溶藻弧菌gr 基因缺失株構建及其生物學特性

馮建儒，范晨龍，丁 燏

（廣東海洋大學水產學院//廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室//水產經濟動物病害防控廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）隸屬于弧菌科（Vibrionaceae）弧菌屬（Vibrio），為嗜鹽嗜溫性、兼性厭氧的革蘭陰性菌[1-2]，廣泛分布于海洋環境和海洋生物中，可感染魚、蝦、貝等海水養殖動物[3-5]。近年來，隨著養殖環境的不斷惡化，由溶藻弧菌引起的暴發性弧菌病呈不斷上升趨勢[6-7]，給海水養殖業造成重大的經濟損失[8]。

在生物系統中，干旱、低溫、高溫、鹽脅迫、抗生素、重金屬和紫外輻射等各種環境脅迫可誘發活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的過量產生，對細胞造成嚴重損傷。生物細胞內的重要氧化劑谷胱甘肽（GSH），可有效抵抗ROS 對細胞的傷害，維持細胞內較穩定的氧化還原平衡狀態[9-10]。谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）是谷胱甘肽抗氧化系統中主要抗氧化酶之一，廣泛分布于原核生物和真核生物中[11]。在還原型輔酶NADPH 作用下，GR 催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）轉化為還原型谷胱甘肽，為有效清除細菌細胞內ROS 提供還原力，從而保護細胞免受傷害，是在氧化應激期間維持細胞氧化還原狀態的關鍵酶[12-13]。因此，GR 在氧化應激[14-15]、冷應激[16]、鹽脅迫[17]和金屬離子耐受性[12]等應激反應中有重要作用。呂潔婷等[18]研究發現，單核細胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）gr 基因缺失后，其運動能力、感染宿主能力及抗氧化應激等增強。龐歡瑛等[19]將與GR 同屬于黃素蛋白氧化還原酶家族的二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLDH）的dldh 基因敲除后，溶藻弧菌的泳動能力、生物膜形成能力、生長和胞外蛋白酶活性等均減弱。有關溶藻弧菌gr 基因缺失株的生物學特性未見報道。本研究通過同源重組技術和Overlap PCR 等分子生物學手段構建溶藻弧菌gr 基因缺失株，比較其與野生株HY9901 的生物學差異，為防治溶藻弧菌病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 溶藻弧菌HY9901（V.alginolyticus）、大腸桿菌DH5α（Escherichia coli DH5α）、大腸桿菌β2163（E.coli β2163）均保存于廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室（下稱“本實驗室”）。

1.1.2質粒 自殺質粒pLP12（含氯霉素Cm）取自本實驗室。

1.1.3主要試劑和引物 LB 液體培養基，酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L 及NaCl 30 g/L；LB 固體培養基，酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 30 g/L 及瓊脂粉15 g/L；氯霉素（Cm），生工生物工程（上海）股份有限公司；切膠回收純化和質粒提取試劑盒，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；細菌總DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；pMD-18T 克隆載體，Takara 公司；藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司；PrimerSTAR Max，Takara 公司；引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 溶藻弧菌gr 基因的缺失株構建的引物Table 1 Construction of primers for deletion of gr gene of V.alginolyticus

1.2 方法

1.2.1缺失株△gr 的構建 以gr-MF1/gr-MR1 擴增得 GR 上游同源臂 A 片段 612bp；以gr-MF2/gr-MR2 擴增得GR 下游同源臂B 片段577 bp，純化A、B 片段，經Overlap PCR 擴增后，獲得1 189 bp 融合AB 片段。將純化的AB 片段與自殺質粒pLP12（Cm+）連接，得重組質粒，然后轉化至大腸桿菌DH5α 感受態細胞，涂布于LB 平板（含Cm 20 μg/mL，D-葡萄糖3 g/L）。用pLP-UF/pLP-UR 篩選AB 插入的重組克隆，陽性克隆經純化、擴大培養后，提取質粒pLP12(Cm+)-gr，轉化至大腸桿菌β2163，培養3 h，涂布于LB 平板（含Cm 20 μg/mL，二氨基庚二酸 (Diaminopimelic acid,DAP) 0.3 mmol/L，D-葡萄糖3 g/L），挑取陽性克隆，劃線純化培養。分別將大腸桿菌β2163[pLP12（Cm+）-gr] 與溶藻弧菌培養24 h，分別取400 μL 供體菌和800 μL 受體菌，混勻，離心，去上清，以LB 培養基重懸，重復1 次，滴入LB平板 (含DAP 0.3 mmol/L，D-葡萄糖3 g/L)，于37 ℃下倒置培養6 h。以1 mL LB 重懸，稀釋后取100 μL 涂布于LB 平板（含Cm 20 μg/mL，D-葡萄糖 3 g/L），挑取單克隆，液體培養，以gr-TF/PLP-UTR 對克隆進行檢測。挑取陽性克隆，稀釋，涂布于LB 平板（含L-阿拉伯糖4 g/L），于30 ℃下培養24 h，挑取平板上的克隆，以引物gr-TF/gr-TR 進行檢測，并遞交PCR 產物測序驗證，獲得△gr 缺失株，穩定遺傳 30 代后，置于-80 ℃下保存。以上實驗步驟根據表1 設計的對應引物進行菌落PCR 鑒定并測序，反應體系：DNA 模板1 μL，PrimerSTAR Max 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，X ℃ 20 s，72 ℃ Y s，72 ℃ 7 min，30 個循環。

