超聲波輔助響應面優化谷婪步甲甲殼素的快速脫色工藝

楊菁 張建英 韓越 賈龍

摘 要：以谷婪步甲成蟲干粉經前期脫脂、脫蛋白質和脫無機鹽試驗得到的甲殼素粗品為試驗材料，通過超聲波輔助過氧化氫氧化脫色的方法，研究了谷婪步甲甲殼素的脫色工藝。在不同條件下，研究過氧化氫濃度、固液比、超聲時間、脫色溫度及pH對甲殼素脫色效果的影響，用藍光白度值作為脫色效果的判定指標，并以白度值為響應值通過響應面優化法進行相關工藝的優化。經過單因素試驗和響應面優化設計，最終確定了谷婪步甲成蟲甲殼素粗品脫色的最佳工藝條件：過氧化氫濃度30%、固液比1∶30g/mL、超聲時間4h、脫色溫度67.53℃、溶液pH 9。在此最佳工藝條件下，測得谷婪步甲的白度值為74.2371。研究結果可為谷婪步甲粗甲殼素的脫色提供科學數據，并為后期制備殼聚糖奠定基礎。

關鍵詞：谷婪步甲;甲殼素;脫色;白度值;響應面優化設計

中圖分類號 TS254.5文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）12-0113-07

Optimization of Ultrasonic Assisted Decolorization of Harpalus calceatus′s Chitin by Response Surface Methodology

YANG Jing1 et al.

（1Guyuan Branch of Ningxia Airport Limited Company，China West Airpot Group， Guyuan 756000，China）

Abstract： This study used the crude chitin of adult Harpalus calceatus as the experimental material， which needed some pretreatment like degreasing， deproteinizing and salt demineralizing.Then we applied ultrasonic-assisted hydrogen peroxide oxidation method to the research on decolorization technology of the chitin， which could be affected by the variation of hydrogen peroxide concentration， solid-liquid ratio， ultrasonic time， decolorization temperature and pH.The blue light whiteness value was set as the criteria of the decolorization effect， and the related process could be optimized by the response surface optimization method with the whiteness value as the basic response value.Finally， the conclusion could be drawn that the optimum experimental conditions for the HarpaLus calceatus chitin： the hydrogen peroxide reaction concentration was 30%; the solid-liquid ratio was 1∶30（g/ml）; the ultrasonic time was 4h; the optimal bleaching temperature was 67.53℃; the pH was 9.Under this condition， the whiteness value of the Harpalus calceatus could be measured as 74.2371. This study provided a scientific basis for the decolorization process of the crude chitin， and lying? asolid ground for the preparation of chitosan.

Key words： Harpalus calceatus; Chitin; Decolorization; Whiteness value; Response surface optimization

谷婪步甲[Harpalus calceatus （Duftschmid）]隸屬于鞘翅目步甲科，捕食種兼植食性種[1，2];成蟲夜間出土活動，食害谷子、玉米、小麥[3]種子造成缺苗斷壟或毀種，也危害苜蓿、草莓、馬鈴薯、胡麻、糜子[4]等。甲殼素是自然界中數量僅次于蛋白質的含氮有機物，也是僅次于纖維素的第二大天然高分子多糖，主要由動物生成，廣泛存在于節肢動物、軟體動物、環節動物、原生動物、腔腸動物、海藻、真菌[7]和動物的關節、蹄、足的堅硬部分，以及動物肌肉與骨接合處均有甲殼素的存在[5]。

