組培條件下空心蓮子草匍匐莖段根系發育的研究

郭雅琪，姚 振，陳中義

組培條件下空心蓮子草匍匐莖段根系發育的研究

郭雅琪，姚 振，陳中義*

（長江大學 園藝園林學院，湖北 荊州 434025）

【目的】空心蓮子草是一種世界范圍的惡性入侵雜草，其貯藏根的形成在其入侵中具有重要作用，對其不定根的發生及其膨大情況進行研究有助于人們有針對性的進行防控。【方法】利用組織培養體系，對空心蓮子草匍匐莖段進行無菌培養，培養條件主要考慮培養基凝固劑的類型、外植體是否帶節、外植體節下莖段長度、外植體扦插方式和扦插深度。【結果】空心蓮子草莖段比較理想的組培條件為：帶1節長度為4 cm的去葉空心蓮子草莖段，使用體積分數75%酒精浸泡1 min，0.1%升汞浸泡6 min消毒，在MS培養基中連續繼代培養，采用第3代無菌苗的莖段作為外植體，在含有普通瓊脂的MS培養基（鉀離子濃度降至標準培養基60%）條件下，節下部長度為1.5 cm帶節外植體正向扦插深度為1.4 cm的時候，可以獲得生長良好的空心蓮子草植株。實驗發現外植體的下部截口上方的莖段能夠不經過愈傷組織誘導直接生長出不定根，即出現節間生根現象。外植體培養70 d時，發現有部分不定根出現膨大趨勢。繼續培養80 d后，筆者觀察到空心蓮子草不定根出現明顯膨大。【結論】研究成功構建了空心蓮子草莖段不定根膨大的組織培養體系，為進一步在組培條件下開展空心蓮子草貯藏根的形成機理研究提供依據。

空心蓮子草；匍匐莖；不定根；組織培養。

【研究意義】空心蓮子草［（Mart.）Griseb.］是一種惡性外來入侵植物，其主要入侵地有河流、沼澤、池塘、菜地和農田等水生和陸地環境，對入侵地的生態系統具有嚴重的負面影響[1-2]。空心蓮子草主要通過地上部的匍匐莖和地下莖進行無性繁殖，具有超強的無性繁殖能力[3-4]。在水體中漂浮生長的時候，其匍匐莖節部可產生大量不定根，然而，當空心蓮子草匍匐莖的不定根有機會接觸到土壤后，其不定根在土壤中可進行不同程度的膨大生長，形成貯藏根[5]，這種貯藏根是陸生型空心蓮子草越冬、繁殖和種群擴散的重要保障[6-7]。可見空心蓮子草的根系構型隨環境條件的變化而變化，研究空心蓮子草根系生長發育，尤其是貯藏根的發育，對于揭示空心蓮子草成功入侵的機制具有重要作用[8-9]。【前人研究進展】近年來對空心蓮子草根系的研究，主要采用莖段扦插盆栽育苗的方法，例如對根系生長動態的研究[6]、環境條件尤其是水分狀況對根系發生的影響[8]、外源激素施用對貯藏根生長的研究[10]等，莖段扦插盆栽育苗能夠在短時間內獲得相對均勻一致的空心蓮子草幼苗，為開展系列控制實驗打下基礎。【本研究切入點】莖段扦插試驗存在局限性，例如，難以直接觀察植物根系生長情況，在試驗中可能受到病蟲害和邊緣效應的影響等。【擬解決的關鍵問題】Shekhawat等[11]使用組織培養方法研究了空心蓮子草大規模繁殖技術，主要為開展藥用化學物質提取做準備，但其操作復雜，成本較高。本文試圖利用組織培養體系，尋求一種操作簡便，經濟有效的空心蓮子草莖段組織培養方法，對其根系發育情況進行研究，為揭示空心蓮子草的入侵機制和開展入侵防控提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019年12月23號，在荊州市西郊田間溝渠采集長約4 cm生長健壯的空心蓮子草的帶節莖段，去葉，清洗干凈用流水沖洗30 min后，使用體積分數75%酒精震蕩沖洗1 min，再用0.1%升汞進行震蕩沖洗6 min消毒，最后用無菌水沖洗5遍，每次沖洗1 min，使用MS培養基進行接種。待外植體萌出1~2 cm的新枝后，將帶節新枝切下并接入MS培養基，此為第1代無菌苗；待無菌苗長出3節以上后，切成帶一節的含葉莖段接入培養基，此帶一節的莖段長成的無菌苗為第2代，依次進行，本試驗使用第3代無菌苗作為組培試驗材料。

