苓桂氣化方對(duì)射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭模型大鼠心臟功能及糖脂代謝的影響*

熊雙 ，劉劍剛 ，董國(guó)菊 ，馬玲 ，唐榕 ，成曄

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院心血管病研究所，國(guó)家中醫(yī)臨床心血管病醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100091；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院研究生院，北京 100700）

射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭（HFpEF）是一個(gè)與年齡、高血壓病、糖尿病、血脂代謝異常等多種危險(xiǎn)因素和臨床疾病相關(guān)的復(fù)雜臨床綜合征，發(fā)病率逐年上升[1]，病死率與射血分?jǐn)?shù)減低性心力衰竭（HFrEF）相似[2]。傳統(tǒng)藥物血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β受體阻滯劑等不能改善HFpEF患者的預(yù)后及降低病死率[3]。目前臨床尚無對(duì)癥的藥物應(yīng)用于HFpEF的治療。中醫(yī)認(rèn)為心力衰竭屬于本虛標(biāo)實(shí)之證，HFpEF及HFrEF同屬于“氣虛血瘀水停”的病機(jī)范疇，課題組基于前期研究認(rèn)為HFpEF主要是水飲之邪盛，陽氣被遏，所致氣化不利，其氣虛程度較HFrEF輕。氣化學(xué)說源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，經(jīng)張仲景創(chuàng)立，本研究苓桂氣化方是課題組應(yīng)用氣化學(xué)說具體運(yùn)用的體現(xiàn)。

前期有報(bào)道苓桂術(shù)甘湯可提高心力衰竭患者左室射血分?jǐn)?shù)、減小左室舒張末期內(nèi)徑、增加患者6 min步行距離[4]，近年來，也有部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)苓桂術(shù)甘湯對(duì)HFpEF也有較好的治療效果[5]。課題組通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)苓桂術(shù)甘湯治療HFpEF最常見的臨床配伍是加活血藥，以赤芍為代表。苓桂氣化方即是由茯苓、桂枝、白術(shù)、赤芍4味藥物組成，通過調(diào)暢三焦，助陽化氣，使飲消瘀散。在此基礎(chǔ)上，本研究觀察其防治HFpEF的藥理作用，并通過糖脂代謝、胰島素抵抗等多方面觀察中藥干預(yù)的作用靶點(diǎn)，旨在為HFpEF的臨床防治工作提供更多藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 自發(fā)性高血壓大鼠（SHR），雌雄各半，SPF 級(jí)，60 只，14 周齡，體質(zhì)量 180～260 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。相同遺傳背景的WistarKyoto（WKY）種大鼠，雌雄各半，SPF 級(jí)，10 只，14周齡，體質(zhì)量180～260 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

屏障級(jí)動(dòng)物室飼養(yǎng)，定時(shí)給予全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料喂食，大鼠維持飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，生產(chǎn)合格證：京飼證（2014）06054。室溫22～25℃，濕度 50%～70%，光照 12 h，黑暗 12 h，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。高脂高糖飼料（10%豬油、10%蔗糖、2.0%膽固醇、0.5%膽鹽、77.5%基礎(chǔ)飼料）的制作由北京科澳協(xié)力飼料有限公司完成，生產(chǎn)合格證：京飼證（2014）06054。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 苓桂氣化方由茯苓、桂枝、白術(shù)和赤芍組成，浸膏，含生藥2.28 g/g，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院制劑室提供。沙庫(kù)巴曲頡沙坦鈉片（商品名：諾欣妥），50 mg/片，批號(hào)：H20170344，由Novartis Pharma Schweiz AG（瑞士）制藥公司生產(chǎn)。

鏈脲佐菌素[STZ，S0130，Merck Millipore（德國(guó)）公司生產(chǎn)]，血糖（GLU）試劑盒（批號(hào) 814253），高密度脂蛋白（HDL-C）試劑盒（批號(hào)384041），低密度脂蛋白（LDL-C）試劑盒（批號(hào)372984），三酰甘油（TG）試劑盒（批號(hào)442499），總膽固醇（TCHO）試劑盒（批號(hào)439074），以上試劑盒均由羅氏（上海）診斷有限公司提供。

