假單胞菌PL-21的鑒定及其拮抗2種蘋果病原菌的作用

路兆軍 于曉麗 苗杰 趙瑩 王淑惠 陳麗英 李保進

關鍵詞： 假單胞菌;生物防治;蘋果病原菌

中圖分類號： S432.9+ 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）03-0808-04

Identification of Pseudomonas sp. PL-21 and its antagonistic effect on two apple pathogens

LU Zhao-jun1， YU Xiao-li2， MIAO Jie1， ZHAO Ying1， WANG Shu-hui1， CHEN Li-ying1， LI Bao-jin1

（1.Yantai Research Institute of Forestry，Yantai 264013，China;2.Yantai Agricultural Sci & Tech Institute of Shandong Province，Yantai 265500，China）

Key words： Pseudomonas sp.;biological control;apple pathogens

無致病假單胞菌是一類分布廣泛、資源豐富的革蘭氏陰性菌，目前已發現多種假單胞菌對植物的促生及防病作用明顯，具備開發成為生防制劑的潛力[1-3]。其生防機制主要包括分泌噬鐵素參與植物根際營養競爭、分泌抗生素類物質抑制病原菌生長、誘導植物產生系統抗病性等[4-6]。蘋果斑點落葉病、蘋果褐斑病分別是由蘋果鏈格孢強毒菌株（Alternaria alternaria f.sp mali）、蘋果盤二孢（Marssonina coronaria Davis）侵染引起的病害，這2種病害因顯病時間長、擴散速度快、危害嚴重等特點逐漸成為蘋果生產上的主要病害[7-9]，病害大流行時，兩者與其他蘋果早期落葉病極易形成復合侵染，使果樹葉片在8-9月即大量脫落，影響蘋果的產量和經濟效益[10-11]。

目前，蘋果斑點落葉病、褐斑病等蘋果主要病害的防治主要依賴于化學農藥，其成本低廉且見效快，但長期重復使用單一化學藥劑帶來的病原菌耐藥性、果品農藥殘留，危害人體健康及環境污染等問題日益突出[12]。因此，開發應用高效生防菌劑防治此類病害具有重要意義。本研究以從煙臺市蓬萊區蘋果根際分離到的1株假單胞菌PL-21為對象，明確其分類地位，分析其對蘋果斑點落葉病病原菌等的抑菌活性及離體防效，為今后相關病害生防制劑的開發與應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

假單胞菌PL-21分離自煙臺市蓬萊區蘋果根際，由煙臺市林業科學研究所實驗室保存。蘋果斑點落葉病病原菌（Alternaria alternaria f.sp mali）、蘋果褐斑病病原菌（Marssonina coronaria Davis）、蘋果圓斑病病原菌（Phyllositic solitaria）、蘋果輪斑病病原菌（Alternaria mali Roberts）由本實驗室保存，蘋果輪紋病病原菌（Botryosphaeria dothidea）、蘋果炭疽病病原菌（Colletotrichum gloeosporioides）由煙臺市農業科學研究院提供。馬鈴薯胡蘿卜培養基（PCDA）[13]用于病原菌的保存及拮抗菌株抑菌分析;牛肉膏蛋白胨液體培養基（NB）用于拮抗菌株發酵、培養;牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（NA）用于拮抗菌株培養、保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株PL-21的鑒定 按照《常見細菌系統鑒定手冊》[14]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[15]的方法對菌株PL-21進行形態和生理生化特征鑒定。以PL-21總DNA為模板，用細菌16 S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增并由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。測序結果與 NCBI 數據庫進行BLAST序列比對，下載同源性較高的相關菌株基因堿基序列，利用 MEGA軟件采用鄰接法構建系統發育樹。