1.2 試驗處理

試驗設計考慮了多種因素，按單因素設計實驗方案。首先降低MS培養基中鉀離子濃度（降至標準培養基60%，含硝酸銨1 971 mg/L，硝酸鉀1 090 mg/L），培養基的凝固劑分別使用卡拉膠3 g/L和普通瓊脂8 g/L；外植體莖段分帶節和不帶節處理，不帶節處理中外植體長為2 cm，接種深度為0.9 cm左右；帶節外植體的節下部分設置3種長度，為1.5，0.5，0.1 cm，接入培養基的深度分別為1.4，0.4，0.1 cm；外植體莖段分別進行芽朝上或芽朝下（正插和倒插）方式進行接種；節下部分長度為1.5 cm的外植體接入培養基的深度設置3種處理，為0.4，0.9，1.4 cm。實驗所用的器皿為試管(長23 cm，直徑為3 cm，容積100 mL)，每支試管均含培養基約60 mL左右，外植體的節上部分長度均為1 cm，節間直徑為0.15 cm左右，去掉葉片后保持垂直或略帶傾斜接入培養基，每支試管接入外植體（扦插）一個，培養溫度為（26±1）℃，光照時長14 h，外植體的地上部分的光照強度為1 600~1 800 lx，地下部分（根系生長部分用泡沫紙板進行遮光）的光照強度為270 lx左右。實驗共9個處理，每個處理共10個重復，共培養9×10=90個植株。

1.3 測量方法與數據分析

1.3.1 根系形態分析 在空心蓮子草的外植體生長70 d進行取樣，根據外植體的成活情況，每個處理取樣數為5株，其余外植體繼續培養觀察。每株空心蓮子草從試管中取出并洗凈后，統計空心蓮子草節間和節處的生根情況（總生根數和直徑≥0.15 mm的根數）和葉片數（葉片長度≥0.5 cm的片數），使用游標卡尺（精度0.01 mm）測量直徑≥0.15 mm不定根最大橫徑處的直徑、莖段的直徑（側莖由下向上第4至第5節處節間的橫徑）和長度。使用萬深LA-S根系分析獨立版植物根系分析儀對根系進行掃描，測量的指標包括節處不定根系的總長度、總體積和總表面積，節間處的不定根的總長度、總體積和總表面積。最后，將每株植株分成莖葉和根分別放入GZX-9140烘箱中，80 ℃下烘干至恒質量（48 h），用電子天平（METTLER TOLEDO PL303-IC（精度0.001））分別稱量地上莖葉干質量、根系干質量。試驗數據運用WPS和SPSS22.0軟件進行數據統計和方差分析，利用單因素分析法（one-way ANOVA）法進行顯著性檢驗。

表1 9個處理的處理方法

2 結果與分析

2.1 空心蓮子草匍匐莖段萌發情況

絕大多數的外植體的萌動順序為側芽萌發、節間處產生不定根、節處產生不定根，少許外植體側芽萌動后，先節處產生不定根后節間處產生不定根。除A4處理外，其他處理的空心蓮子草莖段（外植體）的節部均能產生不定根；除A3和A6處理外，其它處理的外植體節下部的節間處（以下統稱節間）均可生長出不定根（圖1），但生長20~25 d后，觀察到許多不定根尖端變黑，并停止伸長。外植體節部、節間及截口處均沒有產生愈傷組織，絕大多數的外植體節上部逐漸枯萎。可見，在組培條件下，空心蓮子草匍匐莖段能夠成功萌發植株。

A、B為生長的第14天的A1處理，外植體截口上部（節間處）產生不定根；C為A4處理，外植體不帶節，能生長出不定根，但沒有產生芽；D為A2處理中，外植體生長產生的空心蓮子草；可見外植體節部和節間處均有不定根產生