節肢動物中的昆蟲，其甲殼素含量比較高，而且鈣和重金屬含量低，雜質少，純度高，提取過程中對水、酸、堿消耗少，生產成本低[6]，昆蟲甲殼素要優于蝦、蟹甲殼素，而昆蟲中的甲蟲由于具有堅硬的外殼和鞘翅甲殼素含量更高，且甲蟲是昆蟲中資源量最大、種類最多的第一大類昆蟲，正是潛在的甲殼素來源[7]。甲蟲廣泛分布于西北地區，是荒漠流沙地區的優勢種類，其鞘翅及體壁含有豐富優質的甲殼素，具有一定的開發意義。目前，國內外生產甲殼素的主要材料來源是水產加工后廢棄的蝦、蟹殼[8]、魚鱗[9]、蠶蛹[10，11]、蜣螂[12]、蟋蟀[13]等昆蟲，有關甲蟲中提取甲殼素的報道較少。谷婪步甲是寧夏甲蟲的優勢種類，當地數量多、分布廣，本研究化害為益，充分利用生物資源，變廢為寶。

由于谷婪步甲蟲含有較高含量的色素，使得成蟲顏色呈現棕色或黑色，導致所提取的甲殼素顏色較深，不利于甲殼素的二次加工，使其應用范圍和商品價值受到嚴重影響，因此，脫色工藝是解決顏色帶來的產品弊端，生產高品質甲殼素及殼聚糖的關鍵技術[14]，直接影響甲殼素的品質。目前，關于甲殼素脫色工藝的研究，工業上主要采用日光照射和次氯酸鈉、高錳酸鉀氧化脫色等方法，也有用有機溶劑萃取脫色的報道[15]。過氧化氫作為一種易得、加熱后易分解除去的無污染氧化劑，在織物、紙漿脫色上應用廣泛，因此在谷婪步甲提取的甲殼素的應用，具有良好的前景。本研究采用超聲波輔助溶劑進行脫色，利用聲波產生高速、強烈的空化效應和溶劑分子攪拌作用，破壞材料的表面結構，使過氧化氫滲透到甲蟲結構中，縮短脫色時間，提高脫色效率[16]。通過超聲波輔助過氧化氫氧化的方法對已脫脂脫蛋白脫無機鹽的谷婪步甲粗甲殼素進行脫色，并利用響應面進行工藝優化，以期為甲蟲甲殼素的脫色提供理論參考和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 谷婪步甲成蟲采自寧夏吳忠市紅寺堡區。高錳酸鉀、次氯酸鈉、30%過氧化氫、鹽酸、氫氧化鈉、溴化鉀，均為分析純，購于寧夏恒元創科貿易有限公司;標準甲殼素品，食品級，購于上海純優生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備 ALC-210.4型電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司;DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司;KA-1000型低速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠;320A型pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;KQ-250DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;CR-400型色差儀，日本柯尼卡美能達;TENSOR2型7紅外光譜儀，布魯克（北京）科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 谷婪步甲甲殼素制備工藝流程 新鮮甲蟲→滅活→預處理→脫脂→脫蛋白→脫無機鹽→干燥→甲殼素粗品→脫色→甲殼素產品。

1.3.2 甲殼素制備 將新鮮的谷婪步甲成蟲旋轉篩分去除泥土后，洗凈后置于85℃烘箱內，裝鋁盒內烘至恒重（誤差小于0.01g），用破碎機粉碎，過60目篩，過篩后的干蟲粉用濾紙包浸泡于石油醚中，利用索氏提取法脫除油脂，后將已脫脂蟲粉用堿性蛋白酶脫除蛋白質。在室溫下，再用醋酸浸泡已脫脂脫蛋白后的蟲粉，脫除無機鹽后，最終得到的物質即為甲殼素粗品，此甲殼素粗品為本試驗的試驗材料。

1.4 谷婪步甲甲殼素脫色劑的選擇 取谷婪步甲粗甲殼素干粉1.000g置于100mL的三角瓶中，分別用20%和30%的H2O2、5%和10%的NaClO、3%和4%的KMnO4[17]，以1∶25的固液比（W/V，下同），設置超聲功率為500W、60℃下處理3h后，用定量濾紙過濾，濾渣蒸餾水水洗（若用KMnO4對樣品進行處理，需用草酸溶液中和濾渣中剩余的KMnO4，重復2次），脫色后的濾渣在85℃下烘干。烘干后利用色差儀測定脫色后甲殼素樣品白度，以白度值對比脫色工藝的脫色效果，每樣品白度重復檢測3次。