1.2.2缺失株△gr 的驗證 采用RNA 試劑盒分別提取溶藻弧菌HY9901 野生株和缺失株△gr 的RNA，并反轉錄為cDNA。以cDNA 作為模板，利用一對特異性引物（gr-F/gr-R）進行PCR 擴增，選取野生株HY9901 作為陽性對照，用10 mg/mL 凝膠電泳檢測。

1.2.3缺失株△gr 遺傳穩定性的測定 溶藻弧菌缺失株△gr 菌液和新鮮TSB 培養基按體積比1∶100的比例連續傳30 代后，用引物gr-TF/gr-TR 對片段進行擴增，檢測缺失株△gr 的遺傳穩定性。

1.2.4生長曲線繪制 分別將溶藻弧菌野生株HY9901 和缺失株△gr 接種于新鮮TSB 中，培養8 h以上，將光密度D(600 nm) 調至約0.5，以1∶100稀釋培養，每2 h 測定波長600 nm 下的光密度值，繪制兩株菌的生長曲線。重復3 次。

1.2.5抗生素藥敏實驗 將200 μL、D(600 nm) 值約為0.5 的菌液涂布于TSB 營養瓊脂平板上，放置干燥，以無菌操作將藥敏紙片放置于TSB 平板，輕輕按壓，貼標簽，置于恒溫生化培養箱培養24 h 后觀察。

1.2.6生物膜的測定 分別用適量新鮮TSB 洗脫在TSA 平板上培養的野生株和缺失株，將菌液D(600 nm) 調至0.5，再分別用新鮮的TSB 稀釋20倍，轉至96 孔板中，28 ℃下靜置24 h；用無菌ddH2O 洗滌3 次，倒置晾干；用甲醇固定20 min，室溫晾干，倒置30 min，在室溫下加入結晶紫染液染色15 min，用自來水沖洗至澄清后自然晾干；最后加入體積分數95%乙醇，自然放置30 min，用酶標儀測定波長570 nm 下的光密度值。重復3 次。

1.2.7細菌泳動實驗 分別挑取野生株和缺失株的單菌落，穿刺接種于3 g/L 的瓊脂TSA 平板中，放置于28 ℃恒溫培養箱中培養24 h 以上，測量兩菌株的泳動圈直徑。重復3 次。

1.2.8胞外蛋白酶活性的測定 分別將培養12 h以上的野生株和缺失株涂布于鋪有玻璃紙的TSA平板上，放置于28 ℃下培養18 h，加入適量磷酸鹽緩沖液（PBS）洗脫，以4 ℃、8 000 g 條件離心30 min，收集上清，用孔徑0.22 μm 濾膜過濾，所得野生株和缺失株的胞外蛋白酶產物保存于4 ℃。分別取100 μL 野生株和缺失株的胞外蛋白酶與100 μL 偶氮酪蛋白溶液混合均勻，用Tris-HCl 緩沖液稀釋至500 μL，置于37 ℃下孵育30 min。加入適量的100 g/L 三氯乙酸終止反應，以10 000 g 離心10 min，收集上清，加入NaOH 溶液顯色，測定在波長442 nm 下的光密度值，以煮沸的滅活樣品作為空白對照組。重復3 次。

2 結果

2.1 缺失株△gr 的構建

以引物gr-TF/gr-TR 進行檢測，以野生型為對照，突變型經擴增得到1 343 bp 片段，野生型擴增片段長2 648 bp（圖1）。經測序，結果證實溶藻弧菌gr 缺失株構建成功。

圖1 溶藻弧菌gr 缺失突變檢測Fig.1 Detection of gr mutant

2.2 缺失株△gr 的驗證

圖2(A)表明，已構建的缺失株△gr 經cDNA 驗證，提取得到的RNA 完整。以反轉錄得到的cDNA為模板進行 PCR 擴增驗證，結果表明野生株HY9901 在1 400 bp 處左右有特異性條帶，其他的不存在條帶 [圖2(B)]，證明已成功構建了溶藻弧菌HY9901 的缺失株△gr。

圖2 缺失株△gr 的驗證Fig.2 Verification of mutant strain △gr

2.3 缺失株△gr 遺傳穩定性

圖3 表明，缺失株△gr 經連續傳30 代后，仍可準確擴增出gr 基因上下游融合片段，表明所構建缺失株△gr 的遺傳信息可在子代中穩定地傳遞。

圖3 溶藻弧菌缺失株△gr 穩定性檢驗Fig.3 Hereditary stability of mutant strain △gr

2.4 生長曲線

在 TSB 培養基中培養的溶藻弧菌野生株HY9901 和缺失株△gr 所得到的生長曲線見圖4。圖4 可見，缺失株△gr 生長情況與HY9901 一致，即敲除gr 基因對溶藻弧菌生長無明顯影響。