2.2 不同凝固劑對空心蓮子草生長情況的影響

用瓊脂作為凝固劑，空心蓮子草的不定根總數、節部不定根數、節間處的不定根數顯著高于卡拉膠凝固劑處理（0.05），而根冠比則顯著降低（<0.05）。瓊脂凝固劑處理中空心蓮子草地上葉片數、莖段長度、地上干質量高于卡拉膠處理，但差異不顯著（>0.05）（表2）。瓊脂處理中節間處的不定根有膨大現象發生。這表明，瓊脂凝固劑有利于空心蓮子草不定根發生，并且有利于誘導不定根的膨大。

表2 不同凝固劑中空心蓮子草的生長情況（70 d）

表中數據為平均數±誤差，同列后的不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（<0.05）

2.3 外植體的接種方向對空心蓮子草生長情況的影響

空心蓮子草莖段無論正插還是倒插在培養基上，莖段均能生出側芽和不定根。倒插方式的外植體節間處沒有不定根發生，僅節處能產生不定根，其根系干質量平均為（0.004 7±0.001 6）g/株，顯著低于正插的空心蓮子草根系干質量（0.006 6±0.000 4）g/株（0.05）。2種接種方式對實驗中其余指標沒有顯著差異（>0.05）。這表明在組培體系中空心蓮子草莖段萌發對極性不存在依賴性。

2.4 外植體節下部分莖段的長度對空心蓮子草生長的影響

外植體節下長1.5 cm處理（A7）的不定根總數、節部不定根總長度和總表面積、節間處不定根的總體積、根系干質量、葉片數、莖葉干質量、匍匐莖直徑和長度都顯著高于其他處理（0.05），這些指標隨著外植體節下部分莖段長度的增加呈現出遞增的趨勢。外植體節下部莖段長0.1 cm時，節間處不發生不定根；外植體節下部莖段長0.5，1，1.5 cm處理中，節間處不定根的總體積存在顯著差異（0.05），但在數量上沒有顯著差異（>0.05）（表3)，節間處不定根沒有發現膨大現象。由此可見，空心蓮子草節下部分長度對其根系和莖葉部分生長具有重要影響。

2.5 外植體節下部分的扦插深度對空心蓮子草的生長影響

節下部長度為1.5 cm的外植體，當接入培養基的深度為1.4 cm的時候（A7），節部不定根總長度和總表面積、根系干質量、葉片數、莖葉干質量、匍匐莖的直徑和長度顯著高于接種深度為0.5 cm處理（A9）（0.05），而根冠比則顯著降低（0.05）（表4）。這說明，空心蓮子草外植體扦插深度較深時，有利于其根系和地上部分生長。

表3 空心蓮子草外植體節下部分莖段的長度對其生長的影響（70 d）

表中數據為平均數±誤差，同行后的不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（<0.05）

表4 空心蓮子草外植體節下部分的接種深度對其生長的影響（70 d）

表中數據為平均數±誤差，同列后的不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（<0.05）

當外植體繼續生長的80 d后，即實驗處理150 d后觀察，發現外植體生出的側枝上的節間也會產生不定根，不定根出現明顯的膨大現象（圖2A），在接種深度為0.5 cm的處理中（A9），外植體節部和節間處產生的不定根均具有明顯的膨大現象（圖2B）。

A為A8處理生長150 d后根系生長情況，節間處不定根明顯膨大；B為A9處理生長150 d后根系生長情況，節處和節間處不定根均存在明顯的膨大現象

3 討論與結論

綜上所述實驗結果，空心蓮子草莖段比較理想的組培條件為：帶1節長度為4 cm的去葉空心蓮子草莖段，使用體積分數75%酒精浸泡1 min，0.1%升汞浸泡6 min消毒，在MS培養基中連續繼代培養，采用第3代無菌苗的莖段作為外植體，在含有普通瓊脂的MS培養基（鉀離子濃度降至標準培養基60%，含硝酸銨1 971 mg/L，硝酸鉀1 090 mg/L）條件下，節下部長度為1.5 cm帶節外植體正向扦插深度為1.4 cm時，可以獲得生長良好的空心蓮子草植株。