糖化血清蛋白（GSP）試劑盒（批號(hào)20191012），胰島素（INS）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號(hào)20191120），胰高血糖素（PG）ELISA 試劑盒（批號(hào)20191015），C肽（C-P）ELISA試劑盒（批號(hào)20191015），瘦素（LEP）ELISA 試劑盒（批號(hào) 20191018），以上試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。心鈉素（ANP）ELISA試劑盒（批號(hào)20190915），B型腦尿鈉肽（BNP）ELISA試劑盒（批號(hào)20190915），由北京欣博盛生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 HDI 5000型，M型超聲心動(dòng)圖超聲診斷儀[高頻線陣，7～15 MHz，飛利浦（中國(guó)）投資有限公司]，CL15-7型，超聲探頭[飛利浦（中國(guó)）投資有限公司]，ROCHE/E601型，全自動(dòng)生化分析儀[羅氏（瑞士）儀器有限公司生產(chǎn)]，DR-200BS型，全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司），T18 Basic型，高速分散器（德國(guó)IKA公司），3-18K型，高速低溫離心機(jī)（美國(guó)SIGMA公司），DpxView Pro型，顯微彩色圖象處理系統(tǒng)（丹麥DeltaPix公司），快速血糖（ACCU-CHEK羅康全活力型血糖儀[羅氏（Roche德國(guó)）診斷有限公司]。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大鼠HFpEF模型的制作 50只SHR大鼠持續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)2周后，腹腔注射STZ（25mg/kg體質(zhì)量），72 h血糖可穩(wěn)定升高，并伴有三多癥狀，制作糖尿病模型，快速血糖（ACCU-CHEK羅康全活力型血糖儀，羅氏/Roche（德國(guó)）診斷有限公司生產(chǎn)）檢測(cè)在11.1 mmol/L以上可作為糖尿病成功模型選用。造模時(shí)STZ應(yīng)新鮮配制，血糖值升高不符合要求的動(dòng)物應(yīng)剔除。高脂飲食誘導(dǎo)加低劑量STZ建立HFpEF心力衰竭大鼠模型[6-7]，高脂高糖飼料（10%豬油、10%蔗糖、2.0%膽固醇、0.5%膽鹽、77.5%基礎(chǔ)飼料）喂食誘發(fā)胰島素抵抗[8]。

糖尿病、血壓升高、血脂升高等均為HFpEF的危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合動(dòng)物模型更能貼近臨床，從而模擬臨床疾病的發(fā)病過程。SHR大鼠是目前公認(rèn)最接近人類原發(fā)性高血壓病的動(dòng)物模型[9]，也是建立HFpEF的常用模型，16周齡的SHR大鼠即可以出現(xiàn)高血壓病的相關(guān)并發(fā)癥，同時(shí)其心臟結(jié)構(gòu)的改變也能在心臟超聲上有所體現(xiàn)[6-7]。Zucker自發(fā)性高血壓肥胖大鼠是雄性自發(fā)性高血壓心力衰竭大鼠和雌性肥胖糖尿病大鼠的雜交后代，其從10周齡開始出現(xiàn)高血壓和左室肥厚，14～18周齡即可出現(xiàn)嚴(yán)重的舒張功能障礙，左房增大，20周齡則表現(xiàn)為HFpEF及肺淤血[10]。高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周，負(fù)荷小劑量STZ腹腔注射，再繼續(xù)喂養(yǎng)6周即可出現(xiàn)HFpEF的病理特點(diǎn)[7]。課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)制作了負(fù)荷高壓高脂、糖尿病的HFpEF大鼠模型，其超聲表現(xiàn)復(fù)合HFpEF的病理特點(diǎn)，且負(fù)荷模型明顯縮短了造模時(shí)間。

