黃曲霉毒素B1檢測與脫毒方法最新研究進展

孫統政 王娜 田俊 楊坤龍

摘要： 食品和谷物中的黃曲霉毒素污染在全球范圍內造成了嚴重的經濟和健康問題。黃曲霉毒素B1（AFB1）具有極強的致突變性和毒性，并且對人類和牲畜均具有強致癌性。有關毒素的脫毒技術一直是國內外的一個研究熱點，其中物理法、化學法和生物法脫毒是主要的脫毒方法。本文結合最新的研究成果， 詳細介紹了黃曲霉毒素B1的毒性及主要的檢測方法，對黃曲霉毒素物理、化學、生物脫毒方法進行了概述。

關鍵詞： 黃曲霉毒素B1;檢測方法;脫毒方法

中圖分類號： TS201.3 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）03-0789-11

Research progress of aflatoxin B1 detection and detoxification methods

SUN Tong-zheng， WANG Na， TIAN Jun， YANG Kun-long

（School of Life Sciences， Jiangsu Normal University， Xuzhou 221116， China）

Abstract： Aflatoxin contamination in foods and grains poses serious economic and health problems worldwide. Aflatoxin B1 （AFB1） is extremely mutagenic and toxic， and is highly carcinogenic to humans and livestock. The detoxification technology for toxins has always been a research hotspot at home and abroad. Among them， physical， chemical and biological detoxification are main detoxification methods. Based on the latest research results， this article introduced the toxicity and main detection methods of aflatoxin B1 in detail and summarized physical， chemical and biological detoxification methods for aflatoxin.

Key words： aflatoxin B1;detection method;detoxification method

黃曲霉菌（Aspergillus flauvs）是一種世界范圍常見的許多重要農作物以及動物的共同致病菌。黃曲霉菌產生的次級代謝產物黃曲霉毒素B1（AFB1）是目前發現毒性和致癌性最強的天然化合物之一[1]。黃曲霉菌能夠感染許多重要的農作物，例如，花生、玉米、棉花等，均可對收獲前后的農作物進行污染，給世界各地的農業生產造成巨大的經濟損失。根據聯合國糧農組織統計，每年約有25%的谷物被真菌毒素污染，其中最主要的就是黃曲霉毒素，給農業造成了巨大經濟損失[2]。中國同樣是黃曲霉毒素污染的重災區，多個省份儲存的玉米和花生中都檢測到了黃曲霉毒素的污染[3-4]，此外，在多個抽樣的醬油以及水產飼料等加工產品中都檢出AFB1 [5-6]。由于黃曲霉毒素B1具有較穩定的理化性質，很難被降解，一旦污染的飼料被禽畜食用，AFB1將在動物體內經羥基化代謝形成和AFB1毒性和致癌性基本相似的衍生物AFM1，一部分的AFB1的衍生物會隨尿液和乳汁排出，而很大一部分會出現在奶制品和肉制品中。

黃曲霉毒素具有較強的毒性、誘變性及致癌性[7]。AFB1是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮[8]，見圖1。AFB1結構中存在3個毒性位點：①呋喃環上的 8、9 位雙鍵， 是毒素與蛋白質和核酸形成復合物的作用位點， 為基因突變以及致癌致畸的主要功能基團;②內酯環部分的 10、11、15 號位點， 易受到水解作用， 因此是較活躍的毒素降解位點;③環戊烯酮環上的 1、2、3、14 號位， 該位點易被取代基團取代， 從而也決定了黃曲霉毒素的毒性。黃曲霉毒素的污染給農牧業生產帶來重大的經濟損失，并嚴重危害人類健康和食品安全，目前世界衛生組織已將其認定為1A類致癌物，2017年中國農業農村部也將農產品中黃曲霉毒素的控制技術作為農業主推技術之一。因此，研究AFB1的脫毒技術變得尤為重要。

