牛凸隆病毒HE基因分子特征分析

趙 龍，湯 承,2，岳 華,2*

(1.西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，成都 610041)

牛凸隆病毒(bovine torovirus,BToV)是套式病毒目(Nidovirales)托巴套氏病毒科(Tobaniviridae)凸隆病毒屬 (Torovirus)的成員[1]，是經證實的牛腹瀉病原，主要引起犢牛腹瀉甚至死亡，同時也可引起成年牛腹瀉[2-3]。該病毒在牛呼吸道中也可檢出，具有雙重組織嗜性，是潛在的呼吸道致病因子[4-5]。自1982年在美國首次報道以來，目前世界上已有17個國家報道BToV的存在或流行，其已經具有廣泛的地域分布[4-14]。

BToV為有囊膜單股正鏈RNA病毒，基因組由5′UTR和ORF1a、ORF1b、S、M、HE、N 6個ORF區以及3′UTR組成[15]。其中,HE基因編碼的血凝素酯酶蛋白(HE蛋白)具有凝集素結構域 R(136—282 aa)、酯酶結構域 E(21—135 aa、283—338 aa)、膜近端結構域 MP(15—20 aa、339—384 aa)3個 結構域[16-17]。在病毒感染的初期，HE蛋白幫助病毒實現與唾液酸的可逆性結合，從而逃避宿主的免疫作用[16,18-19]。這種具有受體破壞酶活性的結構蛋白還在A群β冠狀病毒、C型流感病毒、傳染性鮭魚貧血病毒這3類病毒中發現[16,19-21]。在A群β冠狀病毒中，血凝素酯酶蛋白不僅作為病毒感染過程中的第二受體，還參與宿主特異性和組織嗜性的改變，并且還能誘導機體產生中和抗體[22-24]。在C型流感病毒中，血凝素酯酶蛋白的變異可能會導致病毒發生抗原漂移[25]。而在傳染性鮭魚貧血病毒中，血凝素酯酶蛋白則決定著病毒的致病性[21]。可見血凝素酯酶蛋白與病毒的毒力改變、組織嗜性改變、和跨種間傳播密切相關，在病毒的感染與進化中起著重要作用。

根據HE基因序列特征可將BToV劃分為3個基因型(基因Ⅰ～Ⅲ型)[26]，當前世界各國主要流行的是Ⅱ型和Ⅲ型[3,8,27]。本實驗室最近證明了BToV在國內牛群中的存在，檢測到的毒株均為Ⅱ型毒株[8]。目前，BToV在國內牛群中的流行病學資料仍然很少，本研究旨在進一步分析我國BToVHE基因分子特征，為牛腹瀉疾病的防控和BToV的遺傳進化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

94份牛腹瀉樣本采集于2018年11月—2020年9月，其中，20份犢奶牛(3月齡以內)腹瀉樣本采自遼寧2個養殖場，58份犢奶牛(3月齡以內)腹瀉樣本采自河南2個養殖場，16份肉牛(6月齡)腹瀉樣本采自四川1個養殖場，樣本凍存于-80 ℃。

1.2 主要試劑及儀器

TrizolTM、pMD19-T克隆載體、反轉錄試劑盒、DH5α感受態細胞等購于寶生物工程(大連)有限公司；PCR預混酶Quick Taq HS Dye Mix購于東洋紡(上海)生物科技有限公司；凝膠成像系統Doc2000(Bio-Rad公司，美國)；基因擴增儀(ThermoFisher Scientific公司，美國)。

1.3 RNA提取與cDNA合成

取糞便0.2 g與PBS緩沖液(1∶5)混勻后以8 000 r·min-1離心8 min，取上清液400 μL用Trizol 法提取RNA，然后反轉錄合成cDNA凍存于-20 ℃ 待用。