1.5 谷婪步甲甲殼素脫色的單因素試驗 在確定最佳脫色劑后，以H2O2的濃度、固液比、超聲時間、超聲溫度、溶液pH作為影響因子，以藍光白度值為鑒定指標，進行單因素實驗，確定各影響因子對谷婪步甲甲殼素粗品脫色效果的影響[18]。

1.5.1 濃度 固定其他脫色工藝條件：固液比1∶25g/mL、超聲時間3h、脫色溫度60℃、溶液pH9，考察不同過氧化氫濃度（10%、15%、20%、25%和30%），對谷婪步甲甲殼素粗品脫色效果的影響。分別稱取甲殼素粗品0.3000g置于100mL三角瓶中，分別以5種不同濃度的H2O2在固定其他脫色工藝條件下進行脫色處理，脫色效果比較參考1.4。

1.5.2 固液比 固定其他脫色工藝條件：過氧化氫濃度25%、超聲時間3h、脫色溫度60℃、溶液pH9，考察不同固液比（1∶10g/mL、1∶15g/mL、1∶20g/mL、1∶25g/mL、1∶30g/mL）對谷婪步甲甲殼素粗品脫色能力的影響。分別稱取甲殼素粗品0.3000g置入5個100mL三角瓶中，分別以5種不同的固液比在固定其他脫色工藝條件下進行脫色處理，脫色效果比較參考1.4。

1.5.3 超聲時間 固定其他脫色工藝條件：過氧化氫濃度25%、固液比1∶25g/mL、脫色溫度60℃、溶液pH9，考察不同超聲波時間（1h、1.5h、2h、2.5h、3h），對谷婪步甲甲殼素粗品脫色能力的影響。分別稱取甲殼素粗品0.3000g置入5個100mL三角瓶中，分別以5種不同的超聲時間在固定其他脫色工藝條件下進行脫色處理，脫色效果比較參考1.4。

1.5.4 超聲溫度 固定其他脫色工藝條件：過氧化氫濃度25%、固液比1∶25g/mL、超聲波時間3h、溶液pH 9，考察不同脫色溫度（45℃、50℃、55℃、60℃、65℃）對谷婪步甲甲殼素粗品脫色能力的影響。分別稱取甲殼素粗品0.3000g置入5個100mL三角瓶中，分別以5種不同溫度在固定其他脫色工藝條件下進行脫色處理，脫色效果比較參考1.4。

1.5.5 溶液pH 固定其他脫色工藝條件：過氧化氫濃度25%、固液比1∶25g/mL、超聲時間3h、脫色溫度60℃，考察不同溶液pH（5、7、9、11、13）對谷婪步甲甲殼素粗品脫色能力的影響。分別稱取甲殼素粗品0.3000g置入5個100mL三角瓶中，分別在5種不同溶液pH在固定其他脫色工藝條件下進行脫色處理，脫色效果比較參考1.4。

1.6 白度測定 將脫色烘干后所得谷婪步甲甲殼素產品用色差儀所帶附件壓成餅狀，利用色差儀測樣平臺測定白度，選用藍光白度為指標進行讀數。用色差計測定干燥后甲殼素樣品的白度（WH）[19，20]，以標準白板為基準（Y=88.3，X=0.3135，y=0.3198），其中L*為亮度，表示坐標顏色的亮度，取值范圍為0～100（從黑色到白色）。a*和b*是顏色的色調和飽和度，a*代表物體的紅色和綠色，正值代表紅色，負值代表綠色;b*代表物體的黃色和藍色，正值表示黃色，負值表示藍色。甲殼素樣品的白度根據亨特白度公式：[WH=100-（100-L）2+a2+b2][20]進行計算，每處理重復3次，取平均值。