圖4 溶藻弧菌野生株HY9901 和缺失株△gr 的生長曲線Fig.4 Growth curve of strain HY9901and △gr

2.5 藥敏實驗

溶藻弧菌缺失株△gr 對四環素、克林霉素和呋喃唑酮等藥敏實驗結果如表2 所示。表2 可見，缺失株△gr 對四環素、克林霉素和呋喃唑酮等耐藥性減弱。

表2 藥敏實驗抑菌圈直徑Table 2 Diameters of bacterial inhibition zone in drug sensitive tests

2.6 生物膜

圖5 可見，培養24 h 的野生株和缺失株的生物膜形成能力差異顯著（P＜0.05），與野生株相比，缺失株△gr 的生物膜顯著增厚。

圖5 溶藻弧菌野生株HY9901和缺失株△gr生物膜形成能力Fig.5 Biofilm formation of strain HY9901and △gr

2.7 泳動能力

培養12 h 后野生株和缺失株的泳動能力如圖6所示。結果表明gr 基因的缺失顯著減弱了溶藻弧菌的泳動能力（P＜0.01）。

圖6 溶藻弧菌野生株HY9901 和缺失株△gr 的泳動能力Fig.6 The swarming motility of strain HY9901 and △gr

2.8 胞外蛋白酶活性

胞外蛋白酶作為細菌釋放于環境中的代謝物，包含有酪蛋白酶、溶血素、明膠酶、淀粉酶和鐵載體等多種活性物質，是致病菌的主要毒力因子之一。與野生株相比，缺失株△gr 的胞外蛋白酶活性顯著降低（P＜0.01）（圖7）。

圖7 溶藻弧菌野生株HY9901和缺失株△gr胞外蛋白酶活性Fig.7 ECPase activity of strain HY9901 and △gr

3 討論

在生物體氧化還原代謝的過程中，GR 為一種極其重要的抗氧化酶，對清除細胞內ROS，維持細胞內穩定的氧化還原狀態有重要作用[20]。學界正不斷深入研究GR 在生物體發育、疾病防御、抗非生物脅迫及氧化應激等方面的作用。

為更好了解gr 基因在溶藻弧菌抗氧化中的作用，本研究敲除溶藻弧菌gr 基因，缺失株△gr 遺傳信息可在子代中穩定地傳遞。與野生株相比，缺失株△gr 的生長趨勢變化不大，這可能是因為gr 基因的缺失對其攝取與消化營養物質幾無影響，也可能因為二菌株受環境脅迫較少。

抗生素可抑制細菌生長繁殖或殺死細菌，多由細菌自身合成的化學物質，可殺死周圍環境的其他微生物來維持細菌體內平衡[21]，通過阻礙細菌細胞壁合成、增強細菌細胞膜通透性、抑制蛋白質合成、阻礙細菌DNA 復制和轉錄而發揮抗菌作用。目前，使用抗生素仍是控制弧菌病的主要手段，但濫用抗生素會導致耐藥菌的出現[22-26]。研究表明，抗生素刺激細菌會產生氧化應激，使細胞內產生大量的活性氧和自由基，破壞細胞內的氧化還原平衡，引起細胞的損傷[27-28]。因此，本研究中，溶藻弧菌在敲除gr 基因后，其對四環素、克林霉素和呋喃唑酮等敏感性提高，可能由缺失株的清除活性氧能力減弱所致。

生物膜的形成是微生物之間通過協同作用形成的一種生存策略[29]，也是微生物適應復雜多變的生存環境和抵御不良環境因素的重要手段[30-32]。研究表明，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的生物膜形成與活性氧（ROS）的增加相關[33]。本研究中，缺失株△gr 的生物膜出現增厚現象，推測溶藻弧菌在敲除gr 基因后，細菌內的氧化應激水平提高，使生物膜形成得以進一步增強，從而抵御不良的環境因素。

鞭毛是細菌表面重要的附屬結構，對其泳動能力有直接影響[34-35]。本研究中，與野生株相比，缺失株△gr 的泳動能力顯著減弱，推測gr 基因的缺失可能對鞭毛的產生或運動造成一定的影響，進而減弱缺失株的泳動能力，但泳動能力變化機制還需進一步研究。

細菌的毒力因子與其致病性有緊密的關系，胞外蛋白酶是細菌主要的毒力因子，不僅通過消化為細菌的生長供應必要的營養物質，還可直接對宿主的免疫防御系統造成破壞[36]。本研究中，gr 基因的缺失使溶藻弧菌的胞外蛋白酶活性顯著降低，缺失株△gr 毒力可能減弱，推測gr 基因可能在其胞外蛋白酶的分泌或活性等方面有一定作用。

4 結論

本研究成功構建gr 基因缺失株△gr。與溶藻弧菌野生株HY9901 比較，該缺失株對四環素、克林霉素和呋喃唑酮等耐藥性減弱，生物膜形成能力顯著增強，胞外蛋白酶活性顯著降低，泳動能力顯著減弱。因此，GR 在溶藻弧菌的毒力、生物膜形成、藥物敏感性、泳動等方面有重要作用。