1.4.2 模型大鼠分組 HFpEF模型存活大鼠，隨機(jī)分為SHR糖尿病模型組（HFpEF組，注射STZ），陽性藥物對(duì)照組（諾欣妥組，沙庫(kù)巴曲頡沙坦鈉片18 mg/kg體質(zhì)量，下同），苓桂氣化方低劑量組（苓桂低劑量組，生藥4.05 g/kg），苓桂氣化方高劑量組（苓桂高劑量組，生藥8.10 g/kg），余10只SHR為SHR對(duì)照組（SHR組，注射等量生理鹽水），相同遺傳背景的WKY大鼠作為空白對(duì)照組（WKY組，灌胃等量的蒸餾水），每組10只大鼠，WKY組、SHR組和HFpEF組大鼠灌胃等量蒸餾水，除WKY組、SHR組喂食普通飼料，其余各組繼續(xù)喂食高脂飼料。灌胃給藥8周后，第2天空腹，正常飲水，2%戊巴比妥鈉水溶液（2 mL/kg體質(zhì)量）麻醉心臟超聲學(xué)檢測(cè)，后腹主動(dòng)脈取血，病理組織取材進(jìn)行相應(yīng)的指標(biāo)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和北京市《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》規(guī)定的動(dòng)物倫理學(xué)要求并通過醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審批（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理批準(zhǔn)號(hào)：2021XLC008-3）。

1.4.3 心臟超聲學(xué)檢測(cè) 灌胃結(jié)束后，第2天大鼠空腹12 h，麻醉后固定于手術(shù)板上，用小動(dòng)物剃毛器將大鼠胸部的體毛清除干凈，仰臥位固定于手術(shù)板上行心臟超聲檢查。7～15 MHz線陣式探頭[型號(hào)：CL15-7，飛利浦（中國(guó)）投資有限公司生產(chǎn)]置于其左胸，在取得滿意的胸骨旁左心室短軸二維圖像后，高頻線陣超聲診斷儀[型號(hào)：HDI 5000，飛利浦（中國(guó)）投資有限公司生產(chǎn)]在乳頭肌水平將M型取樣線垂直于室間隔和心房及左心室獲得M型超聲心動(dòng)圖。

同一心動(dòng)周期的心臟超聲功能指標(biāo)包括舒張?jiān)缙诙獍暄魉俣龋‥）；二尖瓣心房收縮期最大血流（A）；舒張?jiān)缙诙獍戥h(huán)心肌運(yùn)動(dòng)速度（E’）；左心房射血分?jǐn)?shù)（LAEF）；左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。測(cè)量時(shí)每組原始數(shù)據(jù)連續(xù)測(cè)定3個(gè)心動(dòng)周期的平均值，超聲檢查的操作均由不知道大鼠分組情況的兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲科專科醫(yī)生完成。

1.4.4 血脂和血糖指標(biāo)檢測(cè) 心臟超聲結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血，分離血清備用。HDL-C、LDL-C采用酶比色法；TG采用比色法；TCHO采用酶比色法。GLU采用已糖激酶法，GSP采用終點(diǎn)法檢測(cè)。

1.4.5 胰島素類和胰島素指標(biāo)測(cè)定 FINS采用ELISA 雙抗夾心法檢測(cè)，LP、PG、C-P、ANP、BNP 分別采用ELISA競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)，操作過程嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。

1.4.6 心臟組織處理方法 取血后大鼠，快速取出心臟組織，按隨機(jī)號(hào)將5只放入10%中性甲醛溶液固定，取大鼠心臟的心房組織石蠟包埋，切片（4～6μm），蘇木精-伊紅（HE）染色，封片，顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性時(shí)組間比較采用單因素方差分析（ONEWAY ANOVA），組間多重比較采用LSD法。不滿足方差齊性用Welch法對(duì)F值進(jìn)行校正，多重比較用Dunnett’s T3 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苓桂氣化方對(duì)HFpEF模型大鼠心臟超聲功能的影響 SHR大鼠飼養(yǎng)16周后造成HFpEF模型，結(jié)合高脂飼料飲食，E、A發(fā)生變化。和WKY組比較，HFpEF 組的 E、E/A 及 E/E’比值顯著增加（P＜0.01），E’及 LAEF 明顯降低（P＜0.01）。服用苓桂氣化方后，和HFpEF組比較，諾欣妥和苓桂氣化方高、低劑量組對(duì) E、E/A 及 E/E’比值有顯著的改善作用（P＜0.01），諾欣妥組對(duì)LAEF有顯著提高作用（P＜0.05）。結(jié)果見表 1、圖 1。