1.7 谷婪步甲甲殼素脫色工藝優化 在單因素試驗所得結果的基礎上，以白度值作為評價指標，選取影響較大的3個因素，選取相關性最好的3個水平，設置3因素3水平的Box-Benhnken中心組合設計實驗[21]，對谷婪步甲甲殼素脫色條件進行優化，各因素的3個水平采用-1、0、1進行編碼，如表1，稱取17份谷婪步甲干粉0.5000g，分別置于離心管中，固定超聲波功率為500W，固液比為1∶30，溶液pH9。按表1進行響應面優化實驗，重復3次取平均值。

1.8 甲殼素的定性分析 甲殼素的定性分析采用紅外光譜分析法，將在最終條件制得的甲殼素產品和購買的甲殼素成品分別進行紅外光譜分析，若試驗所得的甲殼素產品與甲殼素成品所得的光譜一致，說明試驗所得的甲殼素產品是甲殼素，反之不是。

1.9 數據處理 利用Excel 2010進行數據統計和計算，利用SPSS 17進行顯著性分析，采用Design Expert 10.0.7軟件進行響應面優化，建立優化模型。

2 結果與分析

2.1 谷婪步甲脫色劑的選擇 由圖1可知，在3種脫色劑6種濃度中，白度值由大到小依次為30%H2O2、20%H2O2、4%KMnO4、10%NaClO、5%NaClO、3%KMnO4，其中，30%H2O2的白度值最高，可高達50.01，表明其脫色效果最佳，所得的甲殼素白度最高。雖然KMnO4氧化能力較H2O2強，但是MnO4-體積較大，難以進入甲殼素分子中，因此脫色效果較H2O2差。H2O2是以O22-形式起作用，分解后的產物是水，不會產生濃烈的氣味，也不會污染水及空氣，故選用H2O2作脫色劑進行本試驗的后續研究。經方差分析可得，30%H2O2與20%H2O2之間無顯著差異（P>0.05），30%H2O2與3%KMnO4、4%KMnO4、5%NaClO、10%NaClO之間有顯著差異（P<0.05）。故本試驗采用H2O2作脫色劑進行后續的試驗。

2.2 谷婪步甲甲殼素脫色的單因素影響

2.2.1 過氧化氫濃度對脫色效果的影響 由圖2可知，隨著濃度的不斷增加，甲殼素白度值逐漸提高，脫色效果逐步提升，表明脫色效果與H2O2濃度呈正相關。過氧化氫濃度為30%時，白度值達到最大值，脫色能力最佳。經方差分析，過氧化氫濃度為30%時與過氧化氫濃度為20%、25%和35%時無顯著差異（P>0.05），而過氧化氫濃度為30%時與過氧化氫濃度為10%、15%有顯著性差異（P<0.05）。產生這種現象的原因可能是由于O22-等離子間的反應接近飽和，H2O2濃度的增加不會再影響脫色效果。因此，選擇30%的H2O2濃度進行脫色較為合適。

2.2.2 固液比對脫色效果的影響 由圖3可知，隨著固液比的增大，白度值呈現出緩慢增大的趨勢。當固液比為1∶35時，白度值達到最大值，可達43.32，脫色能力最佳。經方差分析，固液比為1∶35與固液比為1∶10、1∶15、1∶20和1∶25均有顯著性差異（P<0.05），而與1∶30無顯著差異（P>0.05）。由此可知，隨著固液比增大，谷婪步甲甲殼素與過氧化氫液體更充分接觸，更多的過氧化氫分子使反應進行的較為徹底，從而使脫色效果更好。由于固液比為1∶35與1∶30白度值無顯著差異，為了節約脫色成本，采用1∶30的固液比進行試驗，不進行后期結果優化。

2.2.3 超聲時間對脫色效果的影響 由圖4可知，甲殼素白度值隨超聲時間的增加而增大，在時間為1h、1.5h、2h時脫色效果變化不明顯，2.5h時脫色效果顯著增強，3h時脫色能力最佳，效果最好，可達61.49。經方差分析，超聲時間3h與超聲時間1h、1.5h、2h和2.5h均有顯著性差異（P<0.05），超聲時間3h與超聲時間3.5h之間無顯著差異（P>0.05）。因此，選擇3h進行脫色較為合適。

