二甲基砷酸對遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞的毒性作用以及誘導細胞凋亡的機制

趙鳳琴，周 蕾，王智閱，孫東禹，樸 君，樸敬愛，金 梅

(遼寧師范大學 生物技術與分子藥物研發遼寧省重點實驗室，大連 116081)

砷(As)是一種普遍存在于各種環境介質中的有毒類金屬[1]。環境中過量的砷會對生物體產生毒副作用，慢性砷中毒已成為世界性的公共衛生問題，我國是受砷中毒影響較重的國家[2]。

遼寧絨山羊作為我國優秀的絨山羊品種，原產于遼寧省東南部山區，以其絨毛品質優和產絨量高而享譽世界，是我國嚴禁出境的珍貴品種資源之一，目前主要分布在瓦房店市、莊河市、遼陽市以及蓋州市等地[3-5]。近年來，畜牧養殖業中為了促進畜禽生長、預防疾病而使用的含砷飼料添加劑，以及工業中與農業生產中木材防腐劑、殺蟲劑中也往往含有砷化合物，這些含砷化合物的使用會使砷在環境中富集，飲水攝入是其主要途徑，會在含有較多角蛋白的表面皮膚和毛發中發生蓄積，致使絨山羊皮膚異常[6-8]。皮膚被認為是對砷毒性最敏感的器官之一[9]。

進入動物體內的砷主要在肝組織發生甲基化反應，其中二甲基砷酸是哺乳動物代謝砷的一種主要代謝產物，微量的二甲基砷酸可由皮膚組織排出[10]。無機砷甲基化是砷在動物體內的主要代謝方式,被公認為砷元素的解毒過程[11]。在過去的幾年里，研究者一直認為無機砷在體內甲基化代謝產生的有機砷是不具有毒性作用的，直到2000年，研究者們發現，無機砷在動物體內發生甲基化之后，毒性發生了改變，這一發現證明了甲基化過程并不是完全解毒的，一甲基亞砷酸、二甲基亞砷酸等三價甲基化形式的砷對細胞有毒性作用，同時，在致癌過程中砷的甲基化代謝產物起著重要的作用[12-14]。

目前，對于二甲基砷酸毒性的研究主要集中在細胞水平和分子水平，Sakurai等[15-16]以人皮膚成纖維細胞TIG-112和猿皮膚成纖維細胞CRL-1609作為研究對象，得出二甲基砷酸對TIG-112和CRL-1609細胞等哺乳動物細胞具有明顯的細胞毒性。Fujioka 等[17]研究發現，二甲基砷酸能夠增加小鼠雄性后代中肺腺癌10.0%發生率，并且與雄性對照后代相比，同時還增加了雄性后代肝細胞癌的發生。細胞DNA是外界環境毒物主要作用靶點，DNA一旦受到損傷，且在復制前沒有得到正確的修復，受到損傷的DNA進入復制過程就會導致一系列不良結果，甚至最終可能會導致細胞的死亡。有研究表明，二甲基砷酸能引起人肺泡L-132細胞、小鼠和兔子的肺和肝、人纖維原細胞等不同類型細胞發生DNA單鏈斷裂和DNA交聯，損傷細胞DNA，具有基因毒性[18-21]。同時，高濃度的二甲基砷酸能夠誘導人腎癌細胞HL-60、正常小鼠肝細胞TRLl215和人白血病HL-60等細胞產生凋亡[22-23]。細胞凋亡涉及多種機制，研究表明，砷可以通過降低線粒體膜電位來誘導細胞凋亡[24-25]。Kumar等[26]研究得出，砷通過氧化應激影響線粒體膜電位變化，從而導致細胞凋亡。Perker等[27]研究發現，溶酶體(lysosome)數量和通透性變化存在于早期的凋亡級聯反應,進而引起凋亡反應。本研究以遼寧絨山羊為研究對象，通過砷對絨山羊皮膚成纖維細胞的染毒試驗，初步篩選細胞毒性閾值，檢測細胞骨架形態的變化，進一步探究二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞的毒性作用，結合流式細胞儀、免疫熒光檢測等方法檢測凋亡細胞的細胞器及其膜電位的變化，深入探究其誘導細胞凋亡的機制，為后續研究砷對遼寧絨山羊皮膚細胞損傷以及對絨山羊皮膚細胞生長的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用羊購自遼寧省大連市金石灘永盛絨山羊養殖場，10月份隨機選取1只7月齡各項機能正常，體重為25 kg左右的雄性遼寧新品系絨山羊。