1.4 臨床樣本中BToV的檢測

采用本實驗室建立的RT-PCR方法[8]進行BToV檢測。PCR陽性產物送生物工程(上海)股份有限公司測序以驗證檢測準確性。

1.5 HE基因擴增

根據GenBank中已有的3條完整基因Ⅰ型HE基因序列，15條完整Ⅱ型HE基因序列，3條完整Ⅲ型HE基因序列(參考序列GenBank登錄號已在遺傳進化樹中標出)，采用Primer Premier 5.0設計6對引物(表1)，用于擴增陽性樣本中不同基因型的完整HE基因。PCR擴增條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，35個循環。反應體系：QuickTaqHS Dye Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補足25 μL。陽性PCR產物使用膠回收試劑盒回收后連接pMD19-T載體，轉入DH5α感受態細胞，增菌后送生工生物工程(上海)有限公司測序。對獲得的序列采用SeqMan7.0 (version 7.0;DNASTAR,USA)拼接。

表1 HE基因擴增引物信息Table 1 Primer information of HE gene

1.6 遺傳進化和重組及結構分析

使用MEGA 7.0.26進行多序列比對，并采用最大似然法建立氨基酸系統發育樹；使用MegAlign (DNASTAR Inc.,WI,USA)計算核苷酸和氨基酸相似性；使用SimPlot 3.5.1和RDP 4.97中的RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq 7種方法進行重組分析；參照牛凸隆病毒血凝素酯酶(SMTL ID：3i26.1)的晶體結構，使用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)和UCSF Chimera 1.14構建本研究中HE蛋白的三維模型[16]。

2 結 果

2.1 腹瀉樣本中BToV檢測

從94份牛腹瀉樣本檢出10份BToV陽性，平均陽性率為10.64%，陽性樣本分別來自遼寧和河南以及四川的4個牛場；遼寧、河南、四川的陽性率：10%(2/20)、1.72%(1/58)、43.75%(7/16)。

2.2 HE基因擴增和序列分析

從10份陽性樣本中成功擴增得到15條完整HE基因，包括9條Ⅱ型(GenBank登錄號：MW281062～MW281068、MW114526、MW114527)和6條Ⅲ型(GenBank登錄號：MW281069～MW281073、MW114525)，其中,四川的5份陽性樣本存在基因Ⅱ型和Ⅲ型毒株的混合感染，河南的1份樣本單獨感染基因Ⅲ型毒株，遼寧和四川的各2份樣本單獨感染Ⅱ型毒株。

本研究獲得的6條完整的基因Ⅲ型HE基因長度均為1 257 bp，編碼418個氨基酸，在238位點(相比Ⅱ毒株)缺失1個氨基酸。它們之間的核苷酸相似性為98.6%～100.0%，氨基酸相似性為98.1%～100.0%，與GenBank中已有的21個完整HE基因的核苷酸相似性為71.8%～99.3%，氨基酸相似性為71.2%～99.0%。進一步分析表明，與GenBank中已有的3條國外Ⅲ型毒株HE基因相比，本研究獲得的6條Ⅲ型毒株的HE基因具有共同的4個氨基酸位點突變：V78A、E143A、S238T、Y418H，其中,V78A位于酯酶結構域，E143A、S238T則位于凝集素結構域。基于完整HE基因氨基酸序列的系統發育分析表明，本研究獲得的6條完整的基因Ⅲ型HE基因則在進化樹上聚為獨立的1個小支，與土耳其毒株MG957145.1親緣關系最近(圖1)。

本研究獲得的9條Ⅱ型HE基因長度均為1 260 bp，編碼419個氨基酸，它們之間的核苷酸相似性為96.0%～100.0%，氨基酸相似性為96%～100%，與GenBank中其余的21個完整HE基因的核苷酸相似性為77.1%～99.0%，氨基酸相似性為77.1%～99.0%。與GenBank中已有的15條Ⅱ型HE基因相比，本試驗Ⅱ型毒株MW281064、MW114526、MW114527和GenBank中Ⅱ型毒株MN073058、MN073059、AJ575379.1 在凝集素結構域中存在1個 獨特的氨基酸突變(T150A)。而本試驗Ⅱ型毒株MW281062、MW281063、MW281065～MW281068和土耳其Ⅱ型毒株MG957146.1則具有2個共同的氨基酸突變(I52V、T177N)，分別位于凝集素結構域和酯酶結構域。基于完整HE基因氨基酸序列的系統發育分析表明，本研究中獲得的9條Ⅱ型HE基因由于上述的氨基酸突變導致它們在遺傳進化樹上分別聚為2個不同的分支(圖1)。