表1 苓桂氣化方對(duì)大鼠心臟超聲功能的影響（±s）Tab.1 Effect of Linggui Qihua Fang on echocardiography function in rats（±s）

表1 苓桂氣化方對(duì)大鼠心臟超聲功能的影響（±s）Tab.1 Effect of Linggui Qihua Fang on echocardiography function in rats（±s）

注：與 WKY 組比較，*P＜0.01；與 HFpEF 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)劑量E（m/s）A（m/s）E'（m/s）E/A比值E/E’比值LAEF（%）LVEF（%）WKY 組 10 - 0.77±0.19 0.43±0.11 0.05±0.02 1.91±0.45 18.33±9.12 57.50±9.10 78.80±8.23 SHR 組 9 - 1.09±0.22* 0.44±0.11 0.05±0.01 2.47±0.69 24.60±14.42 51.57±8.46 83.50±5.48 HFpEF 組 10 - 1.13±0.19* 0.34±0.10 0.03±0.01* 3.35±0.92* 48.88±16.24* 45.60±6.17* 77.10±6.28諾欣妥組 8 15 mg/kg 0.66±0.18## 0.34±0.09 0.04±0.01 1.91±0.57## 21.75±6.65## 53.00±6.09# 79.00±4.72苓桂高劑量組 10 8.10 g/kg 生藥 0.80±0.28## 0.32±0.08 0.03±0.01 2.14±0.62## 30.80±8.08# 51.10±5.63 80.00±3.33苓桂低劑量組 9 4.05 g/kg 生藥 0.78±0.17## 0.36±0.10 0.03±0.01# 2.33±0.80# 24.42±5.95## 48.33±8.87 75.33±9.33

圖1 苓桂氣化方對(duì)大鼠心臟超聲功能的影響Fig.1 Effect of Linggui Qihua Fang on echocardiography function in rats

2.2 苓桂氣化方對(duì)HFpEF大鼠心肌組織病理形態(tài)的影響 各組大鼠的心肌心房組織鏡下病理可見，WKY組的心房細(xì)胞核染色清晰，心肌細(xì)胞排列致密、細(xì)胞間隙較小；SHR組的心房壁組織有一定的增厚，心房腔增大，形態(tài)結(jié)構(gòu)尚正常，但細(xì)胞間隙明顯增大，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間質(zhì)纖維增多；SHR大鼠飼養(yǎng)造成HFpEF模型后，可見心房壁明顯增厚，心肌細(xì)胞排列有一定的間隙、紊亂，可見纖維斷裂，部分心肌細(xì)胞分割呈網(wǎng)篩狀。經(jīng)過藥物治療后，與HFpEF組比較，各給藥組對(duì)大鼠心房組織均有一定的改善作用，其中以苓桂高劑量組改善最明顯，心室壁厚度明顯減輕，心肌細(xì)胞體積明顯減小，細(xì)胞間隙減小，排列較為致密。見圖2。

圖2 苓桂氣化方對(duì)大鼠心肌組織病理形態(tài)的影響（HE，×300）Fig.2 Effect of Linggui Qihua Fang on myocardial pathology in rats（HE，×300）

2.3 苓桂氣化方對(duì)HFpEF大鼠血清標(biāo)記物的影響 大鼠造模后，與WKY組大鼠比較，SHR大鼠血中的ANP和 BNP 含量顯著升高（P＜0.01），注射 STZ和喂食高脂飲食后ANP和BNP持續(xù)升高（P＜0.01）。服用藥物治療后，和HFpEF組比較，苓桂低、高劑量組都有不同程度降低 ANP、BNP 含量（P＜0.05或 P＜0.01），苓桂組成一定量效關(guān)系，諾欣妥組僅見BNP水平降低（P＜0.01）。結(jié)果見表 2。

表2 苓桂氣化方對(duì)大鼠血漿ANP和BNP的影響（±s）Tab.2 Effect of Linggui Qihua Fang on plasma ANP and BNP in rats（±s）