2.2.4 脫色溫度對脫色效果的影響 由圖5可知，在45～50℃時脫色效果變化不明顯，55℃時脫色效果顯著增強，60℃時脫色效果最佳，65℃時脫色效果反而下降。經方差分析，60℃與55℃無顯著性差異（P<0.05），與45℃、50℃、65℃有顯著性差異（P>0.05），這是由于在45～50℃時，溫度較低，H2O2的分解速率較慢;而在55℃以上時，隨著溫度升高，H2O2的分解速度加快，脫色效果快速提高。當脫色溫度達到60℃時，白度值最大，達到57.07。而在60℃以后，再提高溫度白度值反而減小，脫色效果不佳，這可能是由于溫度過高時，H2O2受熱分解加劇，反而降低了H2O2的濃度，與溫度提高反應速度的效應相抵消，從而反應速度基本保持不變甚至降低。因此，可選60℃為適宜的脫色溫度。

2.2.5 溶液pH對脫色效果的影響 由圖6可知，白度值隨pH的增加呈現出先增大后減少的變化趨勢。經方差分析，pH9時與其他4個pH均有顯著性差異（P<0.05）。當pH9時，白度值最大，可達43.06，脫色效果最佳，這可能是因為pH9環境能夠促進H2O2的分解，加快O22-的產生速度。因此，谷婪步甲甲殼素的脫色宜在pH9堿性條件下進行。同時，堿性環境也有利于去除粗甲殼素殘留的蛋白質，所以pH選擇9，不另作后期響應面優化試驗的考察因素。

2.3 響應面優化試驗結果

2.3.1 試驗設計方案及結果 根據表1響應面設計，確定17組設計優化方案，試驗步驟參考1.7，試驗方案和結果如表2所示。其中，A-過氧化氫濃度（%）、B-超聲時間（h）、C-脫色溫度（℃），-1、0、1表示設計水平。

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析 采用響應面程序對所得數據進行回歸分析，結果見表3。對各因素回歸擬合后，得到回歸方程為：Y=-139.416+2.01425A+8.63325B+4.68815C-0.326AB+0.05555AC+0.02625BC-0.070780A2+0.2105B2-0.04782C2。

通過響應面設計得到回歸模型p=0.0356，小于0.05，說明所建立模型真實可靠;失擬項p=0.2434，大于0.05，表明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例較小，使用該方程模擬真實的脫色三因素三水平的工藝設計分析是可行的。由表3可知，脫色溫度、過氧化氫濃度、超聲時間對谷婪步甲最佳脫色工藝的影響均呈現顯著性差異（P<0.05），影響脫色的因素按主次順序排列為：脫色溫度（C）>過氧化氫濃度（A）>超聲時間（B）。由設計試驗所得的響應面交互作用曲面圖如圖7～9所示。響應面優化試驗結果顯著表明，最佳提取工藝為：過氧化氫濃度30%、超聲時間4.0h、脫色溫度67.53℃。

2.3.3 響應面優化圖分析 為進一步研究各因素交互作用，利用Design-Expert10.0.7統計軟件繪制響應面和等高線分析圖，從圖7～9中可以較明顯的分析出3個自變量對響應值的影響以及響應值對不同自變量變化的敏感程度。

根據回歸方程（Y）作出三維交互作用響應面圖和等高線圖（圖7、圖8和圖9），可以分析各因素之間相互作用的影響。每個響應曲面代表著其中任意一個因素為固定值時其余2個獨立因素之間的相互作用對脫色效果影響的變化趨勢，曲面圖中的最高點表示實驗因素間相互作用后的最佳脫色結果。由等高線圖和表3可知，脫色溫度、過氧化氫濃度、超聲時間對谷婪步甲脫色的交互對作用p值均大于0.05，表明三者交互項的交互作用均不顯著，三者交互作用對谷婪步甲甲殼素脫色效果無影響，這與方差分析結果吻合。