▲.本研究中BToV毒株；■.中國BToV毒株▲.BToV strains in this study;■.BToV strains in China圖1 BToV完整HE基因氨基酸序列進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the complete amino acid sequence of HE genes

選取GenBank中39條完整HE基因(包括GenBank中已有的21條BToVHE基因、本研究獲得的15條BToVHE基因、3條豬凸隆病毒(PToV)HE基因：AJ575363.1～AJ575365.1)進行重組分析，結果表明，本研究獲得的9條Ⅱ型HE基因存在重組事件，預測的重組位點和親本毒株與Smits等[26]的研究一致。同時6條基因Ⅲ型HE基因也鑒定出重組事件(RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq7種方法支持，得分為0.493)，重組區域位于105—1 083 bp，預測的主要親本毒株是Ⅰ型原型毒株AF076621.1，次要親本毒株是Ⅱ型毒株AB661461.1(圖2)。SimPlot 3.5.1也支持該重組事件；進一步分析顯示3個國外Ⅲ型毒株AJ575380.1、AJ575381.1、MG957145.1也具有相同的重組事件。

圖2 BToV-MW114525 HE基因重組分析Fig.2 Recombinant analysis the HE gene of BToV-MW114525

根據BToV HE蛋白晶體結構(SMTL ID：3i26.1)構建的三維模型表明，本研究獲得的6個Ⅲ型HE蛋白模型在238—240位點處的無規卷曲與其余國外Ⅲ型毒株有差別(圖3C)。由于所有Ⅲ型毒株在238位點(相比Ⅱ型毒株)存在1個氨基酸缺失，Ⅲ型毒株在238—240位點的無規卷曲均短于Ⅱ型毒株(圖3A、B)。

A.本研究中基因Ⅱ型毒株SC06；B.國外基因Ⅲ型毒株HT1(GenBank：MG957145.1)；C.本研究中基因Ⅲ型毒株HN01；藍色.凝集素結構域(R)；綠色.酯酶結構域(E)；紅色.膜近端結構域(MP)；虛線框內表示有改變的空間結構Predicted crystal structures of the BToV HE proteins from three strains:A.Genotype Ⅱ strain SC06 in this study;B.Genotype Ⅲ strain HT1 (GenBank accession No.MG957145.1);C.Genotype Ⅲ strain HN01 in this study.The domains are color-coded:lectin domain (R,blue);esterase domain (E,green);membrane-proximal domain (MP,red).The boxed portions of the structures indicate the different conformations of the same R domain of BToV strains圖3 基于BToV HE蛋白晶體結構(SMTL ID：3i26.1)構建的三維模型Fig.3 The 3D models constructed based on the crystal structure of BToV hemagglutinin-esterase (SMTL ID:3i26.1)

3 討 論

BToV是導致牛腹瀉的重要病原，主要引起犢牛腹瀉，同時也可引起成年牛腹瀉，造成嚴重的經濟損失[2,3,6,18,28]。BToV在我國屬于新發牛腹瀉病原，本實驗室前期報道了BToV在國內的存在和流行，均為基因Ⅱ型毒株[8]，繼獲得牦牛源BToV基因Ⅲ型基因組[29]后，本研究首次報道了基因Ⅲ型毒株在我國牛群中的存在，為了解國內BToV的遺傳多樣性提供了有用的信息。本試驗鑒定了Ⅲ型和Ⅱ型毒株的混合感染，這是首次觀察到BToV不同基因型混合感染現象，有助于進一步了解BToV的感染和流行特征。系統發育分析表明，本研究獲得的9條Ⅱ型毒株分為2個不同的分支(圖1)，不同分支上的毒株各自產生了獨特的氨基酸突變，顯示出國內基因Ⅱ型毒株具有遺傳多樣性。而6條Ⅲ型毒株則獨立聚為1支，顯示出Ⅲ型毒株在我國具有獨特的遺傳進化趨勢(圖1)。由于樣本數量有限，不同基因型毒株在我國的流行情況還需進一步調查。