已有文獻[6,12-13]認為，空心蓮子草莖段不定根是從節部發出，實驗中，除外植體的節下部莖段長度為0.1 cm和培養基中外植體接種方向為倒插處理外，其他處理中均發現外植體的下部截口上方的莖段能夠不經過愈傷組織誘導直接生長出不定根，即出現節間生根現象，節間生根一般早于節部生根。這表明空心蓮子草莖段在組培條件下，具有較強的生根能力，不定根發生部位比較廣泛。

外植體培養70 d，發現有部分不定根出現膨大趨勢。繼續培養80 d（共150 d），筆者觀察到空心蓮子草不定根出現明顯膨大。這說明組培條件下，空心蓮子草具有膨大形成貯藏根的能力。因此，本實驗成功構建了研究空心蓮子草莖段不定根膨大的組織培養體系，為進一步在組培條件下開展空心蓮子草貯藏根的形成機理提供依據。

植物的根系生長會受到內源激素的影響。內源激素主要由植物的根尖、莖尖和種子等組織進行合成，存在從頂部向基部的極性運輸情況[14]，有研究[15]表明植物的莖段中也存在內源激素。在實驗中，筆者觀察到外植體的側芽先伸出，然后再產生不定根；倒插時節間發生不定根，不帶節外植體的節間處也能生出不定根。這些現象可能與內源激素存在一定關系。空心蓮子草幼莖的莖尖能夠合成內源激素并將其進行極性運輸促使外植體節下部莖段生出不定根，除此之外，空心蓮子草的不帶節莖段中可能也含有內源激素，從而誘導空心蓮子草的節間和節處能夠發生不定根。

在盆栽育苗實驗中，Dong等[16-17]認為空心蓮子草節間長度的增加顯著提高了植株的存活率且有利于地上部分的生長（生物量、莖長和葉片數）。組培條件下，也發現外植體節下部長度能顯著影響幼苗的生長。一定范圍內，節下部越長，越有利于空心蓮子草幼苗的生長。其原因可能是空心蓮子草莖段也是一個重要的貯藏器官[17-18]，可以儲存可溶性碳水化合物和蛋白質[19-20]等營養物質，有利于幼苗的生長。

空心蓮子草在組培實驗上的成功有助于進一步對其從生理方向進行研究。筆者發現節間處生根現象在空心蓮子草中較為普遍，這一發現有助于揭曉空心蓮子草的入侵機理，在日后的防治中能夠更加精準地對其進行防控。

[1] 呂潔杰, 農壽千. 海南省外來入侵植物空心蓮子草的分布和生境特征[J]. 熱帶林業, 2020, 48(4): 13-19.

[2] TANVEER A, ALI H H, MANALIL S, et al. Eco-biology and management of alligator weed [(Mart.) Griseb]: a Review[J]. Wetlands, 2018, 38(6): 1067-1079.

[3] 林金成, 強勝. 空心蓮子草營養繁殖特性研究[J]. 上海農業學報, 2004, 20(4): 96-101.

[4] 陳燕麗, 陳中義. 空心蓮子草入侵控制的生態學研究進展[J]. 湖北農業科學, 2010, 49(9): 2260-2263.

[5] KAY S H, HALLER W T. Evidence for the existence of distinct alligator weed biotype[J]. Journal of aquatic plant management, 1982, 20(1): 37-41.

[6] 陳燕麗, 陳中義. 陸生型空心蓮子草根的生長動態研究[J]. 江西農業學報, 2011, 23(2): 111-114.

[7] 蘆旭然, 李華成, 陳中義. 水分與基質組合生境對空心蓮子草不定根誘導形成貯藏根的影響[J]. 江蘇農業科學, 2018, 46(19): 103-106.

[8] 汪婷, 張霞, 周存宇, 等. 入侵植物水花生解剖學和組織化學染色研究[J]. 廣西植物, 2021, 41(1): 144-156.

[9] 蘆旭然, 楊霞, 陳中義. 外施生長素對陸生型空心蓮子草不定根生長發育的影響[J]. 草業科學, 2018, 35(12): 2951-2959.

[10] 陳中義, 鄒云勝, 陳燕麗, 等. 空心蓮子草宿根片斷化程度及埋藏深度對其萌芽和幼苗生長的影響[J]. 安徽農業科學, 2010, 38(32): 18190-18192.