2.4 驗證試驗 利用DesignExpert10.0.7軟件對試驗模型進行分析，得到谷婪步甲最佳脫色工藝為：過氧化氫反應濃度為30%、超聲時間4h、最佳脫色溫度67.53℃。為了驗證響應面優化模型的準確性，進行了3次驗證試驗。實際測得的白度值為74.5356、74.3212和74.4329，與預測值74.2371接近，說明試驗結果真實準確，該回歸方程可以反映各因素對谷婪步甲脫色工藝的影響，具有實用價值。

2.5 甲殼素的定性分析 通過比對在最佳脫色條件下制備的甲殼素產品（yts）與標準甲殼素樣品（bp）的紅外光譜圖可知，本工藝脫色制備的谷婪步甲甲殼素產品與標準甲殼素樣品化學結構完全一致，說明確系甲殼素（見圖10）。

2.6 試驗結果 本試驗以谷婪步甲成蟲為原材料，經過前期脫脂、脫蛋白質和脫無機鹽試驗得到的甲殼素粗品為實驗材料，通過響應面優化超聲波輔助過氧化氫氧化的方法，研究了谷婪步甲甲殼素粗品的脫色工藝，用藍光白度值進行鑒定，得到了以下結論：（1）通過對H2O2、KMnO4、NaClO3種脫色劑的脫色效果進行比較，選用H2O2作為谷婪步甲粗甲殼素的最佳脫色劑。（2）通過谷婪步甲脫色的單因素試驗結果及數據分析可知，谷婪步甲的最佳脫色工藝為：過氧化氫濃度25%、超聲時間3.0h、脫色溫度60℃、溶液pH9、固液比為1∶30。（3）用響應面優化設計對超聲波輔助過氧化氫脫色的工藝進一步優化，建立了白度值的回歸模型，3個因素對白度值的影響大小為：脫色溫度>過氧化氫濃度>超聲時間，總模型P=0.0356，表明試驗結果顯著。最佳脫色工藝為：過氧化氫濃度30%、超聲時間4.0h、脫色溫度67.53℃。（4）在最佳脫色工藝條件下，最佳理論白度值為74.2771，進行2次驗證試驗。試驗結果表明，驗證試驗白度值為74.5356、74.3212和74.4329，與模型預測結果相近，驗證了該模型的可靠性，具有實用價值。

3 結論與討論

3.1 誤差分析 在試驗過程中，造成的誤差主要有以下幾個方面：（1）超聲波清洗器的溫度不太精準，往往會隨著實驗的進行溫度跳到高于所設定的溫度值2～3℃，從而造成實驗誤差。對此，我們采用的辦法是向清洗器里不時地加入自來水，同時排出溫度較高的水，從而降低到實驗所設定的溫度。（2）進行pH影響的單因素試驗時，加入30%氫氧化鈉溶液調節pH值至堿性。由于過氧化氫液體與氫氧化鈉溶液反應過于劇烈，反應會產生大量的氣泡，常常會將蟲粉沖出反應器皿以外。因此，該單因素試驗更換了較大的反應器皿，而且降低了調節pH的氫氧化鈉的濃度，將其濃度由30%調至5%，進行后期試驗。

3.2 創新點 （1）化害為益：本試驗以谷婪步甲成蟲為原料，谷婪步甲為寧夏及周邊普遍存在的一種農業害蟲，用它提取甲殼素，化害為益，為甲殼素的制備提供新的材料來源。（2）化繁為簡：采用超聲波輔助過氧化氫氧化脫色的方法進行脫色，縮短了試驗反應時間，節約了成本。

3.3 研究展望 本試驗以谷婪步甲成蟲為原材料，研究婪步甲甲殼素的脫色工藝，并確定了谷婪步甲的最佳試驗條件。本研究為谷婪步甲等農業害蟲的利用提供了新思路，為谷婪步甲等甲蟲粗甲殼素的脫色提供了科學數據，并為后期制備殼聚糖奠定基礎。

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（責編：張宏民）