1.2.2 菌株PL-21的抗菌活性分析 采用平板對峙法[16]測定菌株PL-21對蘋果斑點落葉病病原菌等的拮抗活性，以不接種PL-21的平板作對照，28 ℃恒溫培養5～8 d，3次重復。采用菌絲生長速率法[17]測定菌株PL-21無菌發酵濾液對蘋果斑點落葉病病原菌等的抗菌活性：將菌株PL-21活化后按2%的體積比接入含100 ml發酵培養基的250 ml三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養72 h即得發酵液，發酵液經5 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm的微孔濾器過濾除菌后得到發酵濾液。發酵濾液按1∶50的體積比與50 ℃左右已滅菌的PCDA培養基混勻后倒平板，用6 mm打孔器打取活化好的指示菌菌餅置于平板中央，以未加發酵濾液的平板為對照，28 ℃恒溫培養5～8 d，3次重復。抑菌率計算公式：抑菌率（%）=（對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/對照病原菌菌落直徑×100%。

1.2.3 菌株PL-21發酵濾液對指示菌孢子萌發的抑制作用 蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌在PCDA平板上培養10 d后，用無菌水沖洗菌落配制成孢子懸液，按1∶1（體積比）分別將100%、60%、20%的發酵濾液與1 ml 1×104個的2種病原菌孢子懸液混合，使發酵液終體積分數為50%、30%、10%，以NB培養液按同樣比例與2種病原菌孢子懸液混合作對照，28 ℃ 培養，6 h、12 h、24 h后鏡檢，芽管長度超過分生孢子小端直徑50%視為萌發，3次重復，計算孢子萌發抑制率[18]。

1.2.4 菌株PL-21發酵濾液對指示菌的離體防效 采用平皿葉片法[19]進行菌株PL-21的離體防效試驗。清洗干凈健康蘋果新葉后用75%酒精浸泡10 s，無菌水沖洗并置于超凈臺晾干，在PL-21發酵濾液中浸漬1 h，超凈臺內晾干，以在NB培養液中浸漬1 h為對照。處理結束24 h后用手術刀擦傷蘋果新葉，配制含量為1 ml 1×106個的蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌孢子懸液，每個葉片上滴60 μl孢子懸液并涂抹均勻后保濕培養，每個處理20張葉片，3次重復。10 d后按照病情分級標準進行調查和統計防效[20]。病情指數和防治效果公式如下：病情指數（%）=Σ（本級代表值×本級葉數）/（最高發病級代表值×調查總葉數）×100%;防治效果（%）=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100%

1.2.5 數據處理 利用 SPSS 22.0 軟件進行數據的統計分析，采用Duncans新復極差法進行多重比較及顯著性分析（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 菌株PL-21的形態特征

菌株PL-21在NA平板上生長24 h后，形成近圓形、乳白色至淡黃色菌落，邊緣較為規則，中央稍隆起，不透明，菌體桿狀，革蘭氏陰性。

2.2 菌株PL-21的生理生化特征

菌株PL-21的生理生化試驗結果表明，該菌為好氧菌，硝酸鹽還原試驗無顏色變化，可液化明膠試管培養基，葡萄糖發酵反應無氣泡產生及顏色變化，淀粉水解反應不產生水解圈，在加入 2% 氯化鈉的平板上可正常生長但不能在加入 5%氯化鈉的平板上生長，在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上于4 ℃條件下可緩慢生長。參考《常見細菌系統鑒定手冊》，菌株 PL-21與假單胞菌的特征基本相似。

2.3 菌株PL-21的16 S rDNA序列分析

PCR 擴增16 S rDNA堿基序列及測序結果表明，菌株PL-21的16 S rDNA堿基序列長度為1 435 bp，將該序列提交到GenBank數據庫，獲得登錄號GenBank NO. MT378354。將該序列與 GenBank 數據庫收錄的代表菌株的 16 S rDNA堿基序列進行BLAST比對，結果與假單胞菌屬的幾個種的堿基序列相似度達99%以上。用MEGA5構建系統發育樹，結果發現菌株PL-21與假單胞菌AAS-156（KY810664.1）聚類在一個分支上。結合形態觀察、生理生化測定及系統發育分析結果，初步確定菌株PL-21為假單胞菌 （Pseudomonas sp.）。