1.2 絨山羊皮膚成纖維細胞的分離與培養

絨山羊腹部除去表面毛發，剪取絨山羊皮膚，用無菌PBS沖洗，將組織剪成1 mm3體積的碎塊，加入2倍體積混合酶液，37 ℃消化30～45 min，離心后，加適量完全培養基(Hyclone，美國)。所有細胞在37 ℃，5% CO2條件下培養。

1.3 MTT檢測絨山羊皮膚成纖維細胞的增殖活性

待細胞80%黏連，根據細胞量進行細胞擴培，擴培后將細胞分置于96孔板；根據不同濃度分組(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、5、10、25、50、100 mmol·L-1)的二甲基砷酸(Sigma，美國)對絨山羊皮膚成纖維細胞給藥處理，于24、48、72、96 h進行MTT(Sigma，美國)檢測；進行MTT檢測時每孔加入10 μL的MTT，避光條件下培養3～4 h后；每孔吸去培養液，加入150 μL DMSO(Invitrogen，美國)，于搖床上混勻10 min；經酶標儀(Thermo)492 nm檢測。

1.4 免疫熒光檢測絨山羊皮膚成纖維細胞骨架和形態的變化

將擴培后的細胞分于6孔板；將不同濃度二甲基砷酸給藥處理后于24 h進行免疫熒光檢測；PBS漂洗，4%多聚甲醛固定10 min。內源過氧化物酶滅活；將切片浸入抗原修復液(檸檬酸三鈉緩沖液)中，96 ℃ 5 min。10%FBS封閉15 min。加入微管蛋白(Abcam，美國)和鬼筆環肽抗體(Actin-Trakcer Green，中國)，4 ℃孵育過夜后洗片。微絲熒光探針(碧云天 C1033)和CY3標記二抗，37 ℃孵育30 min。PBS漂洗封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 彗星試驗檢測絨山羊皮膚成纖維細胞的DNA損傷情況

將已預熱56 ℃的80 μL 0.5%正常熔點瓊脂糖NMA滴到載玻片上，蓋上蓋玻片，4 ℃放置10 min凝固。取10 μL含1 000個細胞的PBS和75 μL 0.5%低熔點瓊脂糖LMA在37 ℃混勻，進行第二層膠和第三層膠的制備。然后進行細胞裂解。取出載玻片，PBS沖洗后堿解旋20 min。在25 V、300 mA條件下電泳20 min。用Tris-HCl(pH7.5)中和15 min。50 μL 30 μg·mL-1的溴化乙錠(Sigma,美國)避光染色20 min，即可觀察，數據通過彗星分析軟件CASP分析得到。

1.6 流式細胞儀檢測絨山羊皮膚成纖維細胞的凋亡

將絨山羊皮膚細胞接種至6孔板中，每孔加入1 mL培養液。細胞經胰酶消化后，收集細胞懸液，用PBS調整細胞濃度，75%冰乙醇固定細胞1～2 h，取200 μL細胞懸液與10 μL PI 混勻，孵育45 min，冷PBS溶液洗滌細胞，流式上機檢測，CELL Quest軟件分析細胞散點圖，根據各象限細胞數計算凋亡細胞比例。

1.7 透射電鏡觀察絨山羊皮膚成纖維細胞的細胞質和細胞器變化

收集培養的細胞，1 000 r·min-1離心2～3 min，加2.5%戊二醛進行固定，乙醇梯度脫水(30%、50%、70%、80%、90%、95%)，每次15 min；無水乙醇處理20 min；純丙酮處理20 min；包埋劑與丙酮1∶1 混合液處理1 h；包埋劑與丙酮3∶1處理樣品3 h；純包埋劑處理樣品過夜，進行超薄切片，醋酸鈾(Spi-Chem，美國)、檸檬酸(Spi-Chem，美國)鉛染液中染色15 min；1%氫氧化鈉洗1次，水洗2次，干燥后進行電鏡觀察。

1.8 二甲砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞線粒體膜電位(ΔΨm)的影響

將絨山羊皮膚細胞鋪板于24孔板中，密度為5×104個·mL-1，使用不同濃度的二甲基砷酸處理24 h后；取出細胞培養液，加入37 ℃預溫育的Mito-Tracker Green 染色工作液，與細胞共孵育30 min；去除Mito-Tracker Green 染色工作液，加入37 ℃預溫育的新鮮細胞培養液；用熒光顯微鏡觀察拍照，圖像軟件分析。