表2 苓桂氣化方對(duì)大鼠血漿ANP和BNP的影響（±s）Tab.2 Effect of Linggui Qihua Fang on plasma ANP and BNP in rats（±s）

注：與 WKY 組比較，*P＜0.01；與 HFpEF 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量 ANP（ng/mL） BNP（pg/mL）WKY 組 10 - 0.35±0.10 12.93±3.27 SHR 組 8 - 0.57±0.18* 18.75±4.26*HFpEF 組 10 - 0.70±0.11* 22.08±3.05*諾欣妥組 9 15 mg/kg 0.60±0.11 17.71±2.48##苓桂高劑量組 9 生藥 8.10 g/kg 0.46±0.12## 17.09±3.49##苓桂低劑量組 9 生藥 4.05 g/kg 0.58±0.11# 18.81±3.22#

2.4 苓桂氣化方對(duì)HFpEF大鼠胰島素相關(guān)指標(biāo)的影響 和WKY組比較，SHR大鼠經(jīng)過16周飼養(yǎng)造成HFpEF模型后，大鼠血清胰島素相關(guān)指標(biāo)FINS、PG、C-P、LEP、GSP以及GLU等的含量都有不同程度的升高（P＜0.01）。經(jīng)過藥物治療后，和 HFpEF 組比較，諾欣妥和苓桂低、高劑量組均對(duì)大鼠INS、CP 及 LEP 有明顯的改善作用（P＜0.05 或 P＜0.01），苓桂低、高劑量組對(duì)大鼠GLU有一定的改善作用，且呈一定的量效關(guān)系（P＜0.05 或 P＜0.01），此外，苓桂高劑量組還可使大鼠GSP水平明顯降低（P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 苓桂氣化方對(duì)大鼠胰島素相關(guān)指標(biāo)的影響（±s）Tab.3 Effects of Linggui Qihua Fang on insulin related indexes in rats（±s）

表3 苓桂氣化方對(duì)大鼠胰島素相關(guān)指標(biāo)的影響（±s）Tab.3 Effects of Linggui Qihua Fang on insulin related indexes in rats（±s）

注：與 WKY 組比較，*P＜0.01；與 HFpEF 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量 FINS（μU/mL） PG（pg/mL） C-P（ng/mL） LEP（ng/mL） GSP（μmol/L） GLU（μmol/L）WKY 組 10 - 11.44±3.20 103.05±21.08 1.13±0.23 4.98±1.18 135.45±10.84 6.69±1.31 SHR 組 8 - 17.58±3.19* 120.08±25.70 2.05±0.50* 7.04±1.90* 312.17±67.82* 6.85±1.38 HFpEF 組 10 - 22.18±5.46* 161.23±21.43* 2.75±0.70* 9.30±1.42* 515.92±45.91* 17.05±3.79*諾欣妥組 9 15 mg/kg 16.99±3.22# 142.05±26.43 2.10±0.75# 6.39±2.12# 469.37±79.92 14.91±3.30苓桂高劑量組 9 生藥 8.10 g/kg 16.57±4.59## 142.18±35.05 1.57±0.56## 5.07±1.07## 435.95±40.73## 11.95±2.67##苓桂低劑量組 9 生藥 4.05 g/kg 16.28±2.91## 151.57±22.19 1.82±0.36## 5.18±1.45## 463.60±54.08 13.29±3.38#

2.5 苓桂氣化方對(duì)HFpEF大鼠血脂指標(biāo)的影響 和WKY組大鼠比較，HFpEF模型大鼠血清血脂TC、TG及 LDL-C 的含量顯著升高（P＜0.01），HDL-C 含量也有輕度升高。經(jīng)過藥物治療后，和HFpEF組比較，苓桂低、高劑量組均對(duì)大鼠TC及LDL-C有明顯的改善作用（P＜0.01）。結(jié)果見表 4。

表4 苓桂氣化方對(duì)大鼠血脂指標(biāo)的影響（±s）Tab.4 Effects of Linggui Qihua Fang on blood lipid indexes in rats（±s）mmol/L

