粘附、鋪展研究

2.5.1雪旺細胞的接種 將制作好的圖案化玻片以及無圖案化(2.5%CS+100 mgAS)對照組正面朝上放進滅菌后的24孔板中，雪旺細胞(RSC96)的接種同成纖維細胞，見2.4.1節。培養板每孔分別種1 mL細胞液，培養1 d后加4%的HCHO固定。

2.5.2雪旺細胞的甲苯胺藍染色 用4%HCHO固定培養1 d的雪旺細胞，然后PBS清洗3～5次，對玻片進行甲苯胺藍染色，染色方法見2.4.2節。然后在光學顯微鏡下進行拍照記錄。利用Image軟件和Origin軟件分析細胞存活、增殖以及生長形態。

2.6 統計分析

實驗數據采用SPSS17.0進行分析，組間樣品比較采用One-way ANOVA,P<0.05為顯著性差異，數據表示為mean±SD。

3 結果與討論

3.1 圖案化共混膠膜光鏡拍照

首先對樣品采用光學顯微鏡進行拍照觀察，通過放大20倍得到的圖片(見圖2)，可以看出該圖案含有10種不同寬度的凹槽，且寬窄交替排列。將微圖案在顯微鏡下拍照后，利用ImageJ軟件對凹槽的寬度進行測量，根據凹槽寬度的差異，將該微拓撲結構分為9個區域，編號I—IX區。第I區凹槽寬度為20 μm，第II區凹槽寬度主要為5 μm，第III區凹槽寬度為9 μm，第IV區凹槽寬度較大，由33 μm和16 μm組成，第V區凹槽寬度由16 μm和3 μm組成，第VI區凹槽寬度為16 μm和9 μm，第VII區凹槽寬度則由40 μm和30 μm組成，第VIII區凹槽寬度為30 μm和5 μm，第IX區凹槽寬度則由30 μm和9 μm組成。結果表明，本研究成功地將PDMS印章通過微模型法在玻片表面制作了具有微/納復合的圖案化結構。

圖2 20倍光鏡下微/納米圖案化共混膠膜結構(單位長度：100 μm)

3.2 細胞毒性檢測結果分析

3.2.1成纖維細胞甲苯胺藍染色 將培養1 d后的成纖維細胞TBO染色后，在顯微鏡下觀察。由圖3可知，對于無微圖案的空白組，成纖維細胞生長比較雜亂。而對于有微/納米條紋圖案的實驗組，成纖維細胞沿條紋微圖案生長明顯，特別是在CS濃度為5%的微圖案上，細胞的取向性生長更為明顯，而CS濃度為2.5%的微圖案上，細胞沿條紋微圖案生長的趨勢要比5%CS的樣品弱。同時可以看出，生長于較小的條紋凹槽寬度的細胞取向性更好，大部分細胞能呈長梭形沿條紋生長。

圖3 成纖維細胞的TBO染色圖(單位長度：100 μm)

通過ImageTool軟件對20倍光鏡照片進行細胞計數。由圖4可知，培養1 d后，在CS濃度為2.5%和5%的微圖案膜上細胞數量無顯著差異，且有圖案和無圖案的共混膠膜上細胞數量差異也不大。實驗結果表明，成纖維細胞在復合水凝膠制作的微圖案膜上數量較多且生長良好，說明該材料經脫酸處理后，對細胞無毒性，其可以用于研究對細胞生長行為的調控。

3.2.2成纖維細胞熒光染色 對接種有成纖維細胞的微圖形共混膠膜分別培養1、3、5 d，染色后利用ImageJ軟件進行細胞計數，見圖5。由圖5可知，在同一個CS濃度下，細胞數量隨著培養天數的增加而增多。并且在相同時間點，CS濃度為5%的微圖案上的細胞數量比濃度2.5%的微圖案多，但數目相差不大。

注：2.5*：2.5%CS+100 mg AS無圖案；5%*：5%CS+100 mg AS無圖案；2.5%：2.5%CS+100 mg AS有圖案；5%：5%CS+100 mg AS有圖案。