1 黃曲霉毒素B1毒性概述

1.1 AFB1對人類和動物的毒性作用

AFB1對人類和幾種動物有劇毒，并具有3個主要特征：親有機性、遺傳毒性和致癌性。它主要對有機體的肝臟親和并產生損害，例如肝出血和肝細胞壞死[9]。遺傳毒性主要是誘導AFB1-DNA加合物的形成和代謝形成ABF1環氧化物（ABFO）引起p53基因的熱點突變。雖然部分AFBO會在谷氨酰胺轉移酶作用下生成AFB1谷胱氨肽結合物或生成AFB1二氫二醇進一步在醛還原酶作用下生成AFB1二羥醇經腎臟排泄出機體，但是剩下的大部分AFB1仍然會損害機體，例如誘導DNA損傷進而引起肝細胞癌變[7]。臨床調查發現，AFB1是乙型肝炎病毒感染患者患肝癌的主要原因。它是一種遺傳毒性肝癌，AFB1通過誘導形成DNA加合物引起癌癥，從而導致靶細胞發生遺傳變化，誘導DNA鏈斷裂和DNA堿基損傷。氧化損傷最終會導致癌癥。AFB1主要通過肝臟代謝，從食物中攝取的AFB1主要通過細胞色素P450酶代謝為最終致癌物AFB1-8-9-環氧化合物（AFBO）。當AFBO與DNA反應時，它通過與鳥嘌呤堿基相互作用而抑制p53（外顯子249的熱點編碼區）中的基因突變，這可能會導致肝細胞癌變。AFB1通過P450系統代謝為許多羥基化產物，包括AFM1、AFQ1、AFP1、AFB2a [7]。黃曲霉毒素被攝入人體后，主要的中毒表現為急性中毒和慢性中毒，急性中毒發作通常由于高濃度的黃曲霉毒素攝入。AFB1在人體中的轉化途徑如圖2所示。

1.2 AFB1對兒童生長發育的影響

生長障礙或發育遲緩是一個重大的公共衛生問題，影響到全世界數以百萬計的兒童，特別是在發展中國家。一項對125名肯尼亞孕婦的調查結果表明，有53%的孕婦血液中黃曲霉毒素生物標志物為陽性，而臍帶血中標志物陽性率為37%，研究還發現黃曲霉毒素陽性的孕婦生產的新生兒體質量明顯降低，另外，研究期間發生的2個死胎僅來自AFB1陽性孕婦[10]。Gong等[11]發現研究地區的479名兒童中有99%的兒童為AFB1-白蛋白陽性，斷奶后兒童陽性水平更高，此外，發育不良的兒童的AFB1-白蛋白水平與身高和體質量之間呈顯著負相關，斷奶的兒童中AFB1-白蛋白水平高于仍在接受母乳的孩子（斷奶后飲食主要以玉米為主），AFB1-白蛋白水平較高的兒童身高平均下降了1.7 cm。這些研究結果表明，胎兒和新生兒暴露于AFB1會對身體生長有顯著影響，尤其在斷奶后階段。

1.3 免疫抑制

動物中的研究結果顯示AFB1具有誘導免疫抑制的作用。例如，在暴露于AFB1的動物模型中發現，B細胞和T細胞的活性降低了，T細胞對AFB1毒性更敏感[12]。在黃曲霉菌引起的曲霉病中，雞的吞噬細胞受到嚴重破壞，從循環中清除異物的能力下降，這可能會降低加工抗原成分的能力[13]。同樣在暴露于AFB1的豬體內，AFB1會降低淋巴細胞對有絲分裂原的反應，抑制大噬菌體遷移并延遲皮膚過敏反應[13]。盡管從動物研究中獲得了許多有關AFB1影響免疫作用的數據，但是關于長期食用被AFB1污染的食物對人體免疫系統影響的數據很少。岡比亞兒童唾液中sIgA水平降低，可能是由于飲食中黃曲霉毒素的暴露水平較高[14]。在對64位加納人的研究中，發現AFB1暴露可能導致淋巴細胞亞群的主要成分T細胞和B細胞減少，與低水平的AFB1白蛋白加合物相比，高水平的AFB1白蛋白加合物能顯著降低CD8+細胞毒性T細胞中穿孔素和顆粒酶a水平[15]。在AFB1水平高的受試者中，這些免疫參數的改變可能導致細胞免疫功能受損，從而降低宿主對感染的抵抗力。