表4 苓桂氣化方對(duì)大鼠血脂指標(biāo)的影響（±s）Tab.4 Effects of Linggui Qihua Fang on blood lipid indexes in rats（±s）mmol/L

注：與 WKY 組比較，*P＜0.01；與 HFpEF 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量 TC TG HDL-C LDL-C WKY 組 10 - 1.95±0.64 0.65±0.23 1.23±0.58 0.68±0.56 SHR 組 8 - 2.09±0.55 0.74±0.33 1.28±0.20 0.38±0.40 HFpEF 組 10 - 4.61±0.97* 2.33±0.94* 1.65±0.33 2.46±0.96*諾欣妥組 9 15 mg/kg 3.40±0.52 2.68±0.73 1.51±0.45 2.91±0.95苓桂高劑量組 9 生藥 8.10 g/kg 2.36±0.48## 1.87±0.40 1.51±0.46 1.40±0.65#苓桂低劑量組 9 生藥 4.05 g/kg 2.76±0.60## 1.98±0.81 1.61±0.34 1.06±0.93##

2.6 苓桂氣化方對(duì)HFpEF大鼠炎癥指標(biāo)的影響 和WKY組比較，SHR大鼠造模成功后，大鼠血清炎癥指標(biāo)hs-CRP含量明顯升高（P＜0.01）。經(jīng)過藥物治療后，和HFpEF組比較，諾欣妥和苓桂低、高劑量組均對(duì)大鼠hs-CRP指標(biāo)有明顯的改善作用（P＜0.01），苓桂氣化方組無明顯量效關(guān)系。結(jié)果見表5。

表5 苓桂術(shù)芍湯對(duì)大鼠炎癥指標(biāo)的影響（±s）Tab.5 Effects of Linggui Qihua Fang on inflammation index in rats（±s）mg/L

表5 苓桂術(shù)芍湯對(duì)大鼠炎癥指標(biāo)的影響（±s）Tab.5 Effects of Linggui Qihua Fang on inflammation index in rats（±s）mg/L

注：與 WKY 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 HFpEF 組比較，#P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量 h s-C R P W K Y 組 1 0 - 3.5 1±0.9 8 S H R 組 8 - 5.5 6±2.1 4*H F p E F 組 1 0 - 9.2 3±2.1 4**諾欣妥組 9 1 5 m g/k g 5.5 1±1.0 1#苓桂高劑量組 9 生藥8.1 0 g/k g 6.3 3±2.0 3#苓桂低劑量組 9 生藥4.0 5 g/k g 6.3 2±1.5 7#

3 討論

近年來的研究表明，HFpEF是多種病因引起的心室舒張功能不全而收縮功能正常且具有心力衰竭的癥狀及體征的復(fù)雜臨床綜合征，是一種伴有多種器官功能紊亂的綜合征，而不僅是舒張功能障礙的單一疾病。流行病學(xué)研究顯示，HFpEF約占全部HF患者的一半[11]，該病好發(fā)于老年女性，常合并高血壓病、糖尿病、心房顫動(dòng)、肺動(dòng)脈高壓及肥胖等疾病。

HFpEF具體發(fā)病機(jī)制尚無定論，目前多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為是由于左心室舒張期心肌順應(yīng)性降低以及主動(dòng)松弛功能受損導(dǎo)致其舒張期充盈受損，心搏量減少，引起左心室舒張末壓增高而形成的心力衰竭[12]。HFpEF患者早期可無明顯的臨床癥狀，隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展，左室舒張功能減低加重，出現(xiàn)肺淤血癥狀(氣短、心悸、呼吸困難等肺淤血表現(xiàn)往往是患者的首診原因)，病情繼續(xù)深入發(fā)展，會(huì)出現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓，影響右心室功能，繼而導(dǎo)致體循環(huán)淤血及HFrEF等病理改變[13]。