1.9 二甲基砷酸對溶酶體的影響

絨山羊皮膚細胞鋪板于24孔板中，密度為5×104個·mL-1，使用不同濃度的二甲基砷酸處理24 h后；去除細胞培養液，加入37 ℃溫育的Lyso-Tracker Red染色工作液，與細胞37 ℃共孵育30～120 min；去除Lyso-Tracker Red染色工作液，加入新鮮的細胞培養液；每組隨機選取50個細胞測量其熒光強度，隨后用共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.10 統計學分析

2 結 果

2.1 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞增殖的影響

不同濃度組(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、5、10、25、50、100 mmol·L-1)的二甲基砷酸染毒絨山羊皮膚成纖維細胞24、48、72、96 h后，經MTT法檢測，結果見表1。通過不同時段的比較，發現24 h時不同濃度的OD值均能明顯地反映出二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞的增殖和抑制趨勢，存在一定的劑量-效應關系，而48、72、96 h時增殖作用逐漸減弱甚至消失，因此選取24 h作為時間樣點進行后續試驗。24 h時，相比對照組，二甲基砷酸濃度為0.8 mmol·L-1時對絨山羊皮膚成纖維細胞有明顯的促進增殖作用；濃度在0.8～1 mmol·L-1時，增殖效果減弱；當濃度大于1 mmol·L-1時對皮膚成纖維細胞產生顯著的毒性作用(P<0.01)。根據MTT試驗檢測結果，選擇24 h條件下的4個濃度組進行后續試驗，分別為對照組(未做任何處理)、促進濃度組(0.8 mmol·L-1)、臨界濃度組(1 mmol·L-1)、IC50濃度組(38.68 mmol·L-1)。

表1 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞處理OD值的測定結果Table 1 The result of OD value in the skin fibroblasts of Liaoning cashmere goat by dimethyl arsenic acid

2.2 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞骨架和形態的影響

用不同試驗組即對照組(未做任何處理)、促進濃度組(0.8 mmol·L-1)、臨界濃度組(1 mmol·L-1)、IC50濃度組(38.68 mmol·L-1)的二甲基砷酸處理絨山羊皮膚成纖維細胞后進行免疫熒光檢測，結果見圖1。

與對照組相比，促進濃度組細胞骨架形態完整，核周紅色熒光密集排列，促進微管蛋白聚合；臨界濃度組的細胞骨架形態發生改變，微絲收縮明顯，核周紅色熒光分散排列；IC50濃度組的細胞骨架形態差異很大，微絲收縮明顯，核周紅色熒光分散排列明顯，抑制微管蛋白聚合。

染核(藍色)、微絲(綠色)、微管(紅色)Staining nucleus(blue),microfilament (green),microtubules (red)圖1 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞骨架的影響(400×)Fig.1 The effects of dimethyl arsenic acid on skin fibroblast cytoskeleton of cashmere goats(400×)

2.3 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞DNA的影響

為了避免凋亡或壞死所造成的 SCGE 試驗呈現假陽性，采用臺盼藍染色法觀察4個濃度組細胞DNA的損傷，結果見圖2和表2。

表2 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞DNA的影響Table 2 Effect of dimethyl arsenic acid on DNA of cashmere goat skin fibroblasts

圖2 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞DNA的損傷Fig.2 DNA damage of cashmere goat skin fibroblasts by dimethyl arsenic acid

在熒光顯微鏡(200×)下觀察，細胞DNA 呈橘紅色，對照組細胞DNA 只有一個完整的頭部，二甲基砷酸促進濃度組和臨界濃度組均未出現拖尾現象，IC50濃度組出現彗星尾，最多且最明顯，同時發生I、II級DNA鏈斷裂，與對照組相比，其差異具有統計學意義(P<0.01)。因此可以說明，高濃度二甲基砷酸可以引起絨山羊皮膚成纖維細胞DNA鏈斷裂，從而引起DNA損傷。

2.4 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞凋亡的影響

根據流式細胞儀獲取的4個濃度組細胞散點圖分析，左上象限為死細胞，左下象限為活細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞(圖3)。

圖3 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞凋亡率的影響Fig.3 The effect of dimethyl arsenic acid on apoptosis rate of skin fibroblasts of Liaoning cashmere goat