2 黃曲霉毒素B1檢測方法

高效液相色譜法、薄層色譜法和液相色譜質譜法是過去幾十年測定AFB1含量的常規分析方法[16]，這些分析方法具有很高的靈敏度和良好的重復性，但樣品處理繁瑣，需要昂貴的儀器和專業人員，很大程度上限制了其在AFB1快速檢測和現場篩選中的應用[17]。近年來以適配體和新型納米材料為基礎的檢測傳感器因具備靈敏度高、檢出限低、成本低和操作簡單等優勢，在AFB1等毒素檢測中得到了廣泛應用。此外，目前也開發出通過引入基于適配子的不同技術，例如電化學[18]、表面等離子體共振[19]和比色法[20]來檢測AFB1。

2.1 雙真菌毒素比色生物傳感器

比色生物傳感器基于濃度信息轉換為顏色變化的比色，可用肉眼進行分辨而達到檢測目的，具有低成本、便攜性、易操作性等優點，已廣泛應用于霉菌毒素檢測。目前比色測定多集中應用在單一霉菌毒素的檢測[21] ，關于同時檢測多種霉菌毒素的報道較少。Zhu等[22]開發了一種同時檢測雙霉菌毒素的生物傳感器，首次實現了針對AFB1和赭曲霉毒素（OTA）2種霉菌毒素的雙重目標檢測。該雙霉菌毒素檢測的工作原理為：將Fe3O4/GO和TP-GO（TP為百里酚酞，GO為氧化石墨烯）分別與不同的AFB1的半互補鏈結合，然后加入AFB1適體并組裝形成AFB1檢測復合體（圖3A）;同樣，Fe3O4 @Au和AuNPs（金納米顆粒）也與OTA的半互補鏈和適體結合形成OTA檢測復合體（圖3B）;當AFB1和OTA存在時，因適體和靶標之間的親和力強于半互補鏈，兩個檢測復合體都將解離，磁超螺旋離心分離后，提取上清液進行反應，并根據相應溶液在不同pH值下的顏色變化確定AFB1和OTA的量（圖3C）。由于反應條件的不同，兩種傳感方法互不干擾，甚至可以提供更高的檢測效率。雙真菌毒素比色生物傳感器具有良好的檢測性能，線性范圍為AFB1 5～250 ng/ml和OTA 0.5～80.0 ng/ml，具有良好的重現性和選擇性，在微生物和環境領域具有廣闊的應用前景。

2.2 刺激響應型水凝膠生物傳感器

由于適配體具有穩定性好、便攜性、易于存儲和高特異性等特點，DNA /適體交聯的DNA聚合物雜化刺激響應水凝膠引起了廣泛的關注[23]。Tang等[24]在一項研究中，設計了一種簡單的AFB1檢測方法，結合了基于適體的靶標刺激反應水凝膠系統的多功能性以及使用電子天平作為讀數的便利性，以線性透明質酸接枝的單鏈DNA復合物作為主鏈，AFB1適體和聚乙烯亞胺作為交聯劑，構建了AFB1靶標響應性雙交聯水凝膠。鉑納米顆粒（PtNPs）首先被嵌入水凝膠中，AFB1的存在可以提高親和力與適體結合，并導致適體從水凝膠中釋放。通過添加DNA外切酶I（Exo I）可特異性識別并切割AFB1中的適體-適體復合物，導致AFB1釋放;AFB1再次與水凝膠反應，導致水凝膠適體再次釋放，從而實現目標循環。通過這種方式，水凝膠將崩潰，并使大量的PtNP釋放。釋放的PtNP與排水裝置中的H2O2反應，在內部和外部之間產生壓力差，從而排出水，并且水的質量可以通過簡單的電子天平準確稱量。

該方法已用于花生樣品中AFB1的檢測[24]，在新鮮花生樣品中未檢測到AFB1，但在發霉的花生樣品中檢測到約33.16 μg/kg AFB1，AFB1的回收率在91.5%至98.1%之間，結果與AFB1酶聯免疫分析試劑盒的檢測結果[92.8%至97.7%（LOD：1 μg/kg）]基本一致，證明了使用該傳感器檢測食品樣品中AFB1的可行性。