高血壓病合并高脂血癥模型即是以高脂飼料喂養(yǎng)SHR，構(gòu)建高血壓病合并高脂血癥大鼠HFpEF模型，可造成血脂水平紊亂明顯，心肌細(xì)胞肥厚明顯，腎組織小葉間動(dòng)脈血管壁增厚，提示SHR合并高脂飲食更能模擬人類高血壓合并高脂血癥的臨床表現(xiàn)[14]。長(zhǎng)期高血壓狀態(tài)可使心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如心肌肥厚、心腔擴(kuò)大、質(zhì)量增加等。近年研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病和高血壓病均可獨(dú)立影響心臟解剖結(jié)構(gòu)變化，當(dāng)兩者同時(shí)存在時(shí)這種影響急劇增加，高血壓病引起的心臟增大主要在水平方向，心臟從細(xì)長(zhǎng)向矮胖發(fā)展，而糖尿病引起心肌的改變可能在各個(gè)方向上均有肥厚，心臟在水平及垂直方向上均有增大[15]。本實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果顯示，WKY組的心肌組織心室壁未增厚，心房心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，心肌組織肌纖維橫紋及細(xì)胞核染色清晰。SHR大鼠造成糖尿病模型，結(jié)合高脂飼料飲食，造成HFpEF模型后，可見心房壁明顯增厚，心腔明顯縮小，心肌細(xì)胞排列成間隙狀，可見纖維斷裂，部分排列呈網(wǎng)篩狀。說明HFpEF組大鼠心肌組織發(fā)生病理形態(tài)改變。

既往研究表明，傳統(tǒng)HF治療方案中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARB）、β受體阻滯劑和醛固酮拮抗劑在降低HFrEF病死率方面有明顯的作用，但尚無有力的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)來證實(shí)傳統(tǒng)治療方案能改善HFpEF患者預(yù)后、改善HFpEF患者的發(fā)病率和病死率[16]。中醫(yī)術(shù)語中并無“心力衰竭”這一病名，結(jié)合患者臨床癥狀(胸悶、氣短、下肢水腫等)，將其歸為中醫(yī)“心水”“水腫”“喘證”等范疇。病機(jī)總屬“氣虛血瘀水停”，以“益氣活血利水”為基本治法。課題組經(jīng)前期回顧性研究發(fā)現(xiàn)，HFpEF氣虛程度輕，治以活血利水為主。苓桂術(shù)甘湯出自張仲景《傷寒雜病論》，是治療水飲病的基礎(chǔ)方，也被后世稱為苓桂劑的祖方[17]。

本研究苓桂氣化方由茯苓、桂枝、白術(shù)、赤芍組成，是經(jīng)方苓桂術(shù)甘湯去甘草，合赤芍配伍而成，增強(qiáng)其活血利水之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茯苓的主要活性成分為三萜類和多糖類化合物，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、降血糖、調(diào)血脂等作用[18]；桂皮醛為桂枝的主要活性成分，具有抗炎、降糖、和神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[19]，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是白術(shù)的主要活性成分，其主要藥理作用有抗炎、調(diào)節(jié)胃腸功能、降血糖等[20]。赤芍總苷是赤芍的主要活性成分，其主要藥理作用有改善微循環(huán)、擴(kuò)張血管、抗心肌缺血、抗血栓、抗凝血、改善血流變等[21]。

超聲心動(dòng)圖檢查是目前臨床上評(píng)估HFpEF患者舒張功能的一種主要手段，可以檢測(cè)到大鼠造模及藥物治療前后 E、A、E’、E/A、E/E’、LAEF 及 LVEF值，E/A比值是臨床最常見的評(píng)估左室舒張功能的超聲指標(biāo)，而E/E’比值可反映左室充盈壓[22]，正常情況下，1＜E/A＜2。心房利鈉肽(ANP)是心房肌在壓力超負(fù)荷及容量擴(kuò)張而分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，BNP是心室在壓力負(fù)荷及室壁張力改變的刺激下分泌的主要因素，是心力衰竭診斷、療效評(píng)估及判斷預(yù)后的重要標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，SHR大鼠造模后，大鼠超聲心動(dòng)圖E，A值發(fā)生變化，和WKY組比較E、E/A及E/E’比值顯著增加，E’及LAEF明顯降低，大鼠血中的ANP、BNP含量也明顯升高，說明HFpEF組大鼠心臟功能發(fā)生改變；各藥物均對(duì)大鼠 E、E/A 及 E/E’比值有顯著的改善作用（P＜0.01），苓桂低、高劑量組都有不同程度降低ANP、BNP含量（P＜0.05，P＜0.01），諾欣妥組對(duì) LAEF 有顯著提高作用（P＜0.05），可見 BNP 水平降低（P＜0.01），表明苓桂氣化方對(duì)高脂血癥、高血壓病、糖尿病HFpEF心力衰竭大鼠模型心功能有改善作用，且呈一定量效關(guān)系。同時(shí)，苓桂高劑量組對(duì)大鼠的心肌組織形態(tài)具有改善作用，表明苓桂氣化方對(duì)HFpEF模型大鼠的病理形態(tài)惡化具有抑制作用。