圖5 第1、3、5 d成纖維細胞數量統計圖

利用羅丹明以及染料DAPI分別對培養1、3、5 d的成纖維細胞染色后，用熒光顯微鏡對同一位置的細胞核和細胞骨架，在20倍物鏡下進行拍照，利用PS軟件將細胞核與細胞骨架合成得到圖6。利用合成圖，能夠看出細胞在微圖案上有較明顯的取向性生長，即有沿著微圖案條紋生長的趨勢，且CS濃度為5%的微圖案上的細胞沿著條紋凹槽生長趨勢更加明顯，這和甲苯胺藍染色結果相符。

圖6 成纖維細胞的熒光染色圖(紅光圖為羅丹明染色圖，藍光圖為DAPI染色圖,單位長度：100 μm)

3.3 雪旺細胞粘附和鋪展研究

通過對接種有雪旺細胞的4組圖案化以及無圖案共混膠膜培養1 d后，統計細胞數量，由圖7可知，4組圖案化共混膠膜上的都有較多細胞生長，說明雪旺細胞能夠很好地粘附于該材料上，且B組細胞數量最多，而C組細胞數量最少。由圖8可知，四組帶有微/納拓撲結構的共混膠膜上的細胞均能夠沿凹槽生長，且通過放大40倍的照片能夠看出，D組對于雪旺細胞生長取向的引導作用更強，而對照組E組對雪旺細胞取向性無誘導作用。細胞在微圖案上的鋪展具有一定的取向性，這對于長距離的受損神經修復有促進作用，與Turunen等[20]的實驗結果相一致。

圖7 A、B、C、D、E五組培養1d后雪旺細胞數目統計圖

圖8 A、B、C、D、E五組培養1d后雪旺細胞光鏡圖(左圖紅色框為所選區域，右圖為該區域40倍放大圖)

微圖案共混膠膜上的微/納拓撲結構并非單一尺寸，而是由9種不同尺寸組合而成，已將9個區域分為Ⅰ—Ⅸ區，對9個區域上的雪旺細胞進行取向角分析。圖9中，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區上的取向角低于10°，說明細胞幾乎是沿著凹槽生長的。這是因為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區上的凹槽只有一種尺寸，且凹槽尺寸較小，窄條紋限制細胞的垂直擴散，使得細胞沿著條紋方向水平生長，故對雪旺細胞的生長能夠起很好地引導作用。而Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ區的細胞取向角高于20°，這是因為這三個區域均為兩種較大尺寸的混合凹槽，故對細胞的取向性引導作用不強。而Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ區上的細胞取向角介于10至20之間，且Ⅴ與Ⅶ、Ⅸ區域凹槽的尺寸為一大一小兩種尺寸混合組成。

圖9 雪旺細胞在I—IX區上的取向角統計圖

關于微圖案調控細胞生物學行為的研究已經有大量報道。不同于前人使用單一微圖案拓撲結構，本研究采用復合型的微/納米結構，即在一個基底平面上含有包括微米級和納米級等9個區域，10種不同尺寸的凹槽，更好地模擬了人或動物體內的生理組織結構。通過細胞評價可以發現，本研究所涉及的微/納米復合結構能夠促進神經細胞軸突再生，對細胞的附著、遷移、生長和分化均有一定積極作用。

4 結論

本研究通過聯合采用溶膠凝膠技術及微模塑技術，成功構建了表面具有復合微拓撲結構的SF/CS/SA復合水凝膠，該復合水凝膠無細胞毒性，雪旺細胞能夠在具有微圖形結構的復合水凝膠膜上很好生長，并且該微/納拓撲結構對雪旺細胞的生長取向具有很好地調控作用。該研究的開展將為微納拓撲化人工神經移植物修復周圍神經損傷提供理論和實驗依據，對于開發組織工程的神經移植物具有十分重要的指導意義。