2.3 新型熒光適配體傳感器

近年來，金納米星（AuNSs）因具有特殊的多支化納米結構，且有一個易于修飾和固定材料的中心核，應用范圍廣泛。Zheng等[18]成功地開發了一種新型的適體傳感器，用于基于量子點和AuNSs的熒光定量猝滅劑納米和智能手機光譜讀取器的多農藥實時定量。Wei等[25]以AuNSs作為熒光猝滅材料，制造了用于AFB1檢測的簡單新穎的FRET系統。由于適體的熒光標記會影響適體與其靶標的結合親和力[25-26]，因此，將合成羧基熒光素（FAM）標記的具有發夾結構的互補DNA設計為信號探針。AuNSs不僅固定了大量的信號探針，而且由于其特殊的結構和出色的光學性能，還可以用作淬滅材料。FAM標記的發夾結構（HP）與AFB1雜交適體形成雙鏈DNA，發夾結構被打開。當通過Bio-SA特異性結合在AuNSs的表面修飾雙鏈DNA時，FAM離AuNSs很遠，導致淬滅效率低和熒光強度強。當AFB1存在時，AFB1優先結合適體，導致雙鏈DNA的崩解。FAM標記的HP恢復發夾結構，使FAM接近AuNSs，并降低熒光強度（圖4）。新型熒光適配體傳感器對玉米樣品中AFB1的最低檢出限為21.3 pg/ml，證明新型熒光適配體傳感器的AFB1檢測試驗獲得滿意結果，并且在存在其他高濃度毒素的情況下也表現出良好的選擇性。

3 黃曲霉毒素B1脫毒方法

由于食品中黃曲霉毒素的污染對人類健康構成威脅，并造成嚴重的經濟損失，因此開發高效、安全的AFB1脫毒方法具有重要意義。目前對真菌毒素的脫毒主要有2種策略：（1）防止霉菌污染和生長;（2）污染產品脫毒。常用的脫毒方法包括物理方法、化學方法和生物方法。

3.1 物理方法

3.1.1 加熱脫毒

從食品中去除AFB1的物理方法最常見的是加熱。眾所周知，黃曲霉毒素在高溫下穩定，因此需要苛刻的加熱才能有效地去除黃曲霉毒素。最近的研究結果表明，在150～200 ℃的溫度下可以去除大量的AFB1（平均降低79%），同時在高濕度下最為有效[27-28]。該方法的問題是在加熱和烘烤完成之后難以確保產品的完整性，從而會限制可以使用的最高溫度，可能僅導致部分的AFB1分解。然而，該技術可以容易地以低成本實施，并且可以在2 h或更短時間內實施，從而具有物流優勢。

3.1.2 γ射線脫毒 另一種最常用的物理凈化方法是γ射線脫毒，可用于花生、谷物和動物飼料等多種食品基質。該技術為用γ射線源（例如60Co）輻照食品，直到獲得一定量的電離輻射為止，電離輻射的范圍為6～60 kGy。AFB1含量平均降低65%[29]。使用強輻射存在安全問題，可能使實施這項技術變得困難。

3.1.3 吸附劑脫毒 在食品中添加吸附劑也可有效去除AFB1污染。此方法與降解方法不同，它不破壞、不減少食品中AFB1的量。吸附劑與AFB1結合可防止攝入后AFB1被腸道吸收，從而防止AFB1的肝毒性作用。

（1）葉綠素對AFB1的吸附。Simonich等[30]報道了在向受AFB1污染的飼料中添加葉綠素后，大鼠的AFB1-DNA加合物減少了42%，AFB1-白蛋白減少了65%，腫瘤發生率降低了77%。一項使用人類志愿者的研究中也發現，葉綠素可將尿中AFM1水平降低28%，尿中AFB1水平降低41%[31]。這些數據表明，在高風險地區的飲食中添加吸附劑可能有助于減輕AFB1的毒性作用。

（2）氧化磁性石墨烯（MGO）和磁性石墨烯（MrGO）的納米材料對AFB1的吸附。磁性復合材料的孔徑分布均勻，孔連通性好，表面積大，是吸附有機污染物的優秀吸附劑。Ji等[32]研究結果顯示，MGO和MrGO都能夠在40 min內移除AFB1，對于受污染的油樣，MGO將AFB1從16.1 μg/L降低至2.2 μg/L，去除率為86.33%，當吸附劑量為20 mg/ml時最大去除率達到96.4%。磁性復合吸附劑在AFB1脫毒中的應用，可能為食用油工業開發新型復合吸附劑開辟一條新道路。

