江西省蓮花縣百合病毒病分子鑒定

葉曉夢，曾 帥，石緒根，崔汝強

江西省蓮花縣百合病毒病分子鑒定

葉曉夢，曾 帥，石緒根，崔汝強*

（江西農業大學 農學院，江西 南昌 330045）

【目的】為了檢測和鑒定采自江西省蓮花縣百合樣品。【方法】利用已報道侵染百合的3種主要病毒黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、百合斑駁病毒（lily mottle virus，LMoV）、百合無癥病毒（lily syptomless virus，LSV）的特異性引物對樣品進行RT-PCR分子檢測與鑒定。【結果】擴增得到657 bp和428 bp 2條片段與CMV和LMoV預期片段大小一致，未檢測到LSV。測序結果表明，擴增序列片段與GenBank的CMV、LMoV同源性分別為99.08%和98.56%。【結論】該地百合受黃瓜花葉病毒及百合斑駁病毒復合侵染。

百合；百合病毒病；多重RT-PCR

【研究意義】百合（var.）是百合科（Liliaceae）百合屬（）多年生草本植物，喜涼耐寒。百合原產于中國，現主要分布在歐、亞和北美洲等北半球溫帶地區。百合具有重要的藥用、食用和觀賞價值，現已成為我國一種重要的經濟作物。由于鱗片扦插是目前百合無性繁殖的主要技術，也導致了百合病毒的傳播與擴散，嚴重降低了百合的觀賞和經濟價值[1-2]。【前人研究進展】我國栽培百合普遍受病毒侵染，病原和田間癥狀較為復雜。目前為害嚴重的病毒主要有3種，黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、百合無癥病毒（lily symptomless virus，LSV）和百合斑駁病毒（lily mottle virus，LMoV），其它病毒為局部地區發生，為害較輕[3]。黃瓜花葉病毒百合株系（cucumber mosaic virus Lily strain）主要為害百合，可引起百合花葉病[4-5]，多為局部侵染。侵染百合后癥狀表現為輕型花葉、斑駁和扭曲，病葉最后脫水變褐；花畸形，花瓣開裂呈現長條紋狀。重病株矮化，鱗片短不開花。百合斑駁病毒為馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）成員，侵染百合后一般無癥狀表現或產生褪綠斑，與黃瓜花葉病毒復合侵染時產生花葉和壞死斑[5-8]。百合無癥病毒單獨侵染百合時一般無明顯癥狀出現，但在一定溫度下，某些品種會出現特異癥狀。如在15 ℃下侵染麝香百合幼苗一定時間，幼苗出現卷曲條紋（白色斑紋和葉片扭曲狀）[8]。在自然侵染狀態下，百合無癥病毒和黃瓜花葉病毒復合侵染引起百合壞死斑病[4]。【擬解決的關鍵問題】本研究對江西省蓮花縣坊樓鎮東邊村百合谷的疑似病毒病花葉、卷曲等癥狀的百合病株，進行室內分子檢測鑒定，采用多重RT-PCR技術實現了百合病毒病毒源檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百合病株于2019年采自江西省蓮花縣坊樓鎮東邊村百合谷。大腸桿菌DH5α為江西農業大學植物病理實驗室保存。

克隆載體pMD18-T購自大連TaKaRa公司，RNA提取試劑Trizol、RNA反轉錄試劑、DNA聚合酶購自美國Invitrogen公司，2×RapidMaster Mix試劑盒、Clone Express? II One step cloning Kit購于南京諾維贊公司，DNA凝膠回收試劑盒購于美國Axygen公司，參照王沖[9]和徐榕雪[10]合成3對特異性引物，引物合成及克隆測序由北京新業擎科公司完成，引物序列見表1[9-10]。

表1 PCR擴增引物

1.2 總RNA的提取

使用Trizol法提取健康百合葉片以及感染病毒百合葉片總RNA。取0.1 g百合葉片于預冷的研缽中，加液氮充分研磨，將樣品粉末轉入2 mL預冷離心管；向樣品離心管加入1 mL Trizol試劑，充分混勻后于室溫放置5 min；加入200 μL氯仿，充分混勻后于室溫放置2～3 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min；吸取上清置于新的預冷處理的1.5 mL離心管，加入500 μL預冷的異丙醇，輕輕混勻，室溫放置10 min后低溫高速離心10 min；棄上清，加入1 mL 體積分數為75%預冷的乙醇洗滌RNA，混勻，低溫低速離心5 min，棄上清；干燥沉淀，然后用20 μL DEPC水溶解RNA。提取的總RNA于-80 ℃冰箱保存備用，并取3 μL用凝膠電泳來檢測提取的RNA質量[11]。