結果經統計學分析，對照組、促進濃度組、臨界濃度組、IC50濃度組的早期凋亡率分別為4.19%、3.41%、6.69%、14.90%；晚期凋亡率分別為0.422%、0.413%、0.848%、2.790%，總的凋亡率分別為4.612%、3.823%、7.538%、17.690%。由此可以得出，細胞的凋亡主要以早期凋亡為主，相比對照組，促進濃度組凋亡細胞數減少，隨二甲基砷酸濃度的增加，臨界濃度組和IC50濃度組的凋亡率明顯上升。

2.5 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞線粒體形態及膜電位的影響

用4個濃度組的二甲基砷酸處理絨山羊皮膚成纖維細胞后，進行透射電鏡觀察和免疫熒光檢測試驗，結果見圖4和圖5。

圖4 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞的細胞質和細胞器形態的影響Fig.4 The effect of dimethyl arsenic acid on cytoplasm and organelle morphology of skin fibroblasts of Liaoning cashmere goats

圖5 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞線粒體的影響Fig.5 The effect of dimethyl arsenic acid on mitochondria in the skin fibroblasts of Liaoning cashmere goats

相比對照組，促進濃度組的線粒體數目增多，膜結構清晰，嵴致密，形態完整；臨界濃度組線粒體數目減少，形態不規則，膜部分破裂，線粒體腫脹，嵴斷裂溶解；IC50濃度組線粒體數目明顯降低，形態不完整，線粒體呈現不清晰或無的狀態。

通過測定細胞內熒光染料Mito-Tracker Green的染色強度，分析不同濃度組二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞線粒體跨膜電位的影響，結果見圖6。與對照組相比，促進濃度組膜電位升高，臨界濃度組膜電位降低，變化不明顯，IC50濃度組膜電位明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖6 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞線粒體膜電位的影響Fig.6 The effect of dimethyl arsenic acid on mitochondrial transmembrane potential of skin fibroblasts of Liaoning cashmere goats

2.6 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞溶酶體的影響

用熒光顯微鏡觀察與統計4個濃度組二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞溶酶體的影響，結果見圖7和表3。

表3 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞溶酶體的影響Table 3 The effects of dimethyl arsenic acid on lysosomes of Liaoning cashmere goat skin fibroblasts

與對照組相比，促進濃度組溶酶體數目增多，臨界濃度組的溶酶體數目減少，IC50濃度組溶酶體數目明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。

3 討 論

砷是自然界中一種常見的環境污染物，被認為是有毒的，主要通過飲用水和飲食進入動物體內，從而對動物機體造成威脅[28]。本研究探討了二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞的毒性作用和其誘導細胞凋亡的機制。首先。MTT法檢測了不同濃度(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、5、10、25、50、100 mmol·L-1)二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞的毒性作用，結果表明，在24 h時，0.1～1 mmol·L-1濃度的二甲基砷酸能促進絨山羊皮膚成纖維細胞增殖；濃度大于1 mmol·L-1的二甲基砷酸則會引起較強的細胞毒性，且隨著濃度的增加，IC50濃度組細胞毒性明顯(P<0.01)。因此，可以說明在短時間內五價有機砷對絨山羊皮膚成纖維細胞增殖具有雙向調節作用，且隨著濃度增加和時間的延長，這種作用會逐漸消失，僅對細胞生長產生抑制作用，具有劑量-效應和時間-效應關系，這一結果與Vega等[29]的研究結果一致。

然而二甲基砷酸對不同類型細胞毒性作用閾值存在很大差異，Sakurai等[15]研究發現，10 mmol·L-1的二甲基砷酸會對TRL 1215細胞產生很強的毒性作用。尹仕偉等[30]研究得出，10 μmol·L-1的二甲基砷酸對人胚肺成纖維細胞生長產生明顯抑制作用。通過本研究與Sakurai等[15]、尹仕偉等[30]的研究結果比較得出，二甲基砷酸對不同類型細胞產生毒性的濃度有所不同，這是由于絨山羊皮膚成纖維細胞、TRL 1215細胞、人胚肺成纖維細胞3種類型的細胞對砷的吸收不同，積累不同，從而對細胞產生的毒性作用不同[31]。同時，不同的砷化合物毒性也存在很大差別。通過本研究與本課題組已有的亞砷酸鈉對遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞的研究比較得出亞砷酸鈉的毒性強于二甲基砷酸的毒性。究其原因，一方面，與有機砷相比，無機三價砷對皮膚中的巰基蛋白具有高度的親和力,無機三價砷與巰基蛋白的結合是其毒性的重要機制[32-33]；另一方面，無機砷在體內甲基化生成的有機砷存在解毒作用。