（3）黏土對AFB1的吸附。與葉綠素相似，黏土可在消化道中結合AFB1并防止腸道吸收AFB1。鈣蒙脫土（NovaSil）是目前被證明有效的吸附劑黏土，它可以顯著減少AFB1生物標志物的毒性作用[33]。Afriyie-Gyawu等進行了一項長期研究，發現在28周內給大鼠喂食NovaSil含量高達2.0%的飲食后，未觀察到NovaSil具有明顯的毒性[34]。此外，臨床試驗也證實，NovaSil不僅能夠明顯降低參與者的尿AFM1和血清AFB1含量，而且具有較小的副作用[35]。這些結果表明，在飲食中添加NovaSil是降低AFB1毒性的安全有效方法。

3.2 化學方法

3.2.1 山梨酸鉀、水合鋁硅酸鈉鈣、L-蛋氨酸組合法 山梨酸鉀（Sor）是一種有效的食品防腐劑，用于控制各種加工食品中霉菌的生長[36]。蛋氨酸（LM）是一種必需氨基酸，作為谷胱甘肽前體，可消除活性氧和DNA甲基化反應[37]。目前研究發現蛋氨酸有助于抗體的產生并改善血清中IgG水平[38]。因此，在AFB1污染的飲食中添加蛋氨酸可降低AFB1對動物的危害[39]。水合硅鋁酸鈉鈣（Hsc）是一種化學吸附性物質，可以與AFB1形成穩定而牢固的復合物，以減少動物在消化和利用飼料過程中AFB1造成的不良影響，并且復合物還可以減弱AFB1對身體器官的毒性[40]。Reda等[41]發現在飼料中添加山梨酸鉀（Sor）、水合鋁硅酸鈉鈣（Hsc）和L-蛋氨酸（LM）的混合物能夠有效提高兔抗AFB1毒性的能力。

3.2.2 ClO2熏蒸法 二氧化氯（ClO2）是一種具有廣泛且穩定的殺生物活性的強氧化劑和消毒劑，被用作水、水果和蔬菜的消毒劑，已經被聯合國糧食及農業組織（FAO）分類為的食品添加劑。ClO2能夠作用于AFB1毒性和致癌活性的關鍵活性位點——AFB1呋喃環的C8-C9雙鍵。ClO2將AFB1分解為4種物質：C17H13O8、C16H15O10、C17H15O10和C16H11O7。如圖5所示，這4個降解產物的C8-C9雙鍵已被ClO2破壞，從而使經過修飾的AFB1降解產物的毒性大大降低甚至消失[42]。Yu等研究發現，ClO2氣體可以抑制黃曲霉菌菌絲生長、孢子萌發和產生AFB1。隨著ClO2濃度的增加，AFB1的降解率也隨之提高，而且AFB1的降解明顯加快[42]。之前的研究者發現氯和次氯酸鈉的氯化消毒劑能有效降解食品中的AFB1[43]，但是氯處理產生的化學殘留物限制了其應用，并且作為液體消毒劑，次氯酸鈉不適用于干物質（如谷物）脫毒。

3.2.3 殼聚糖包被α-松油醇法 殼聚糖廣泛用于包被生物材料，將某些化合物封裝在殼聚糖納米基質中可以增強其在保護食品中免受微生物污染的功效和穩定性，從而延長其貨架壽命[44]。α-松油醇是一種單萜醇，已在食品工業中廣泛用作調味劑和熏蒸劑，用來保護食品免受微生物和昆蟲的污染。此外它還具有廣泛的藥理特性，例如抗癌、抗炎和抗氧化[45]。將α-松油醇包被在殼聚糖中制成一種殼聚糖納米乳液（α-TCsNe），可用作新型抗真菌防腐劑增強α-松油醇的殺菌作用從而抑制AFB1的形成。α-TCsNe的活性增強可能是由于α-松油醇的抗微生物活性與殼聚糖之間的協同作用所致。此外，納米封裝后的小粒徑大表面積很容易穿透處理過的細胞，并干擾真菌細胞利用必需化合物，從而致其死亡[46]。該方法經濟、方便、無毒、可控、無溶劑，這種方法對操作條件要求低，適用于親水性和親脂性化合物，用于配制穩定的納米乳液[47]。