炎性反應(yīng)在HFpEF的發(fā)病機(jī)制中有著重要的作用，炎性指標(biāo)C反應(yīng)蛋白（CRP）是HFpEF患者病死率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，兩者呈正相關(guān)關(guān)系[23]。本研究結(jié)果顯示，和WKY組比較，SHR大鼠造模成功后，大鼠血清炎癥指標(biāo)hs-CRP含量明顯升高（P＜0.01）。經(jīng)過藥物治療后，和HFpEF組比較，諾欣妥和苓桂低、高劑量組均對(duì)大鼠hs-CRP指標(biāo)有明顯的改善作用（P＜0.01），表明苓桂氣化方對(duì)復(fù)合 HFpEF 心力衰竭大鼠模型炎癥水平有一定的改善作用，可降低炎癥因子。

血脂代謝異常與慢性心力衰竭預(yù)后有密切的關(guān)系，TG、TC和HDL-C水平與CHF的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，慢性心力衰竭患者血清TC及HDL-C水平下降，LDL-C升高；多因素Cox回歸分析顯示較低水平HDL-C是影響冠心病并發(fā)慢性心力衰竭患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，提高HDL-C水平可能改善冠心病心力衰竭患者的預(yù)后以及TC水平是慢性心力衰竭終點(diǎn)事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[24]。本研究結(jié)果顯示，與WKY組相比，HFpEF組血清血脂指標(biāo)TC、TG及LDL-C 的含量顯著升高（P＜0.01），HDL-C 含量也有輕度升高，說明SHR大鼠造模成功；與HFpEF組比較，苓桂低、高劑量組均對(duì)大鼠TC及LDL-C有明顯的改善作用（P＜0.01），說明苓桂氣化方對(duì)高脂高血壓糖尿病HFpEF心力衰竭大鼠模型血脂狀態(tài)有一定的改善作用。

胰島素信號(hào)系統(tǒng)異常和代謝底物改變（葡萄糖減少、游離脂肪酸增加），可增加氧化應(yīng)激和脂毒性，降低代謝效率，引起內(nèi)皮和線粒體功能障礙，損傷主動(dòng)松弛功能[25]。本研究結(jié)果顯示，與WKY組相比，HFpEF組血清胰島素相關(guān)指標(biāo) INS、PG、C-P、LEP、GSP以及GLU等的含量都有不同程度的升高（P＜0.01），說明 SHR 大鼠造模成功；與 HFpEF 組比較，各藥物組血清指標(biāo)均降低，其中INS、C-P及LEP降低最為明顯（P＜0.05 或 P＜0.01），苓桂氣化方低、高劑量組對(duì)大鼠GLU有一定的改善作用，且呈一定的量效關(guān)系（P＜0.05 或 P＜0.01），此外，苓桂氣化方大劑量組還可使大鼠GSP水平明顯降低（P＜0.01），表明苓桂氣化方對(duì)高脂血癥、高血壓病、糖尿病HFpEF心力衰竭大鼠模型胰島素相關(guān)指標(biāo)有一定的改善作用。綜上，苓桂氣化方對(duì)高脂血癥、高血糖和高血壓病誘導(dǎo)的復(fù)合HFpEF心力衰竭模型大鼠具有改善心臟舒張功能，抑制心房結(jié)構(gòu)性重構(gòu)，并降低炎性因子、改善糖脂代謝及內(nèi)皮功能的作用。