BToV HE蛋白具有凝集素結構域(136—282aa)、酯酶結構域(21—135 aa、283—338 aa)和膜近端結構域(15—20 aa、339—384 aa)3個結構域[16-17]，其中，凝集素結構域介導病毒與宿主細胞的唾液酸結合，HE蛋白的238—240位點位于凝集素結構域空間結構的最外側，可能在病毒結合受體的過程中起著重要作用[16]。而酯酶結構域則發揮受體破壞酶活性，使病毒可逆性黏附唾液酸，幫助病毒逃避宿主的體液免疫[16-17]。與GneBank中僅有的國外3條Ⅲ型HE基因相比，本試驗獲得的6條Ⅲ型HE基因具有共同的2個氨基酸位點突變(E143A、S238T)位于HE蛋白的凝集素結構域[16-17]，特別238位氨基酸位點由絲氨酸突變為蘇氨酸引起238—240位點處的無規卷曲也發生了改變，這可能會影響病毒與宿主唾液酸的結合[16-17]。此外，獲得的6條Ⅲ型HE基因在酯酶結構域還有1個相同的氨基酸突變(V78A)，是否會影響病毒與唾液酸的可逆性黏附有待于進一步研究[16-17]。

相比Ⅰ型和Ⅱ型毒株，所有Ⅲ型毒株(包括本研究毒株)在凝集素結構域中存在2個獨特的氨基酸突變(G210D、L170V)，而該位點是形成結合受體的“疏水袋”關鍵位點[16-17]，這可能就會改變整個基因Ⅲ型BToV毒株與唾液酸受體的結合能力，進而影響病毒與宿主細胞的結合[16-17]。在酯酶結構域中，所有Ⅲ型毒株(包括本研究毒株)的2個位點產生了突變(R103H、Y294R)，由于該位點與HE蛋白結合唾液酸類型有關[16-17]，因此，這可能會改變基因Ⅲ型BToV毒株的唾液酸的結合類型，從而影響基因Ⅲ型BToV毒株的組織噬性。而相比Ⅰ型和Ⅲ型，所有Ⅱ型毒株(包括本研究毒株)則發生了1個氨基酸突變(L168F)，該位點也是形成結合受體的“疏水袋”關鍵位點[16-17]，可能會影響Ⅱ型BToV毒株與宿主細胞受體的結合能力。最早報道BToV的毒株均為Ⅰ型毒株[15,30]，但目前各國流行的卻是Ⅱ型和Ⅲ型毒株[3,8,27]，這種流行情況的改變可能與這些氨基酸突變有關，值得進一步調查。

Smits等[26]于2003年的研究顯示，基因Ⅱ型BToV毒株是由原型(Ⅰ型)毒株與PToV在HE基因的3′端發生重組而來，而Ⅲ型BToV毒株可能是Ⅱ型BToV毒株與一種未知的ToV在HE基因的中間區域發生重組而來。本研究預測的Ⅱ型毒株重組事件與先前研究結果一致[26]，但Ⅲ型毒株的重組事件所預測的親本毒株與先前研究結果不同[26]。本研究結果顯示，Ⅲ型毒株是由Ⅰ型毒株和Ⅱ型毒株重組而來，預測出的親本毒株為Ⅰ型毒株AF076621.1和Ⅱ型毒株AB661461.1，重組區域位于105—1 083 bp，并且GneBank中其余Ⅲ型毒株均具有相同重組事件。造成該重組分析結果不同的原因是本研究在做重組分析時加入了GneBank中近年新登錄的BToVHE基因序列。這種通過HE基因同源重組產生新基因型毒株可能是病毒在進化過程中逃避宿主免疫的一種策略[18-19,31]，這對進一步了解BToV的遺傳進化有重要意義。

4 結 論

本研究證實了基因Ⅲ型BToV在我國牛群中的存在，首次鑒定了BToV不同基因型毒株的混合感染，為國內牛腹瀉防控提供了參考。本研究獲得的6條Ⅲ型HE基因存在4個獨特的氨基酸突變，其中2個突變位點位于凝集素結構域，1個突變位點位于酯酶結構域，可能會影響病毒與受體的結合。重組分析顯示Ⅲ型BToV毒株可能是Ⅱ型BToV毒株與Ⅰ型BToV毒株重組而來，對進一步了解BToV的遺傳進化有重要意義。