3.3 生物方法

3.3.1 植物提取物降解 植物精油（EOs）具有顯著的抗菌功效，因此作為健康危害性合成防腐劑的替代品具有巨大潛力，但其尚未被食品工業廣泛使用。研究發現鴨嘴花和檸檬桉的提取物均有超過95%的AFB1降解率[48]。Yadav等[49-50]發現0.3 μl/ml殼聚糖包被的黑孜然精油可完全抑制黃曲霉菌生長和AFB1產生，殼聚糖包被的肉豆蔻精油在1.25 μl/ml時便可以完全抑制AFB1產生，都具有很強的自由基清除活性。Prakash等對馬郁蘭、芫荽、草果藥、沒藥和香水樹5種植物提取精油的抑菌、殺菌和對糧食的菌染防護率進行了研究，結果見表1[51]。

3.3.2 益生菌抑制 利用微生物，特別是具有益生菌性質的微生物用于AFB1脫毒，是一種綠色高效、環保、廉價和安全的策略。不同類型的益生菌脫毒方式不同，有的將AFB1改造成其他無毒或低毒的次級產物或異構體，以達到消除食品和飼料中AFB1的目的。最新的益生菌脫毒研究成果如表2所示。Yang等[52]近期研究發現，利用米曲霉菌或者不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌突變體可以抑制黃曲霉菌的生長和毒素的合成。Xing等早期也運用黑曲霉菌來拮抗黃曲霉菌，從花生中分離到20株黑曲霉菌，20個黃曲霉毒素生物合成基因中有19個被黑曲霉菌下調[53]。因此，利用不產毒的黃曲霉菌或者安全的曲霉工業用菌可以有效地對產毒黃曲霉菌進行生物防治，可減少產毒黃曲霉菌對許多農產品的侵染及合成毒素，達到提前防控并減少經濟損失的作用[54]。

3.3.3 基因水平調控 基因水平調控是指在基因轉錄或翻譯水平上，利用一些綜合性方法處理黃曲霉菌，使黃曲霉菌的某些產毒基因被抑制甚至阻斷或下調黃曲霉菌生命活動的必須基因，從而限制AFB1合成所必需的蛋白質、酶和化學物質的形成，甚至殺死黃曲霉菌。黃曲霉毒素合成基因簇如圖6所示。

Dhanamjayulu等[55]使用苯并咪唑及其衍生物下調黃曲霉菌的AFB1合成基因中的調控基因aflR和結構基因aflB表達，有效抑制AFB1的生物合成，僅10 μg/ml的質量濃度抑制效率便達到了98%，但是并不影響黃曲霉菌的正常生長。Casquete等[56]利用pH、水分活度和溫度對2個調節基因（aflR和aflS）和1個結構基因（aflP）表達的進行了研究，結果表明在pH 5.5、水分活度0.95和20～25 ℃時基因具有最高表達水平和AFB1積累量。Xing等[53]利用黑曲霉菌拮抗黃曲霉菌，發現aflS的表達顯著下調，導致aflS/AflR比值降低，表明黑曲霉菌可通過降低aflS的豐度而直接抑制AFB1的生物合成。近期，Chen等[57]從Bacillus megaterium中分離出的短肽L-Asp-L-Asn （DN）可以有效抑制黃曲霉菌的生長。

4 結語

黃曲霉毒素B1是目前發現毒性和致癌性最強的天然污染物之一，對人類和動物健康安全存在潛在威脅。因此對黃曲霉菌和黃曲霉毒素的研究也成為近幾十年來國內外同行研究的熱點。本文主要綜述了AFB1的毒性，以及近年來AFB1檢測和脫毒方法。由于AFB1的低劑量、高毒特性，開發出更靈敏、更快速、更經濟的檢測手段是新的趨勢和挑戰。盡管目前已有多種AFB1脫毒方法，但是每種方法都有各自的優點和缺陷，很難做到既能保障脫毒食品的風味品質，又能確保食品安全。對于黃曲霉毒素的防范應早發現，AFB1一旦進入后期的食品加工鏈，即使脫毒技術再成熟也會帶來健康威脅。因此對黃曲霉毒素的早期檢測以及消除其在農作物收獲前后的污染對黃曲霉毒素的預防具有重要意義。

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（責任編輯：張震林）