1.3 RT-PCR擴增

以提取的總RNA為模板，在M-MLV反轉錄酶作用下，用隨機引物合成cDNA[12]。再以cDNA為模板，進行PCR擴增，使用50 μL快速PCR反應體系：2×RapidMaster Mix 25 μL、引物CMV-F（10 mmol/L）2 μL、引物CMV-R（10 mmol/ L）2 μL、ddH2O 14 μL、cDNA 2 μL。PCR擴增程序為95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；57 ℃，15 s；72 ℃，30 s；共35個循環；72 ℃，5 min。除擴增引物及退火溫度有所變化，下文PCR擴增體系均參照上述體系進行[13]。PCR產物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳檢測觀察后，參照DNA凝膠回收試劑盒說明書進行回收純化。

將PCR純化回收產物連接至載體pMD18-T，轉化感受態大腸桿菌DH5α，以通用引物M13F/R進行菌落PCR鑒定，鑒定得到的陽性克隆菌液送北京新業擎科公司測序，測序結果與GenBank數據庫已登錄的序列進行BLAST比對。

2 結果與分析

2.1 田間發病百合癥狀

發病百合癥狀如圖1所示，發病植株表現為生長不良，萎縮矮小，葉片變黃、畸形、產生黃色斑點及褐色條斑。

圖1 田間發病百合

2.2 多重RT-PCR檢測

以cDNA為模板，用3對特異性引物CMV-F/R、LMoV-F/R和LSV-F/R進行單重及多重PCR，如圖2所示。電泳結果顯示，百合病葉分別擴增出657 bp和428 bp 2條片段分別與黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒的片段大小相一致，百合健康葉片cDNA無任何擴增產物。將PCR產物克隆測序后分析表明，克隆得到的CMV CP基因片段與Genbank已登錄的CMV CP基因序列（登錄號：AAM81374.1）片段同源性為99.08%，LMoV CP基因片段與Genbank已登錄的LMoV CP基因序列（登錄號：ADO34171.1）片段同源性為98.56%。

3 結論與討論

目前，在侵染百合的病毒中，CMV、LSV及LMoV為主要流行病毒，我國百合種植基地普遍存在幾種病毒復合侵染現象。由于我國百合切花的生產主要依靠進口百合無毒種球，經過二代種球繁育，種植二代種球帶毒率高，嚴重影響百合鮮切花的觀賞品質及經濟價值。因此，建立并使用多重RT-PCR檢測方法十分重要，即便在病毒含量較低時，也能快速準確檢測出百合帶毒種類。王繼華等[1]建立了LMoV與LSV的多重PCR檢測技術，整個過程可在6～7 h內完成，相較于常規PCR，大大節約了檢測時間。黎昊雁等[7]建立的百合X病毒（LVX）、LSV及LMoV的單一、雙重及三重PCR體系檢測靈敏度達到了ng級，其中雙重PCR大部分可達到pg級，能滿足組織內病毒含量不高時病毒檢測及盡早檢測百合植株是否帶毒的需要。徐榕雪等[10]建立了同步檢測CMV、LMoV和LSV的多重RT-PCR體系，擴增產物測序結果表明，這3種病毒的CP基因序列地域差異不明顯，為高度保守序列。RT-PCR技術檢測的特異性及靈敏度均優于免疫學方法，相比于檢測方法，這種方法安全可靠、簡便迅速。因此，建立多重RT-PCR的病毒檢測體系對百合種植基地十分重要。

本試驗應用單重及多重RT-PCR方法，參照王沖[9]和徐榕雪[10]合成的3對病毒CP基因特異性引物，對侵染江西省蓮花縣坊樓鎮東邊村百合谷的百合的病原進行檢測，結果顯示該地百合受黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒復合侵染，為當地首次報道。此次檢測結果可為江西省蓮花縣百合種植區病毒流行檢測提供技術支持。

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Molecular Identification of Lily Viruses in Lianhua County, Jiangxi Province

YE Xiaomeng,ZENG Shuai, SHI Xugen, CUI Ruqiang*

(School of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

This study was conducted to detect and identify the viral causing agents that infected lily in Lianhua County, Jiangxi Province.Total RNA were subjected to detect the viruses by using the reported specific primers of 3 main viruses-cucumber mosaic virus (CMV), lily mottle virus (LMoV), and lily syptomless virus (LSV), which were demonstrated by the reverse transcription-PCR (RT-PCR).The primers could be amplified to obtain CMV (657 bp) and LMoV (428 bp) expected for fragments with the same fragment size, but no LSV was detected. Cloning, sequencing and analyses showed that the amplified sequences had 99.08% and 98.56% identities with CMV and LMoV, respectively.In this study, the results suggested that lily was infected by CMV and LMoV.

lily; lily virus disease; multiplex RT-PCR

S432.1

A

2095-3704（2021）02-0146-04

2021-04-20

國家自然科學基金項目（31860494）

葉曉夢（1997—），碩士生，主要從事植物病理學研究，xiaomeng_ye@stu.jxau.edu.cn；*通信作者：崔汝強，教授，博士，cuiruqiang@qq.com。

葉曉夢, 曾帥, 石緒根, 等. 江西省蓮花縣百合病毒病分子鑒定[J]. 生物災害科學, 2021, 44(2): 146-149.