藍色是細胞核，紅色是溶酶體Blue is the nucleus,red is the lysosome圖7 二甲基砷酸對絨山羊皮膚成纖維細胞溶酶體的影響Fig.7 The effects of dimethyl arsenic acid on lysosomes in Liaoning cashmere goat skin fibroblasts

細胞骨架由微管、微絲、中間纖維3個主要部分構成，這種結構處于動態變化中。微管為細長中空而直的細管，長度不一，可達數微米，中心是電子不透明的空腔。微絲又稱肌動蛋白絲，這種直徑為7 nm 的纖維存在于所有的真核細胞中，由球形肌動蛋白和肌球蛋白聚合而成的細絲彼此纏繞成雙螺旋絲，它們分別由相應的的蛋白質亞基組裝而成，并賦予細胞不同的形態和功能。中間絲又稱為中間纖維，一種直徑為10 nm左右的細長管狀結構。細胞骨架在維持細胞形態、運動、物質運輸等方面具有重要的作用。本研究中，用微管蛋白和鬼筆環肽標記一抗，用微絲熒光探針(C1033)和CY3標記二抗，應用免疫熒光技術成功觀察得到二甲基砷酸處理后遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞骨架的變化。

細胞DNA是外界環境毒物主要作用的靶點。彗星試驗可以檢測DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂、堿不穩定位點等多種類型的DNA損傷[34-35]。Mishra和Flora[36]的研究表明，慢性砷暴露于淋巴細胞會使DNA單鏈發生斷裂，造成DNA損傷。Yin等[37]研究表明，砷可以直接導致雙鏈DNA損傷，并間接降低JB6細胞中DNA修復能力，從而增強UVB引起的DNA損傷。Zhang 等[38]研究發現，砷會誘導DNA損傷并抑制NER相關基因的表達。Yih等[39]研究發現，砷能使DNA損傷,通過抑制G2周期檢測點的活性導致CGL-2細胞凋亡，Mourón等[40]的研究得出，0.5 mmol·L-1二甲基砷酸會引起人肺成纖維細胞DNA-蛋白質交聯，從而引起損傷。本研究結果發現，高濃度二甲基砷酸能引起絨山羊皮膚成纖維細胞DNA鏈斷裂，從而導致DNA損傷，具有基因毒性。從研究結果可以看出，二甲基砷酸對不同細胞的敏感性不同，導致對其DNA損傷程度不同。

細胞凋亡是多細胞有機體為調控機體生長發育、維護內環境穩定，由基因控制的細胞主動的程序化死亡過程，包括外源性通路和內源性通路兩種。內源性通路的特征是線粒體功能發生變化，線粒體不僅是為細胞提供能量的細胞器，而且在細胞凋亡過程中發揮了極其重要的作用。一般認為，在高強度的細胞應激狀態下，細胞內的溶酶體膜通透程度較高，則可導致溶酶體內容物的大量釋放，引起快速的細胞凋亡。線粒體膜電位降低是細胞凋亡的特異性標志，膜電位一旦受到損傷，最終就會導致細胞的凋亡[41-42]。

Kumar等[26]的研究得出，砷通過誘導人白血病細胞DNA損傷和線粒體膜電位改變引起細胞凋亡。本研究得出，二甲基砷酸引起的絨山羊皮膚成纖維細胞凋亡與DNA損傷、線粒體膜電位之間存在相關性。促進濃度組山羊皮膚成纖維細胞線粒體膜電位升高，凋亡細胞數減少，隨著二甲基砷酸濃度的增加，IC50濃度組細胞的DNA與細胞器損傷加重、線粒體膜電位降低，凋亡率升高。除此之外，Pan等[43]研究得出，砷通過激活線粒體-溶酶體通路誘導胰腺細胞凋亡。本研究得出，IC50濃度組山羊皮膚成纖維細胞的線粒體膜電位降低，溶酶體膜完整性降低，含量減少，凋亡率升高。因此可以說明，二甲基砷酸通過線粒體和溶酶體途徑誘導細胞凋亡。

4 結 論

本研究探索了二甲基砷酸對遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞的毒性作用以及誘導細胞凋亡的機制，研究結果表明，一定濃度的二甲基砷酸對遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞具有毒性作用，并具有進一步誘導細胞凋亡作用，為后續砷導致絨山羊皮膚細胞損傷及環境因素對絨山羊皮膚細胞生長影響的研究提供重要信息。