[11] SHEKHAWAT M S, MANOKARI M, REVATHI J. In vitro propagation, micromorphological studies and ex vitro rooting of(Mart.) Griseb: an important aquatic plant[J]. Aquaculture international, 2016, 25(1): 423-435.

[12] 孫永艷, 桑曉清, 張利平, 等. 空心蓮子草的研究進展[J]. 廣東農業科學, 2011, 38(13): 73-77.

[13] BURGIN S, NORRIS A. Alligator weed () in New South Wales, Australia: a status report[J]. Weed biology and management, 2008, 8(4): 284-290.

[14] 段娜, 賈玉奎, 徐軍, 等. 植物內源激素研究進展[J]. 中國農學通報, 2015, 31(2): 159-165.

[15] 董寧光. 楊樹嫩莖生根機理及調控激素的組織細胞原位分析[D]. 北京：北京林業大學, 2012.

[16] DONG B C, ZHANG M X, ALPERT P, et al. Effects of orientation on survival and growth of small fragments of the invasive, clonal plant[J]. PLoS one, 2010, 5(10): e13631.

[17] DONG B C, YU G L, GUO W, et al. How internode length, position and presence of leaves affect survival and growth ofafter fragmentation?[J]. Evolutionary ecology, 2010, 24(6): 1447-1461.

[18] STUEFER J F, HUBER H. The role of stolon internodes for ramet survival after clone fragmentation in[J]. Ecol lett, 1999, 2: 135-139.

[19] SUZUKI J I, STUEFER J E. On the ecological and evolutionary significance of storage in clonal plant[J]. Plant spec biol, 1999, 14: 11-17.

[20] CORRE N, BOUCHART V, OURRY A, et al. Mobilization of nitrogen reserves during regrowth of defoliatedL. and identification of potential vegetative storage proteins[J]. Exp bot, 1996, 47: 1111-1118.

Root Development of Stolon Segment ofin Tissue Culture

GUO Yaqi, YAO Zhen, CHEN Zhongyi*

(College of Horticulture and Gardening, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China)

Alternanthera philoxeroides is a worldwide malignant invasive weed. The formation of storage roots plays an important role in its invasion. It is helpful to study the occurrence and expansion of adventitious roots for prevention and control.In this paper, a tissue culture system was used to conduct aseptic culture of the stolon segments of.The culture conditions mainly considered the type of medium coagulant, whether the explants had nodes or not, the length of stem segments under explants nodes, the cutting method and cutting depth of explants.The ideal tissue culture conditions for the stem segments ofwere as follows: with a 4 cm long stem segment and have one node, soaked in 75% alcohol for 1 min, soaked in 0.1% HgCl for 6 min for disinfection, continuously subcultured in MS medium, and the stem segments of the third generation aseptic seedlings were used as explants, in the condition of MS medium containing common agar (potassium ion concentration reduced to 60% of the standard medium), when the length of the lower part of the node was 1.5cm and the forward cutting depth of the explant with node was 1.4cm, the good growth ofcould be obtained.It was found that adventitious roots could grow directly from the stem segment above the lower section of explants without callus induction, that is, the phenomenon of internode rooting appeared. When the explants were cultured for 70 days, it was found that some adventitious roots expanded. After cultured for 80 days, the adventitious roots of Alternanthera philoxeroides were obviously expanded.In this study, the tissue culture system of adventitious root expansion of stem segments of Alternanthera philoxeroides was successfully constructed, which laid a foundation for further research on the formation mechanism of storage roots of Alternanthera philoxeroides under the condition of tissue culture.

Alternanthera philoxeroides; stolon; adventitious roots; tissue culture

S451

A

2095-3704（2021）02-0212-07

2021-05-03

2021-05-25

湖北省自然科學基金項目（2013CFB391）和濕地生態與農業利用教育部工程研究中心開放基金項目（KFT201907）

郭雅琪（1997—），女，碩士生，主要從事植物入侵生態學研究，1207410179@qq.com；*通信作者：陳中義，教授，博士，czy@yangtzeu.edu.cn。

郭雅琪, 姚振, 陳中義. 組培條件下空心蓮子草匍匐莖段根系發育的研究[J]. 生物災害科學, 2021, 44(2): 212-218.