2.4 假單胞菌PL-21及其發酵濾液的抗菌活性

經平板對峙法分析假單胞菌PL-21的抗菌活性，結果表明，PL-21對6種病原菌具有不同程度的拮抗活性，其中對蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果圓斑病病原菌、蘋果輪斑病病原菌的抑菌帶寬度分別為2.70 cm、1.72 cm、1.23 cm，對蘋果褐斑病病原菌、蘋果輪紋病病原菌、蘋果炭疽病病原菌的抑菌帶寬度分別為0.87 cm、0.95 cm、0.33 cm。

多數生防菌在發酵時可產生多種次生代謝產物來抑制植物病原菌的生長。菌絲生長速率測定結果表明，假單胞菌PL-21的發酵濾液對蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌的抑制率較高，分別為59.4%、65.22%，對蘋果輪紋病病原菌、蘋果圓斑病病原菌、蘋果輪斑病病原菌的抑制率次之，對蘋果炭疽病病原菌的抑制率最低，僅為7.46%。

2.5 PL-21發酵濾液對指示菌孢子萌發的抑制作用

終體積分數為50%、30%、10%的PL-21發酵濾液均可抑制指示菌孢子萌發，相同的時間內抑制率隨體積分數增大而升高，同體積分數抑制率隨時間延長而降低，終體積分數為50%的發酵濾液24 h時對蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌孢子萌發的抑制率分別為60.6%、71.7%。

2.6 PL-21發酵濾液對指示菌的離體防效

經PL-21發酵濾液處理后，葉片上蘋果斑點落葉病病斑、蘋果褐斑病病斑呈褐色、邊緣清晰且面積明顯小于對照，葉片仍然呈綠色;對照組葉片病斑逐漸變大后呈褐色或黑褐色且連成片狀，根據病情分級標準對防效試驗的定量統計結果顯示，處理組病情指數明顯降低，分別比對照降低40.37%、50.37%，PL-21發酵濾液可顯著降低蘋果葉片的發病程度，離體防效分別為54.50%、63.55%（表1）。

3 討論

本研究通過形態觀察、生理生化指標測定及16 S rDNA堿基序列分析，初步判定從蘋果根際中分離的PL-21為假單胞菌（Pseudomonas sp.）。假單胞菌作為拮抗微生物已被應用于多種植物病害的生物防治[21]，如婁海博等[22]分離的熒光假單胞菌SN15-2對番茄青枯病的防效可達46.58%，董國菊等[23]發現熒光假單胞菌P-72-10可顯著抑制煙草疫霉菌菌絲生長，且對煙草黑脛病也有良好的控病效果。本研究首次明確了假單胞菌PL-21對6種蘋果病原菌的廣譜拮抗活性，進一步拓寬了假單胞菌的生防應用范圍;其發酵濾液對蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌菌絲抑制率分別高達59.40%、65.22%，結合唐遠江[24]、寧爽[25]的研究結果分析，可能是PL-21分泌的抗生素、纖維素酶等代謝產物對病原菌生長具有毒力效應，隨后的孢子萌發試驗驗證了這一推測：PL-21發酵濾液對蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌孢子萌發的抑制作用隨發酵濾液體積分數升高而升高，50%發酵濾液在24 h對2種病原菌孢子萌發的抑制率分別為60.6%、71.7%。由于生防菌株在實際應用中需要克服植物表面諸如濕度、營養、微生物等多種因素才能發揮效能[20]，本研究測定了PL-21發酵濾液對蘋果斑點落葉病、蘋果褐斑病的離體葉片防效，結果分別為54.50%、63.55%，這與拮抗試驗結果和孢子萌發試驗結果具有一致性，進一步驗證了PL-21的生防潛力。

PL-21及其發酵濾液對蘋果常見病害的廣譜抑菌特性，特別是對蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌的高拮抗活性和較好的離體防效，豐富了相關病害生物防治的微生物資源及技術儲備。在后續試驗中，一方面需結合抗菌物質合成基因分析、蛋白質質譜分析等手段明確PL-21的抗菌代謝產物類型，另一方面，由于假單胞菌作為一類常見的植物根際促生菌，對植物具有明顯的促生作用[26-28]，還需驗證PL-21的果園防效及其對蘋果的促生效果，為相關生防制劑的開發利用奠定基礎。

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（責任編輯：陳海霞）